Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metode til mus pancreasø Isolation og intracellulære cAMP Bestemmelse

Published: June 25, 2014 doi: 10.3791/50374
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Summary

Analysering in vitro β-celle funktion ved hjælp af isolerede mus Langerhanske øer er en vigtig komponent i studiet af diabetes patofysiologi og sygdomsbehandling. Mens mange downstream applikationer er tilgængelige, protokollen specifikt beskriver måling af intracellulær cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) som en væsentlig parameter, β-celle funktion.

Abstract

Ukontrolleret glykæmi er kendetegnende for diabetes mellitus og fremmer følgesygdomme såsom neuropati, nefropati og retinopati. Med den stigende forekomst af diabetes, både immun-medieret type 1 og fedme-linked type 2, undersøgelser med henblik på at afgrænse diabetes patofysiologi og terapeutiske mekanismer er af afgørende betydning. De β-cellerne i de Langerhanske øer af Langerhans er ansvarlige for passende udskillende insulin som respons på forhøjede glucosekoncentrationer. Betegnes Inkretinerne, som udskilles fra tarmen som reaktion på et måltid og handle på β-celle-receptorer, der øger produktionen af ​​intracellulær cyklisk adenosinmonophosphat (i tillæg til glucose og andre næringsstoffer, er β-celler stimuleret af specifikke hormoner, cAMP). Nedsat β-celle funktion, masse og inkretin reaktionsevne er godt forstået at bidrage til patofysiologien af ​​type 2-diabetes, og er også i stigende grad forbundet with type 1-diabetes. Den nuværende mus islet isolation og protokol cAMP beslutsomhed kan være et redskab til at hjælpe afgrænse mekanismer, der fremmer sygdomsprogression og terapeutiske indgreb, især dem, der er medieret af inkretinniveauer receptorer eller beslægtede receptorer, der virker gennem modulering af intracellulær cAMP produktion. Mens kun cAMP målinger vil blive beskrevet, og den beskrevne islet isolation protokol skaber en ren præparat, der også giver mulighed for mange andre downstream applikationer, herunder glucose insulinsekretion, [3H]-thymidin, protein overflod, og mRNA-ekspression.

Introduction

Den strenge vedligeholdelse af euglykæmi er bydende nødvendigt at forhindre følgesygdomme såsom neuropati, nefropati og retinopati, som alle er kendetegnende for patologien af ukontrolleret type 1 og 2 diabetes 1. Reduceret β-celle funktion og masse i både type 1 og 2 diabetes forstyrrer blodsukkerkoncentrationen 2. Betragtninger immun-medieret type 1-diabetes resultater fra en ødelæggende tab af insulin-producerende β-celler, nedsat β-celle insulinsekretion og perifer insulin signalering i type 2-diabetes sammen fremme hyperglykæmi, dyslipidæmi og øget hepatisk glukose produktion, hvilket i sidste ende resulterer i både tab af β-cellemasse og insulin sekretorisk kapacitet fra de enkelte β-celler 3. Forståelse af de underliggende β-celle-mekanismer i udviklingen af ​​type 1 og 2 diabetes vil forhåbentlig give anledning til hidtil ukendte terapier til forebyggelse og behandling af disse sygdomme.

In vitro tissue kultur modeller, såsom INS-1 og MIN6 udødeliggjort β-cellelinjer kan være nyttige redskaber til at forstå bestemte β-celle funktioner. Imidlertid kan vekselvirkninger mellem forskellige celletyper i ø selv regulerer β-celle funktion. For eksempel parakrin indflydelse glucagon (frigivet fra α-celler) og somatostatin (frigivet fra δ-celler) i stigende og faldende insulinsekretion henholdsvis viser betydningen af cell nærhed i det endokrine respons 4. Desuden gap junctions mellem β-celler potenserer frigivelsen af insulin 5.. Selv om fremskridt er gjort i at generere insulinom linjer, der bedre kopierede den fysiologiske reaktion af isolerede øer til glukose (f.eks INS-1-afledt 832/13 og 832/3 cellelinjer), deres glukose lydhørhed stadig adskiller sig fra normal rotte holme 6,7. Desuden reaktion af disse klonale insulinom cellelinjerat glucagon-lignende peptid-1 (GLP-1)-agonister kan variere drastisk fra hinanden samt fra normale øer 6. Derfor kan udødeliggjort cellelinjer repræsenterer ikke den bedste model for analyse agenter, der har indflydelse på cAMP produktion.

I modsætning til de insulinom-cellelinjer, studerer β-celle funktion udelukkende hele dyremodeller har sit eget sæt af komplikationer. En af de største udfordringer i arbejdet med endokrine væv måler den præcise koncentration af hormon frigivet. Specifikt spiller leveren en vigtig rolle metaboliserende insulin og bugspytkirtlen blodgennemstrømning går direkte til leveren. Således kan en plasma insulin måling ikke præcist skildre mængder insulin bliver udskilt fra bugspytkirtlen selv eller virkningen af forskellige behandlinger på hastigheden af insulinsekretion 8. Endvidere kan renale metabolisme af glukagon begrænser pålideligheden af glukagon output fra ø-α-celler 9. Derfor isolere primære mus holme til in vitro eksperimenter giver en mere præcis forståelse af, hvordan holmen reagerer på bestemte stimuli til at supplere målinger foretaget in vivo.

Den nuværende protokol til isolering af mus holme er en veletableret protokol, der bruges af en række grupper (med mindre ændringer, der kan bidrage til at øge succes) 10,11. Desuden bestemmelse af cAMP-produktion giver mulighed for en direkte udlæsning af inkretin reaktionsevne af β-celler. I forbindelse med cAMP-måling, proteinindhold og insulinsekretion kan også kvantificeres fra samme lejr prøve prep, hjælpe med at afgøre, om en defekt i β-celle funktion ligger proksimalt eller distalt til Camp 10. Det endelige cAMP indhold og insulinsekretion ansøgning i denne protokol kan være et meget stærkt værktøj til at forstå indflydelsen af ​​farmaceutiske og kosten bestanddele, blandt andets, om cAMP og insulinsekretion. Ud over stimulation fra glucose alene, kan andre forbindelser anvendes til at måle ændringer i cAMP og insulinsekretion 10,11.

