マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Summary

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。

Abstract

制御されていない血糖は糖尿病の特徴であると神経障害、腎症、網膜症などの合併症とを促進する。糖尿病、免疫介在性の両方のタイプ1と肥満-結合型2の有病率の増加とともに、糖尿病の病態生理と治療メカニズムの輪郭を描くことを目的とした研究は極めて重要である。膵臓のランゲルハンス島のβ細胞は、適当に上昇した血中グルコース濃度に応答してインスリンを分泌する責任がある。グルコースなどの栄養素に加えて、β-細胞は、（特定のホルモンによって刺激され、食事に応答して腸から分泌されるインクレチンと称される、細胞内環状アデノシン一リン酸の産生を増加させるβ-細胞受容体に作用しているcAMP）の。 2型糖尿病の病態生理に寄与することがよく理解され、また、ますますw iをリンクされているβ-細胞機能、質量、およびインクレチン応答性の低下第1型糖尿病。現在のマウスの膵島分離とcAMP測定プロトコルは、疾患の進行および治療的介入、細胞内cAMP産生の調節を介して作用する受容体をインクレチン受容体によって媒介されるかまたは関連していることを特にを促進メカニズムを描写するのに役立つツールとなります。唯一のcAMP測定は説明するが、説明した膵島単離プロトコールはまた、グルコースを含む他の多くの下 ​​流の適用を可能にするクリーンな製剤を作成し、インスリン分泌を刺激し、[3 ^H] -チミジン取り込み、タンパク質存在量及びmRNA発現。

Introduction

正常血糖の厳格な維持管理は、すべて制御されていない1型および2型糖尿病¹の病態の特徴である、このような神経障害、腎症、および網膜症など合併症を予防することが不可欠です。 1型および2型糖尿病の両方において低減β-細胞機能及び質量は、血中グルコース濃度^を摂動^2。一方、インスリン産生β細胞、2型糖尿病におけるシグナル伝達が損なわβ細胞のインスリン分泌と末梢インスリンの壊滅的な損失から免疫介在1型糖尿病の結果は一緒に高血糖を促進し、脂質異常症、そして最終的には、その結果、肝臓のグルコース産生を増加個々のβ細胞³からβ細胞量およびインスリン分泌能力の喪失の両方。 1型および2型糖尿病の進行の根底にあるβ細胞のメカニズムを理解することは、うまくいけば、これらの病気を予防し、治療する新しい治療法を生じさせる。

インビトロ TI 中例えば、INS-1およびMIN6としてssue培養モデルは、β-不死化細胞株、特定のβ-細胞機能を理解するための有用なツールであることができる。しかしながら、膵島内の異なる細胞型間の相互作用は、それ自体、β-細胞機能を調節し得る。例えば、グルカゴンのパラクリン影響は（α-細胞から放出）およびインスリン分泌を増加させ、減少におけるソマトスタチン（δ-細胞から放出された）、それぞれ、内分泌応答し⁴のセル、セルの近接の重要性を示している。また、β-細胞間のギャップ結合は、インスリン⁵のリリースを増強する。ストライドが良い（ 例えば 、INS-1由来の13分の832及び3分の832細胞株）をグルコースに単離された膵島の生理学的応答をレプリケートインスリノーマ線を生成する際になされているが、さらに、それらのグルコース応答性は依然として正常ラットとは異なる小島^6,7。さらに、これらのクローンインスリノーマ細胞系の応答グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アゴニストは、互いに、ならびに正常膵島⁶から大幅に異なることができる。従って、不死化細胞株は、エージェントにcAMP産生に与える影響を分析するための最良のモデルを表していない場合があります。

インスリノーマ由来細胞株とは対照的に、全動物モ​​デルにおいてのみβ-細胞機能を研究する合併症の独自のセットを提供する。内分泌組織での作業中の最大の課題の1つは、リリースされホルモンの正確な濃度を測定している。具体的には、肝臓は、インスリンの代謝の主要な役割を果たし、膵臓血流は、肝臓へ直接進む。従って、血漿インスリン測定を正確膵臓自体またはインスリン分泌速度⁸上の異なる治療の影響から分泌されるインスリンの量を描くなくてもよい。さらに、グルカゴンの腎代謝は膵島α細胞からのグルカゴンの出力の信頼性を制限する可能性がある⁹。したがって、in vitroの実験のために、一次マウス膵島を単離する膵島は、生体内で行われた測定を補完するために特定の刺激に応答しているかをより正確に把握することができます。