Endelig, selv om insulin er den primære hormon vi analysere fra isolerede øer, andre hormoner, såsom glucagon og somatostatin, såvel som cytokiner, eicosanoider og cyklisk adenosinmonophosphat, kan også måles enten ved en forbigående stimulation assay eller ved kvantificering af niveauet i dyrkningsmedium 12. Endelig, selv uden for rammerne af dette manuskript, ø isolation med den beskrevne collagenase isolation metode giver mulighed for islet konservering så mange andre downstream-applikationer kan forfølges, såsom holmen transplantation, RNA isolation til kvantitativ real time PCR eller microarray analyser, protein isolation for Western blotting, islet indlejring og immunofluorescent billedbehandling og [3H]-thymidin som et mål for øcelle opformeringenkation, hvoraf nogle er blevet beskrevet i tidligere JOVÉ artikler 13-16. Samlet set kan efter holmen isolation, der er beskrevet i protokollen giver en forsker med vigtige og nyttige informationer for at udvikle behandlingsformer og fremme lægemiddelforskning til formål at forbedre β-celle funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. Protokollen demonstreres blev udført under vejledning og godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Wisconsin-Madison.

1.. Fremstilling af opløsninger

  1. Metoden til eutanasi i denne protokol er afblødning under Avertin anæstesi (for en gennemgang af alternativer, se diskussionen). For at gøre Avertin tilsættes 0,625 g (1,25% eller 44,2 mM) 2-2-2 tribromethanol til 1,25 ml 2-methyl-2-butanol i et 15 ml konisk rør og opvarmes ved 37 ° C i 20-30 minutter. Vortex løsning på høj i 10-15 sekunder ad gangen til fuldt ud at opløse 2-2-2 tribromethanol. Når det er fuldt opløst, tilsæt løsningen på 48,75 ml dobbelt destilleret H 2 O, filtreres gennem et 0,45 um filter ind i en ny 50 ml konisk rør, wrap de 50 ml koniskeal rør i aluminiumfolie og opbevares ved 4 ° C i op til en måned. Bring røret til stuetemperatur før injektion mus.
  2. For at gøre Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS), fyldes op 1 L 1x HBSS fra en 10x bestand (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) i dobbelt destilleret H 2 O, tilsættes 0,35 g (4,2 mM) nacho 3 og butik ved 4 ° C i op til 1 måned. For hver mus, vil 105 ml af denne opløsning (plus 5-10 ml ekstra for pipetteringsfejl) være nødvendig for islet isolation.
  3. Holme er meget modtagelige for hypoxisk skade; derfor er HBSS bobles med 95% O2 / 5% CO2 at efterligne koncentrationer af O2 i blodet. Særlige gasblandinger kan købes og en boblende station sat op med en Pasteur-pipette fastgjort til den fleksible slange. Efter boblende den nødvendige mængde HBSS med 95% O 2/5% CO 2 for 15 minutter, tilsættes 0,02% RIA klasse BSA (bovint serumalbumin) efter volumen og holde på is remainder af holmen isolation.
  4. For Ficoll forberedelse afvejes 32,5 g Ficoll i et 400 ml bægerglas, tilsættes 80 ml HBSS, og der omrøres ved 500-700 rpm i 30 min. Efter opløsning hæld Ficoll opløsning i en 250 ml måleglas og tilsæt HBSS til 130 ml mærket på måleglas at skabe en 25% Ficoll-opløsning. Dæk toppen af ​​måleglas med to portioner Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) og rystes kraftigt flere gange.
  5. For en 23%, 20,5% og 11% Ficoll-opløsning, tilsættes 27,6, 24,6 og 13,2 ml af 25% Ficoll, henholdsvis til 50 ml koniske rør. Derefter bringe hver løsning op til i alt 30 ml med HBSS og ryst godt at blande. Alle fire Ficoll opløsninger skal opbevares ved 4 ° C og er gode i op til 2 uger.
  6. Collagenase løsning, der er egnede til at isolere aktive øer fremstilles ud fra collagenase isoleret fra Clostridium histolyticum (Materials tabel). Hvert parti skal testes for enzym-effektivitet. Typisk kollagenase anvendes på 0,3-0,5 mg per ml HBSS. Ved hjælp af enzym koncentrationer i dette interval (normalt 3 forskellige koncentrationer), bestemme kvaliteten og mængden af ​​isolerede holme fra aldersmatchede mus eller søskende til sat arbejdsmiljøet enzymkoncentrationen.
  7. Når den korrekte koncentration bestemmes, hver mus kræver 35 ml collagenase i HBSS for hele isolation protokollen. Swirl collagenase i HBSS at opløse. Umiddelbart før operationen, pre-load en 5 ml sprøjte med collagenase opløsning og kanylen på og fjerne luftbobler og lade på is indtil brug.
  8. Holmen dyrkningsmedier til O / N inkubation er en suppleret RPMI 1640 medier. For stamopløsning opløses et RPMI 1640 pakke (Gibco, New York) i 1 L dobbelt destilleret H 2 O og tilføje 1,19 g HEPES (5 mm) og 2 g nacho 3 (24 mM). PH justeres til 7,4,Filtersteriliser, og opbevares ved 4 ° C i mørke.
  9. For suppleret medier, der tilsættes 10% FBS og 100 IU/100 ug / ml penicillin / streptomycin, henholdsvis bestanden RPMI 1640-medier. Hvis der ønskes en anden glucosekoncentration kan glucose-free RPMI 1640-medier anvendes, og en bestemt koncentration af glucose kan tilsættes.
  10. For en bestand Krebs Ringer bicarbonatpuffer (Krebs), tilsættes følgende ingredienser til dobbelt destilleret vand ved følgende koncentrationer: NaCl (118,41 mM), KCL (4,69 mM), MgSO 4 (1,18 mM), KH 2 PO 4 (1,18 mM ) NACHO 3 (25 mM), HEPES (5 mM) og CaCl2 (2,52 mM) ved pH 7,4. CaCl2 bør tilsættes til sidst, og denne opløsning kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
  11. For at gøre en arbejdende Krebs, første gas med 95% O 2/182 5% CO2 i 10-15 minutter med en Pasteur-pipette ved 37 ° C efterfulgt af tilsætning af 0,5% RIA Grade BSAaf volumen. Dernæst glucose tilsat til den ønskede koncentration til in vitro-assay.

2. Fremstilling af Værktøj

  1. Lidt stumpt tips af 30 - og 27-G nåle ved hjælp af en slibesten at afrunde skarpe punkt. Sæt en 45 graders bøjning i nålen omkring ¼ af en tomme fra spidsen ved hjælp af en tang. Være forsigtig med ikke at presse for hårdt, som vil lukke den indre diameter af nålen.
  2. Skær 3/0 silkesutur tråden ind i cirka 4 cm længder, én for hver mus.
  3. Dæk dissektionsmikroskop base med plastfolie og tape ned.
  4. Skær flere stykker af absorberende bænk papir, cirka 3 x 5 inches i størrelse, mindst 2 pr mus.

3.. Klargøring af Mouse

  1. Fyld en 1 ml sprøjte med 1 ml Avertin.
  2. Injicer avertin løsning intraperitonealt på omkring 40 ul / gram legemsvægt.
  3. Efter musen ikke longer reagerer på hale eller bagben pinches forsigtigt overføre det til dissektionsmikroskop arbejde station.
  4. Med musen i liggende stilling, og dens hoved vender distalt, spray mus med 70% vandig ethanol. Vær sikker på at bruge en passende mængde af 70% ethanol for at begrænse mængden af ​​pels i den udsatte brysthulen.

4.. Åbning af brysthulen

  1. Klem pels og hud af musen mellem de to bagben og foretage en indledende snit gennem epidermis, dermis og underliggende membran.
  2. Mens stadig klemme huden og det underliggende membran skæres mod den forreste ben på begge sider af musen sørger for at undgå at skære de indre organer.
  3. Fold huden og membranen flap over brystkassen og fjern formet som et sværd proces for at give lettere adgang til bugspytkirtlen for inflationen.
  4. Drej musen med hovedet vender proksimalt og flytte de indre organer mod højre side af arbejdet stning til at afsløre den nedadgående aorta.
  5. Medmindre blod væv der skal opsamles, kan aorta descendens skæres at fuldføre euthanization. Opsuge den overskydende blod med bænk papir eller en Kimwipe for lettere adgang til den fælles galdegang.

5.. Oppumpning bugspytkirtlen

  1. Med et dissektionsmikroskop, flytte tyndtarmen, så den fælles galdegang danner en lodret linje med lederen af ​​musen.
  2. Tag en pincet og gribe tyndtarmen og find sphincter Oddi (sphincter ampulla) ved afslutningen af ​​den fælles galdegang, der splays ud på tyndtarmen fra galdegang, danner en hvid trekant på den lyserøde tarmen. Når sphincter Oddi er blevet placeret, tage et # 5 Dumont pincet og skub spidsen under den fælles galdegang så tæt på tyndtarmen som muligt, og pas på ikke at gennembore kanalen.
  3. Efter piercing gennem tyndtarmen og bindevæv, skal du brugespidsen af ​​Dumont pincet til at gribe suturen og træk det i den fælles galdegang. Bind fra den fælles galdegang så tæt på sphincter Oddi som muligt at sørge for knuden er strakt for at forebygge lækage.
  4. Tag fat i begge ender af suturen og trække mod halen til at sætte en vis spænding på den fælles galdegang. Ved hjælp af en gratis hånd, lave et lille snit med mikro saks i den fælles galdegang lige over den sidste forgrening ind i leveren. Bemærk: Det er vigtigt ikke at skære for tæt på sphincter Oddi, da dette kan resultere i en delvis oppustning af bugspytkirtlen og undgå at skære gennem den fælles galdegang som det også vil resultere i en dårlig inflation.
  5. Mens du holder de to ender af strengen med den fælles galdegang stram, fjern sprøjten / kanyle, der er blevet præinstalleret med 5 ml collagenaseopløsning fra isen spand, fastsat sprøjten, og indsæt det stumpe 30 G nål ind i udskæringen fælles galdegang, og pas på ikke at gennembore gennem wall i kanalen. Hvis 30 G nål er ikke bred nok til galdegang at danne en forsegling omkring, fjerne det og erstatte med den stumpe 27 G kanyle.
  6. Mens du holder nålen på plads, slipper sutur og afhente 5 ml sprøjte. Langsomt trykkes stemplet af sprøjten. Bemærk: Hvis nålen er blevet indsat i den fælles galdegang, vil ekspandere.
  7. Fortsæt med at trykke stemplet langsomt og udlejning off på en pulserende måde, indtil den første del af bugspytkirtlen pustes, efterfulgt af blid konstant tryk, indtil bugspytkirtlen ikke længere pustes. Bemærk: De fleste pancreases hold 3-5 ml, før du begynder at lække. Desuden vil en vellykket inflation har jævn fordeling af eksokrine væv og den del af pancreas på toppen af ​​maven vil blive oppustet.
  8. Fjern kanylen fra den fælles galdegang og modregne til side.

6.. Pancreas Fjernelse

  1. Tag en pincet i den ene hånd og en krum saks iden anden. Ved hjælp af pincet fat i tyndtarmen på sphincter Oddi. Med lukket saks, bruge spidsen til særskilt del af bugspytkirtlen fra tyndtarmen.
  2. Spred saksen fra hinanden for at udvide kløften mellem tyndtarmen og bugspytkirtlen.
  3. Placer "V" i saksen, hvor tyndtarmen og bugspytkirtlen tillægger hinanden på højre side af den kløft, der var lige lavet. Brug pincet forsigtigt trække tyndtarmen forbi en saks til at fjerne bugspytkirtlen.
  4. Hold arbejder ned i tyndtarmen til den lyserøde bindevæv. På dette tidspunkt, afhente tyndtarmen i nærheden af ​​hvor det tillægger maven og snip bugspytkirtlen væk fra resten af ​​tyndtarmen. Bemærk: Pas på ikke at klippe bugspytkirtlen, da det kan begynde at punktere.
  5. Forsigtigt fat i en del af bugspytkirtlen, der er knyttet til maven med en pincet (flad pincet virker bedst). Mens du trækker op forsigtigt på bugspytkirtlen, bruge kurvend saks til at klippe væk på forbindelserne mellem bugspytkirtlen og mave.
  6. Find milten, og hold den med pincet over bugspytkirtlen. Tag krumme saks og klippe væk forbindelserne mellem milt og bugspytkirtel.
  7. Finde hvor bugspytkirtlen er fastgjort til tyktarmen. Saml tyktarmen med pincet og bruge spidsen af ​​en saks til at stikke igennem. Spred saks hinanden som før til at generere en kløft mellem tyktarmen og bugspytkirtlen.
  8. Hold op tyktarmen med en pincet: dette vil resultere i bugspytkirtlen falder væk, udsætter de præcise forbindelser til tyktarmen. Snip væk tilbageværende forbindelser.
  9. Find den lyserøde bindevæv fastgjort til bugspytkirtel og tyndtarm og skæres så tæt på bugspytkirtlen som muligt. Bemærk: Hvis piercing bugspytkirtlen er en bekymring, anbefales det at skære tættere tyndtarmen bindevævet vil blive filtreret ud i senere trin.
  10. Grab så meget i bugspytkirtlen som muligt og løft den forsigtigt. Med krum saks, skåret væk de resterende forbindelser mellem bugspytkirtlen og brysthulen til fuldt ud at fjerne bugspytkirtlen. Bemærk: De bugspytkirtlen skal stadig være oppumpet hvis fjernet korrekt.
  11. Opbevar de fjernede bugspytkirtlen i ~ 2,5 ml collagenase opløsning i et 50 ml konisk rør på is, indtil alle andre pancreases er blevet pustet op og fjernet til eksperimentet.