マウス膵島を分離するために、本 ​​プロトコルは、（成功を高めるために役立つことが若干の修正を加えた）グループの数^10,11で使用される十分に確立されたプロトコルです。また、cAMP産生の決定は、β細胞のインクレチン応答性の直接の読み出しが可能になります。 cAMPの測定、タンパク質含有量およびインスリン分泌に関連しても、β細胞機能に欠陥のcAMP ¹⁰に対して近位または遠位にあるかどうかを決定するのに役立つ、同一のcAMPサンプル調製から定量することができる。このプロトコルの最後のcAMP量およびインスリン分泌アプリケーションは、他の中で、医薬品や栄養成分の影響を理解するための非常に強力なツールになりますS、cAMPおよびインスリン分泌に対する。グルコースのみからの刺激に加えて、他の化合物は、cAMPおよびインスリン分泌^10,11の変化を測定するために使用することができる。

インスリンは、我々は孤立した島、グルカゴンおよびソマトスタチンのような他のホルモン、だけでなく、サイトカイン、エイコサノイド、および環状アデノシン一リン酸から検定する主要なホルモンであるが、最終的には、過渡刺激アッセイにより、またはの定量化のいずれかによって測定することができる培養液¹²中のそれらのレベル。他の多くの下流のアプリケーションが、膵島移植、PCRまたはマイクロアレイ分析、定量的リアルタイムためのRNAの単離、タンパク質として、追求され得るように、最終的に、記載コラゲナーゼ単離方法では、本稿の範囲外の膵島単離膵島の保存を可能にするもののウェスタンブロッティング、膵島埋め込み、免疫蛍光イメージング、膵島細胞REPLIの尺度としての[3 H] - チミジン取り込みの分離以前のJoveの記事^13〜16に記載されており、そのうちのいくつかの陽イオン、。全体的に、プロトコルに記載膵島単離方法を次の治療法を開発し、β細胞の機能を高めることを目的とした薬剤の発見を促進するための重要かつ有用な情報を研究者に提供することができる。

Protocol

すべての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局を遵守して実施された。実証されているプロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）の指導と承認の下で行われた。