7.. Vask

  1. Tag alle isolerede bugspytkirtel og flytte dem til at adskille 50 ml koniske rør, der hver indeholder 25 ml frisk collagenaseopløsning
  2. Placer 50 ml koniske rør lodret i et 37 ° C rystevandbad i stand til oscillerende ved 220-250 rpm med shaker slukket.
  3. Gas hver 50 ml konisk rør med 95% O2 / 5% CO2 i 5 minutter med en Pasteur-pipette.
  4. Rekapitulere hvert rør stramt og placere sidelæns i ryste vandbad under overfladen af ​​vandet. Ryst ved 220-250 rpm i 20 sek, hvert andet minut, op til 16 min starter ved min 6. (Ryst på 6, 8, 10, 12, 14 og 16 min)
  5. Umiddelbart overføre rørene til en centrifuge ved stuetemperatur i en hurtig tur. Bring centrifugen op til 1.500 rpm (400-500 g) og slukke med det samme.
  6. Ved hjælp af et vakuum fælde, aspirat ca 22,5 ml af collagenaseopløsning uden at forstyrre bundfaldet. Vask med 10 ml HBSS og vortex forsigtigt for at bryde op pillen.
  7. Udfør en anden hurtig centrifugering ved stuetemperatur op til 1.500 rpm (400-500 g).
  8. Aspirer omkring 10 ml af opløsningen, igen uden at forstyrre bundfaldet.
  9. Vask med yderligere 10 ml iskold HBSS og vortex forsigtigt til igen at bryde op pillen. Gentag de hurtige spin og aspirer 10 ml af opløsningen.
  10. Forsigtigt vortex pelleten i de resterende 2,5 ml HBSS opløsning. Hæld opløsningen gennemen 1.000 um mesh ind i en ny 50 ml konisk rør. Dette vil fjerne den store væv vragrester ikke fordøjet af collagenase.
  11. Skyl gamle 50 ml konisk rør med 2,5 ml iskold HBSS. Anvend en Pasteur-pipette for at skylle de sider af røret grundigt, før overførsel af 2,5 ml HBSS gennem masken i de nye 50 ml konisk rør.
  12. Foretag en hurtig tur ved stuetemperatur ved 1500 rpm (400-500 g) for at pelletere vævet.
  13. Aspirer alle HBSS ved at vippe røret mod vakuum fælde. Bemærk: Det er meget vigtigt ikke at forstyrre pellet da dette vil resultere i tab af holme. Hvis pelleten er løst eller begynder at bevæge sig mod vakuum på ydersiden, stoppe aspirering opløsningen og re-pelletere vævet og derefter fortsætte med at aspirere den resterende opløsning.
  14. Når alle HBSS er blevet fjernet, tilsættes 4,8 ml 25% Ficoll-opløsning og vortex at bryde op pellet.
  15. Forsigtigt lag 2.4 ml 23% Ficoll opløsning oven på 25% Ficoll opløsning ved tilsætning af 23% Ficoll løsning på den side af 50 ml konisk rør. For at sikre endnu lagdeling, rotere 50 ml konisk rør ved tilsætning af Ficoll løsningen.
  16. Gentag lagdeling proces til 20,5% og derefter 11% Ficoll løsninger. Bemærk: Hvis der 4 forskellige lag ikke er til stede, tilsættes HBSS op til 50 ml mærket og vend røret 4-6 gange, eller indtil der ikke længere eksisterer Ficoll gradient. Re-pelletere væv og prøv trin 7,14-7,16.
  17. Spin 50 ml konisk rør ved stuetemperatur ved 1.820 rpm (800 g) i 15 min.
  18. Hæld alt Ficoll i en frisk 50 ml konisk rør, idet man forlader pellet af exokrine væv bag. Tilføj iskold HBSS op til 50 ml mærket og vend røret 4-6 gange for at blande Ficoll og HBSS sammen.
  19. Spin 50 ml konisk rør ved stuetemperatur ved 1.820 rpm (800 g) i 5 min.
  20. Aspirere forsigtigt meste af HBSS / Ficoll blandingen under anvendelse af en vakuum-tras.. Forstyr ikke pillen som den er løs og kan indåndes nemt.
  21. Tag en Pasteur-pipette og overføre pillen en engangs kultur rør.

8.. Picking Islets

  1. Der tilsættes 5 ml plukke medier (dvs.. Suppleret RPMI 1640 eller Krebs Ringer bicarbonatbuffer) til den disponible kultur røret. Bemærk: De plukke medier vil variere afhængigt af downstream-applikationer.
  2. Lad øer afregne til bunden af ​​kulturen røret i 5 min. Overfør dem ved hjælp af en Pasteur-pipette til et 15 mm med 60 mm Polystyren petriskål. Bemærk: Det er vigtigt at bruge en petriskål, da disse ikke bliver behandlet, og vil forhindre holme i at klæbe til skålen.
  3. I en separat 15 mm med 60 mm polystyren petriskål, tilsættes 5 ml muse-holm dyrkningsmedier (100 ml RPMI 1640 Stock Medier, 10 ml varmeinaktiveret FBS, 1 ml Pen / Strep, filter steriliseret).
  4. Med hjælp fra en dissektionsmikroskop med backlight kapacitet, skal du bruge en P-20 pipette til at plukke holme i petriskål indeholdende holm kultur medier, idet man undgå at overføre acinært væv vragrester. Når baggrundsbelyst vil holme vises brunlig-guld, og deres ydre membran kan funkle, mens acinære væv vises lys gråt og kedeligt. Hvis præparatet holm indeholder en stor mængde af snavs, er det tilrådeligt at håndplukke holme to gange i frisk medium. Reduktion forurening vragrester vil begrænse islet sammenklumpning efter inkubering natten over. Tilføjelse DNAse (3000 U / ml) til fordøjelsen buffer kan også hjælpe til at begrænse islet sammenklumpning (JWJ, personlig observation). Bemærk: Det er vigtigt at tælle antallet af holme isolerede til at planlægge for downstream eksperimenter.
  5. Inkubér øer O / N i en inkubator indstillet til 37 ° C med 5% CO2.

9.. CAMP Assay

  1. Mærk 1,7 ml mikrocentrifugerør, én for hver gentagelse af assayet. Bemærk: cAMP assays skal have mindst duplicates for hver behandlingsgruppe tilstand, men flere gentagelser per behandling foretrækkes.
  2. Efter gasning Krebs Ringer bicarbonatpuffer i 15 minutter med 95% O2 / 5% CO 2 med Pasteur pipette 0,5% RIA Grade BSA og en endelig glucosekoncentration på 1,7 mM (præinkubation opløsning). Derefter tilsættes 1 ml af frisk gasset Krebs i hvert mikrofugerør. To ml Krebs er påkrævet per rør til præinkuberingen og behandling tidspunkter; men det anbefales at forberede sig mindst 5-10 ml ekstra.
  3. Swirl holme til midten af ​​petriskålen, og ved hjælp af en P-20 pipette håndplukke holme til en ny 15 mm med 60 mm polystyren petriskål indeholdende 5 ml præinkuberingen løsning til at vaske glucoseholdigt dyrkningsmedium fra holme.
  4. CAMP assaykittet anvendes, er GE Healthcare cAMP Direct BioTrak VVM. Den prococol anvendes, er en modifikation af den, der er beskrevet for "Intracellulær cAMP foranstaltmålingsbestemmelserne ved hjælp af ikke-acetylering VVM-procedure med romanen lysereagenser ", og er blevet optimeret til brug med det mindste antal øer pr rør, så øget antallet af behandlingsmuligheder og tekniske gentagelser. Ved hjælp af en P-20 pipette mindst 13 holme i hvert rør fra trin 9.2, vedligeholdelse islet størrelse sammenhæng mellem rør med 1 ml forinkubering buffer. Bemærk: At øge antallet af gentagelser er mere fordelagtig end antallet af øer pr rør. Men hvis der er nok holme at øge antallet af øer pr rør jævnt, er det tilrådeligt at gøre det, op til 25-50 holme pr rør.
  5. Med mikrofugerøret caps åben, overførsel til en 37 ° C inkubator sat til 5% CO 2 og inkuberes i 45 min for at normalisere insulinsekretion af alle holme til en baseline-niveau.
  6. Mens prøverne inkubere, forberede de behandlinger (dvs. 8 mm, 11,1 mm, 16,7 mM glucose, etc.) i gasset Krebs frabout trin 9.2. i 15 ml koniske rør, med 1 ml ekstra til at redegøre for enhver pipetteringsfejl. Der tilsættes 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) til en slutkoncentration på 200 uM. IBMX er en generel phosphodiesteraseinhibitor der blokerer nedbrydningen af ​​cAMP, så cAMP at ophobe sig i cellen, som det er produceret. (Bemærk:.. Dette er en sand cAMP produktion assay Se diskussionen sektion for tilfælde, hvor måling cAMP produktion kan ikke være ønskeligt, hvis IBMX er udeladt af analysen, vil flere holme kræves per rør for at opnå cAMP af data i lineære område af standardkurven).
  7. Efter 45 min præinkuberingen, fjern mikrocentrifugerør fra rugemaskinen, cap og puls-vortex hver prøve (mindre end 0,5 sek.) Dette er for at blande insulin forløb, er sandsynligvis genereret som følge af øerne bliver koncentreret i bunden af ​​røret. Man skal være forsigtig ikke at Vortex for hårdt, da dette kan have en negativ indflydelse holmen stabilitet (Bemærk: renteloftrør med øer kan forsigtigt flicked eller omvendt, hvis det ikke er muligt at puls-vortex forsigtigt. Disse muligheder vil føje tid til analysen, som bør overvejes, når planlægningen af ​​forsøget).
  8. Overfør hvert rør til en bordplade centrifuge (RT) og spinde indtil holme nå 10.000 rpm (7,000-7500 g) og derefter slukke med det samme.
  9. Brug en P-1000 pipette til at fjerne det meste af Krebs i hvert mikrofugerør, mens omkring 10-15 pi Krebs på ø pellet. Brug en P-20 pipette til at fjerne den del nærmest holmen pellet. Hvis pillen bliver forstyrret, pipette Krebs tilbage ind i røret og re-spin.
    (Bemærk: Hvis forsøgslederen finder det for svært at fjerne alle Krebs fra holmen pille uden at forstyrre den, kan den sidste 10-15 ul stå på og tegnede sig for i det totale volumen senere i protokollen.
  10. Anskaf en passende mængde af flydende nitrogen i en isoleret beholder til snap fryse prøverne efter inkubation.
  11. Tag prøverne ud af kuvøsen, cap, vortex hurtigt (mindre end 0,5 sek) dreje mikrocentrifugerør i en bordplade centrifuge (RT) op til 10.000 rpm (7,000-7500 g), og derefter lukke øjeblikkeligt. Hvis insulin eller anden metabolit er en ønsket nedstrøms ansøgning, skal du bruge en P-1000 pipette til at indsamle en portion af medie i et mikrofugerør og opbevares ved -20 ° C indtil yderligere analyse. Hvis stimulation medier ikke bliver indsamlet, kan det kasseres.
    (Bemærk: IBMX er en stærk forstærker af glucose-stimuleret insulinsekretion (GSIS) Derfor kan GSIS resultaterne fra Camp stimulation medium ikke præcist repræsentere den sande effekt af specifikke behandlinger GSIS, især hvis disse virkninger er subtile.).
  12. Gentag trin 9.9 at fjerne så meget stimulation medium som muligt uden at forstyrre holmen pellet. Snap fryse holmen pellet i flydende nitrogen, når der er mindre end 10-15 pi Krebs tilbage på holmen pellet. Når alleprøverne er blevet snap frosne, opbevares ved -80 ° C indtil cAMP måling.
  13. På dagen for cAMP beslutsomhed, forberede nye lysereagenser ifølge producenternes protokol. Tilsæt 200 ml lysis reagens 1B i hvert mikrofugerør og vortex ved tophastighed i 30 sek. Lad rørene sidde på is i 10 min, vortexing hver 2 min 30 sek. (Bemærk: Protokollen anbefaler at udføre en mikroskopisk analyse med trypanblåt for at sikre cellelyse, men dette er ikke udført for øer).
  14. Forbered arbejdsforholdene standarderne og oprette VVM mikropladen præcis som beskrevet i producentens protokol. Efter enzymsubstrat er blevet inkuberet med mikropladen i 30 minutter, udføre den valgfrie 1,0 M svovlsyre skridt, og opløsningens absorbans mikropladematerialet ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
  15. Cyklisk AMP resultater vil blive registreret som fmol / godt. Dette bør normaliseret til den samlede mængde af den oprindelige prøve (200 pl + evtresterende Krebs tilbage på holmene fra trin 9.9). Dernæst kan resultatet enten blive normaliseret til det samlede antal af holme, der giver fmol cAMP produceret / holm, eller lysatprøver kan underkastes bicinchoninsyre (BCA) proteinassay at normalisere resultaterne totalt cellulært protein (giver fmol / ug protein) . Sidstnævnte anbefales, når ø-størrelser er inkonsekvent mellem prøverne, og kan være et surrogat for ø størrelse. Pierce BCA proteinassay kit har været brugt med succes i denne protokol, og kræver kun 25 ml af prøven. BSA standarder bør udarbejdes i lysis reagens 1B fra lejren assay kit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at sikre en høj ø udbytte i isolation, skal kirurgiske teknikker er skitseret i protokollen følges nøje. Selvom de teknikker, der præsenteres her vil blive skræddersyet til hvert laboratorium, der er et par vigtige skridt, der vil føre til en vellykket isolation. For at den fælles galdegang let tilgængelige, anbefales det, at de organer, der skal forskydes mod højre side af mus (figur 1). Desuden vil dette give bugspytkirtlen til at puste med en mindre mængde af modstand, da der vil være mindre vægt begrænser ekspansion. Et andet afgørende skridt til at maksimere ø udbytte er ligering af den fælles galdegang tæt på sphincter Oddi (figur 2A-C). Ligering længere væk fra sphincter Oddi kan resultere i en delvis inflation ved at reducere mængden af ​​collagenase opløsning ind i større pancreas kanalen. Desuden vil en stram knude forhindrer collagenaseopløsning ind i tarmen.