ソリューションの1。準備

1. このプロトコルでの安楽死の方法は、（代替案の検討のため、説明を参照）アベルチン麻酔下で放血です。アベルチンを作るために、20〜30分、37℃で15ミリリットルコニカルチューブと熱で2 - メチル-2 - ブタノールの1.25ミリリットルに2-2-2トリブロモエタノールの0.625グラム（1.25％または44.2 mm）を追加します。完全に2-2-2トリブロモエタノールを溶解するための時間で10〜15秒のための高上に溶液をボルテックスする。一度完全に溶解、円錐50ミリリットルをラップ、新しい50ミリリットルコニカルチューブに0.45μmのフィルターでろ過する、二重蒸留H ₂ Oの48.75ミリリットルにソリューションを追加最大1ヶ月間、4℃でアルミホイルや店舗のAlチューブ。マウスに注射する前に、RTにチューブを持参してください。
2. 、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を作る二重蒸留H ₂ O中で10倍の株式（Gibco社、ライフ·テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア州）から、1L 1X HBSSを構成する、0.35グラム（4.2ミリモル）ナチョ_3、およびストアを追加するには最大1ヶ月間4℃で。各マウスについては、この溶液105ミリリットル（プラス誤差をピペットするための余分な5〜10ミリリットル）を、膵島単離のために必要とされる。
3. 膵島は低酸素障害に大変影響を受けやすい。従って、HBSSは血液中のO ₂濃度を模倣するために、95％O _{2/5％CO 2}でバブリングする。特殊なガスミックスは購入することができバブリングステーションがフレキシブルチューブに付着したパスツールピペットを用いて設定します。 15分間、95％O _{2/5％CO 2}でHBSSの必要量をバブリングしたのち、体積0.02％RIAグレードBSA（ウシ血清アルブミン）を追加およびr氷上に保つ膵島単離のemainder。
4. フィコール調製のために、HBSSの80ミリリットルを加え、400ミリリットルのビーカー内のFicollの32.5グラムを秤量し、30分間500〜700 rpmで撹拌する。溶解後、メスシリンダー、25％フィコールソリューションを作成するためにメスシリンダーに130ミリリットルマークにHBSSを追加250ミリリットルにフィコール液を注ぐ。パラフィルム®M（PECHINEYプラスチック包装会社、イリノイ州シカゴ）の2つの部分にメスシリンダーの上部をカバーし、積極的に数回振る。
5. 50mlコニカルチューブに、それぞれ、23％、20.5％、及び11％フィコール溶液については、24.6を27.6を追加し、25％フィコール13.2ミリリットル。その後、HBSSで30ミリリットルの合計に対する各ソリューションを起動してミックスするよく振って。すべて4フィコールソリューションは、4℃で保存し、2週間までに適していなければならない。
6. アクティブな膵島を単離するのに適したコラゲナーゼ溶液から単離され、クロストリジウムコラゲナーゼから調製されるhistolyticUM（材料表）。各ロットは、酵素の効率について試験される必要がある。一般的には、コラゲナーゼをHBSS mlあたり0.3〜0.5ミリグラムで使用されています。その範囲内の酵素濃度（通常は3種の異なる濃度）を利用し、作業酵素濃度を設定するために年齢をマッチさせたマウス又は同腹仔から分離膵島の質と量を決定する。
7. 正確な濃度が決定されると、各マウスは、全体の分離プロトコルのHBSS中コラゲナーゼの35ミリリットルが必要です。溶解させるために、HBSSでコラゲナーゼを旋回。すぐに手術前に、コラゲナーゼ溶液で5ミリリットルの注射器を事前にロードするにカニューレを配置し、気泡を除去し、必要になるまで氷上で残す。
8. O / Nインキュベーションのための膵島培養培地を補充したRPMI 1640培地である。ストック溶液の場合は、二重_蒸留水1Lに1、RPMI 1640パケット（Gibco社、ニューヨーク）を溶解し、1.19グラムのHEPES（5 mM）および2グラムナチョ_3（24 mm）を追加します。 pHを7.4に調整し、フィルタは、殺菌し、暗闇の中で、4℃で保存する。
9. 添加した培地では、株式のRPMI 1640培地に、それぞれ、10％FBSおよび100 IU/100μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンを追加します。異なるグルコース濃度が所望される場合、グルコースを含まないRPMI 1640培地を用いてもよく、特定の濃度のグルコースを添加してもよい。
10. 塩化ナトリウム（118.41 mm）と塩化カリウム（4.69ミリモル）、 _硫酸マグネシウム（1.18ミリモル）、KH ₂ PO _4（1.18 MM：株価クレブスリンガー重炭酸塩緩衝液（クレブス）の場合は、以下の濃度で蒸留水を倍にするには、以下の成分を追加）、pH7.4でナチョ_3（25 mM）を、HEPES（5ミリモル）、およびCaCl _2（2.52ミリモル）。 CaCl _2を最後に添加されるべきであり、この溶液は2週間まで4℃で保存することができる。
11. クレブス、0.5％RIAグレードBSAを添加し、続いて37℃でパスツールピペットで10〜15分間、95％O 182分の_{2、5％CO 2}を有する第一のガスの作業用ストックを作るために体積。次いで、グルコースは、in vitroアッセイのための所望の濃度まで添加する。

ツールの2。準備

1. 鋭いポイントを丸めるようにシャープ石を使用し、27 G針 - わずか30の先端を鈍らせる。プライヤーを使用して、先端から1インチの4分の1程度の針に45度曲げを置く。針の内径を閉じるであろう、あまりにもハード圧迫しないように注意してください。
2. 約4インチの長さ、各マウスの1に3/0絹縫合糸をカットします。
3. ダウンラップ、テープで解剖顕微鏡ベースをカバーしています。
4. マウスあたり少なくとも2用の吸収ベンチ紙、大きさが約3×5インチのいくつかの部分をカット。