<p class = "jove_content"> En ordentlig indsnit i den fælles galdegang bør være placeret langt nok væk fra forgreningen fra leveren, men tæt nok til maksimal pancreas inflation (figur 3). Et snit foretaget for tæt på forgreningen kan føre til strømmen af ​​collagenaseopløsning i leveren. Når collagenaseopløsning ind i leveren, vil den miste sin mørke-rød farve og begynder at dreje hvidlige. Hvis dette sker, fjernes kanylen og prøv et andet kanylering længere fra leveren. Desuden bør den fælles galdegang indsnit kun delvis gennem den kanal (ca. 50%). Helt forskydning kanalen vil gøre det vanskeligt at tætne kanalen omkring nålespidsen. En korrekt snit vil resultere i fuldstændig lukning af kanalen omkring nålen, producerer nok tryk til både fylde fælles galde og pancreatiske gange (figur 4A). Det er også vigtigt at sikre, at nålen er indgået den fælles galdegang og ikke den omgivende kappe.Når nålen er indsat korrekt, bør 5 ml collagenase opløsning position bugspytkirtlen, hvilket skaber en marbleized væv.

Bugspytkirtlen fjernelse proces bør udføres forsigtigt for at fremme maksimal ø udbytte (figur 5). Piercing bugspytkirtlen kan det resultere i en deflation og tab af collagenase opløsning, hvilket reducerer ø udbytte. Skæring bugspytkirtlen tæt på bindevæv og andre organer vil forhindre deflation. Også høst andre væv, såsom bindevæv, sammen med bugspytkirtlen er ikke et problem, da det vil blive fjernet i efterfølgende trin. En korrekt fjernet bugspytkirtlen vil forblive oppumpet efter udskæring før yderligere collagenasefordøjelse (figur 6).

Forskellige lag i Ficoll-gradient vil føre til en ren ø forberedelse og skabe en lettere miljø til plukning øer (fig. 7). Gradienten sikrer adskillelse af holme fracellerester og bindevæv, der er tilbage efter fordøjelse og mesh sigte filtrering. Desuden er dette trin er afgørende for valg af rene, sunde holme for downstream-applikationer. Konkret vil sunde holme være kugleformet og har en gylden brun til mørk brun centrum (figur 8). Bemærk: Islets fra diabetiske mus vil være meget blegere i farven, svarende med nedsat indhold insulin og kan være bedre skelnes fra acinære væv ved deres form, glans, og deres synlige netværk af kapillærer. Eventuelle holme tilsluttet acinære væv må ikke anvendes og skal kasseres. Desuden bør store øer, der udvikler en mørk, nekrotisk centrum efter inkubering natten kasseres, da de ikke fungerer ordentligt.

Som beskrevet i indledningen, cAMP-produktion er en vigtig komponent i β-celle-funktion; især med hensyn til virkningen af ​​inkretin. En fordel med den protokol, der er beskrevet i dette opfyldt tode er, at man samtidig kan få cAMP produktion og glucose-stimuleret insulinsekretion data. Typisk virkningen af en agent på cAMP produktion direkte korrelerer med dens indvirkning på insulinsekretion 17.. For simple eksperimenter denne regel gælder ganske godt (se figur 9 for et eksempel). I den nuværende protokol, vi bruger IBMX (en phosphodiesterase inhibitor) i vores behandlinger for at forhindre katabolisme af cAMP, hvilket giver den samlede produktion af cAMP.

Figur 1
Figur 1. Fortrænge indre organer. Positionering de indre organer til højre side af musen skaber et lettere arbejdsmiljø og tillader bugspytkirtlen plads til at udvide under oppustning.

Figur 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
Figur 2. Binde off sphincter Oddi (AC). Afbildet her er indgangen til den fælles galdegang til tyndtarmen på sphincter Oddi. Binde fra den fælles galdegang i sphincter Oddi forhindrer collagenaseopløsning trænge ind i tarmene.

Figur 3
Figur 3.. Fælles galdegang snit. Det er bedst at lave et snit i den fælles galdegang lidt distalt for forgreningen ind i leveren for at forhindre strømmen af collagenaseopløsning ind i leveren.

0374/50374fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig4.jpg "/>
Figur 4.. Kanylerings af den fælles galdegang med en stump 30 G kanyle og bugspytkirtel inflation. A) 30 G nål indsat i den fælles galdegang, hvilket skaber en tætning omkring nålespidsen. Det er vigtigt at kontrollere og at bemærke, at nålen er blevet indsat i den fælles galdegang og ikke den omgivende kappe. En korrekt isat kanyle vil have en uigennemsigtig fremtoning. B) En korrekt bugspytkirtel inflation vil fylde med omkring 3-5 ml collagenaseopløsning og har et marmoreret udseende.

Figur 5
Figur 5.. Fjernelsen af bugspytkirtlen. A) Den første snit med en krum saks opstår i nærheden af sphincter Oddi. Den oprindelige removale begynder i retning af maven være omhyggelig med ikke at punktere bugspytkirtlen. B) Det sidste trin er at fjerne bugspytkirtlen fra bindevævet på tyndtarmen og de ​​sidste par forbindelser til bughulen.

Figur 6
Fig. 6. De oppustede bugspytkirtlen. En vellykket bugspytkirtel fjernelse vil give en bugspytkirtlen perfunderet med collagenase opløsning. Dårlig excision vil efterlade en mindre, deflateret bugspytkirtlen.

Figur 7
Figur 7. Fire lag af Ficoll-gradient. De fire forskellige lag udgør en different Ficoll densitet fra 25% i bunden til 11% på toppen. Den tydelige lagdeling er bydende nødvendigt at fjerne snavs og eksokrine ude af brug fra holme.

Figur 8
Figur 8.. Islet udvælgelse. Sunde holme tendens til at have en gylden brun til mørk brun farve med en rund sfærisk form og er ikke forbundet til acinært væv. Efter inkubering natten over (16-20 timer) et nekrotisk centrum udvikler sig i større holme, der bør udelukkes fra eksperimenter.

Figur 9
Figur 9.. Repræsentative cAMP produktionsresultater af høj kvalitet, som viser, at udskilt insuli kan måles fra lejren stimulation medium. A) Isolerede øer fra vildtype-eller gen-knockout-mus blev stimuleret med 11,1 mM glucose og intracellulære cAMP-produktion blev målt, og normaliseret til det totale cellulære protein. B) Udskilt insulin blev målt ved anvendelse af en standard ELISA-insulin og også normaliseret til totalt cellulært protein. I mange tilfælde ændringen i cAMP-produktion korrelerer direkte med forstærkning i glucose insulinsekretion. n = 3 for hver gruppe; *, P <0,05. Dette tal blev tilpasset fra forskning offentliggjort i Kimple et al 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med udbredelsen af diabetes forventes at påvirke 7,7% af verdens befolkning, er kravet om nye forskning teknikker er afgørende for både at forstå og behandle diabetes 18.. Den nuværende holm isolation er en veletableret protokol, der bruges til in vitro-eksperimenter og er blevet præsenteret tidligere med små modifikationer 11,14,16. Selvom insulinsekretion er en fælles nedstrøms ansøgning om isolerede holme, med fokus på upstream bestanddele, såsom cAMP, kan hjælpe med at afgrænse mekanismer forstærkende insulin produktion og sekretion.

Valget af eutanasi skal ske med omtanke for at sikre både human behandling af forsøgsdyr samt integriteten af ​​eksperimentelle målinger. For islet isolation afblødning under bedøvelse er vores foretrukne fremgangsmåde til eutanasi som det giver ø perfusion med iltet blod til den maksimale mængde tid inden bugspytkirtleninflation. CO 2-inhalation er et dårligt valg for eutanasi, som om den er udført i henhold til humane protokoller, udsætter øerne til dårligt iltet blod i mindst 5-6 minutter før proceduren kan begynde. Cervikal dislokation uden bedøvelse kunne være en acceptabel metode med videnskabelig begrundelse, men det vil kræve en betydelig erfaring med både metoden til eutanasi og musen dissektion og bugspytkirtel inflation procedure med henblik på at sikre en human død og bevarelse af ø-funktion. Ved valget afblødning under bedøvelse, Avertin er det foretrukne bedøvelsesmiddel i denne protokol. Det særlige valg af Avertin er, at det er et hurtigt virkende og dyb bedøvelse med mange fordele i forhold til andre almindeligt anvendte anæstetika. For det første er Avertin ikke spile vasculature og inducere nitrogenoxid udgivelse, som gør isofluran 19. Pancreasøer er stærkt vaskulariseret, og dermed deres biologi kan blive negativt påvirket af isofluran exposure. For det andet mener Avertin ikke overdrevent hæve blodsukkerniveauet i fravær af glucose injektion, som kan ketamin / xylazin, som har vist sig at øge blodsukkeret ved 167% op til en time efter injektion 20. Endelig det terapeutiske område for pentobarbital er meget smal i mus 21, hvilket øger chancen for hypoxisk beskadigelse af holme.

I den nuværende protokol, er brugen af ​​suturtråd at ligere den fælles galdegang nær sphincter Oddi udnyttes som et alternativ til en hemostat. Tråden metode giver mulighed for større manøvredygtighed i den fælles galdegang og hjælper position nålen for kanyle. , Brug af tråden under dette trin forudsætter dog holde to objekter (tråd-og sprøjte) hvorimod arterieklemmen tillader en fri hånd til at hjælpe med at placere galdegang. Begge isolationsteknikker giver et tilsvarende antal og levedygtige holme som vist med tidligere arbejde i vores laboratorium, og andre 10,22. Desuden kanylering needle størrelse, placering og vinkel vil afhænge af brugerens ønske. Konkret er en 30 G kanyle, der bruges i denne protokol, men kan kræves andre størrelser baseret på stamme eller genetisk baggrund. For eksempel BTBR mus har en meget sprødt fælles galdegang og en større sporvidde, kan give en større tætning omkring nålespidsen (MEK, personlige observationer). Således anbefales det at have stumpe kanyle nåle af forskellige størrelser på hånden under operationen, klar til at skifte ud, hvis nødvendigt. Positionen af ​​nålen i den fælles galdegang vil også i høj grad indflydelse holmen udbytte. Hvis nålen er placeret foran tvedeling af den fælles galdegang vil collagenaseopløsning ind i leveren og resultere i en dårlig inflation. Hvis kanylen er placeret for tæt på sphincter Oddi, vil en delvis pancreas inflation forekomme, at reducere antallet af isolerede øer. Trial pancreas inflationer med forskellige pindenr og steder på den fælles galdegang bliver vandskravenerød for at tilpasse den nuværende procedure og maksimere islet udbytte.