3。マウスの準備

1. 1ミリリットルアベルチンで1ミリリットルの注射器を埋める。
2. 体重の約40μL/グラムで腹腔内アベルチンソリューションを注入する。
3. マウス番号Lの後炎神は慎重に解剖顕微鏡のワークステーションに転送し、尻尾や後足ピンチに応答します。
4. 遠位側に面した仰臥位とその頭の中でマウスを使って、70％エタノール水溶液でマウスをスプレーします。公開さ胸腔内毛皮の量を制限する70％エタノールを適量使用してください。

4。胸腔開く

1. 2後ろ足の間に、マウスの毛や皮膚をつまんで、表皮、真皮とその下の膜を通って最初のカットを行う。
2. まだ皮膚とその下の膜をつまんながら、マウスが任意の内臓を切らないように注意しながら両側の前肢に向かってカット。
3. 胸郭上の皮膚と膜フラップを折り、インフレのため、膵臓へのより容易なアクセスを可能にするために剣状突起を除去します。
4. 頭が近位に向けて、マウスの向きを変えると仕事STの右手側に内臓を移動下行大動脈を明らかにATION。
5. 血液組織を収集することがない限り、下行大動脈は、安楽死を完了するために切断することができる。総胆管へのアクセスを容易にするためのベンチ紙やキムワイプで過剰な血液を吸い取る。

5。膵臓を膨張させる

1. 総胆管は、マウスの頭部に垂直な線を形成するように解剖顕微鏡を使用すると、小腸の位置を変更。
2. 鉗子を取ると小腸を把握し、ピンク色の腸の白い三角形を形成し、胆管からの小腸に出splays総胆管の最後にオッディ括約筋（膨大部の括約筋）を見つける。オッディ括約筋が配置されると、＃5デュモンの鉗子を取り、可能な限り、小腸に近い総胆管の下にチップをスライドさせ、ダクトに穴を開けないように注意しながら。
3. 小腸および結合組織を貫通した後、使用縫合糸をつかみ、総胆管の下でそれを引っ張ってデュモン鉗子の先端。結び目が漏洩を防止するピンと張っていることを確認しながら、可能な限りオッディ括約筋の近くに総胆管を縛る。
4. 縫合糸の両端をつかみ、総胆管に何らかの緊張を置くために、尾の方に引っ張る。フリーハンドを使用して、ちょうど肝臓への最後の分岐上の総胆管の微小ハサミで小さな切開を行います。注：これは、膵臓の部分的なインフレにつながる可能性としてオッディ括約筋に近すぎるをカットし、それはまた、貧しい人々のインフレになりますように総胆管を切断しないようではないことが重要です。
5. ピンと張った総胆管と弦の両端を押さえながら、注射器を下に置くアイスバケットから5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液であらかじめロードされている注射器/カニューレを削除し、カットに平滑化30gの針を挿入総胆管、WAを貫通しないように注意してダクトのLL。 30 Gの針が周りにシールを形成するために、胆管用の十分な広さでない場合は、それを削除して平滑化27 Gの針を交換してください。
6. 所定の位置に針を保持した状態で、縫合糸を解放し、5ミリリットルの注射器を拾う。ゆっくりとシリンジのプランジャーを押し下げる。注：ニードルが正常に総胆管に挿入された場合には、拡大する。
7. ゆっくりプランジャーを押し下げ続けると、膵臓の最初の部分は、膵臓まで、静かに一定の圧力はもはや膨張が続き、膨張するまで、脈動的にオフさせる。注：ほとんどの膵臓をリークし始める前に3〜5ミリリットルを開催しています。また、成功したインフレ率は外分泌組織の均一な分布を持つことになりますし、お腹の上に、膵臓の一部を膨張させます。
8. 総胆管から針を外し、側にオフに設定します。

6。膵臓の取り外し

1. 片手に鉗子や湾曲ハサミを取