Et andet vigtigt element i denne procedure til at øge antallet af levedygtige øer er at forberede alle reagenser som pr protokoller anvisninger. Gasning bufferne med 95% O 2/5% CO 2 for at øge iltningen kan en faktor i holmen overlevelse i hele protokollen. Tidligere arbejde viser, at oxygenkoncentrationen falder mod det indre af den lille ø, potentielt reducere indholdet af β-celler 23 energi. Dette kan være synlige efter en inkubation natten over som en mørk, nekrotisk center vises i dyrkede holme, korrelere med et fald i in vitro lydhørhed. Således vil give ilt nok bidrage til at øge islet nummer og levedygtighed under isolation og ind i natten, normoxisk inkubation proces. Ydermere, korrekt forberedelse af collagenaseopløsning forbedre fordøjelsen af ​​pancreas væv og befri than holme fra omgivende væv. Hvis collagenasen koncentrationen er for lav, vil ikke kun holmen udbyttet være lav, men exocrine acinært væv kan forblive fastgjort til holme, negativ indvirkning downstream applikationer. På den anden side kan en for høj koncentration collagenase ødelægge øer. Derfor vil ordentlig kvalitetskontrol for at sikre, collagenasefordøjelse effektivitet uden ødelæggelse af holme fremme større udbytter.

Collagenase isoleret fra Clostridium histolyticum er det enzym, der anvendes til at frigøre holme fra bugspytkirtlen væv i denne protokol. Den irreproducibility af enzymatisk aktivitet mellem forskellige partier af collagenase har potentialet til at hindre mængde og / eller kvalitet af isolerede holme. I den nuværende protokol, hvert nyt parti collagenase enzym går gennem en intern kontrol kvalitetskontrol for at bestemme både mængden og funktionaliteten af ​​holme, før de er underlagt for at studere. Derfor downstrEAM applikationer og meget variation skal overvejes, når du vælger et enzym til holm isolation. Liberase ® (Roche), en oprenset kollagenase blanding, er en anden fordøjelsesenzymet alternativ, som har været en succes i mange tilfælde; især i at opnå større mængder isolerede holme 24,25. Dog kan brugen af Liberase ikke være gavnligt for at isolere funktionelle holme, da det kan hindre in vitro-funktion 26.

Der findes mange begrænsninger i de nuværende islet isolation og cAMP bestemmelse procedurer, der kan hindre efterfølgende anvendelser. Som tidligere nævnt, BTBR mus har en meget skrøbelig fælles galdegang, hvilket øger vanskeligheden af ​​pancreas inflation og efterfølgende islet isolation. Derfor kan det være nødvendigt at samle ø præparater fra flere mus, da mange in vitro-assays, herunder den beskrevne cAMP assay kræver mange øer pr måleglas. Derudover hjælp IBMX i cAMP-assayet bloks phosphodiesterase aktivitet, hvilket giver en udlæsning af cAMP produktion. Tilsætning af IBMX kan ikke være tilrådeligt i tilfælde, hvor det er vigtigt for cellulær signalering cykling af cAMP produktion og nedbrydning. Men at fjerne IBMX fra denne protokol sænker markant endelige cAMP indholdet af de holme, der gør tilsætningen af ​​mange flere holme pr måleglas for at opnå meningsfulde cAMP værdier i VVM.

Den nuværende protokol er et vigtigt redskab for en holm biologi laboratorium eller der er interesseret i det endokrine pancreas. CAMP komponent til denne protokol er blot en af mange i vitro forsøg at forstå, hvordan ø-manipulation gennem forskellige behandlinger kan forbedre eller stumpe insulinsekretion. Selv om de fleste forskning udnytte holme fokuserer primært på β-celle insulinsekretion, kan andre celletyper vurderes for deres dynamiske relationer i holmen 4.. I kombination med andre in vitro og jegn vivo modeller vil islet eksperimenter belyse mekanismerne bag ødelæggende pancreas sygdomme såsom diabetes og insulinomer. Vigtigst er det, vil forstå, hvordan farmaceutiske agenter direkte indflydelse holme forbedre effektiviteten af behandling og støtte i oversættelsen til en in vivo model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Renee L. Pasker og Harpreet K. Brar for ekspert teknisk bistand på de protokoller, der er beskrevet i dette arbejde. Desuden vil vi gerne anerkende mentoring af Christopher B. Newgard ved Duke University og Alan D. Attie ved University of Wisconsin-Madison, sammen med støtte fra deres laboratorium medlemmer, som tilladt os tid og støtte nødvendigt at optimere beskrevne protokoller. I særdeleshed, vi takker Hans Hohmeier, Danhong Lu, og Helena Winfield i Newgard Laboratory og Mary Rabaglia i Attie laboratorium for produktive diskussioner og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud DK080845 og Juvenile Diabetes 594
Research Foundation tilskud 17-2011-608 (til MEK)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets Sigma-Aldrich C7657
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X Invitrogen (Gibco) 14065-056
HEPES Sigma-Aldrich H3375
RPMI 1640 (powder) Invitrogen (Gibco) 31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7888
3/0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-30
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
0.8 mm Forceps   Fine Science Tools 11050-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15003-08
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe BD 309646
1 ml BD syringe BD 309628
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
27 G BD Needle 1/2" Length BD 305109
Sharpening Stone Fine Science Tools 29008-01
2-2-2-tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-25G
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) Sigma-Aldrich S6014
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M9397
Penicillin-Streptomycin Invitrogen (Gibco) 15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) Fisher Scientific SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich 5879-100MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Tags

Fysiologi islet isolation insulinsekretion β-celle diabetes cAMP-produktion mus
Metode til mus pancreasø Isolation og intracellulære cAMP Bestemmelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuman, J. C., Truchan, N. A.,… More

Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination. J. Vis. Exp. (88), e50374, doi:10.3791/50374 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter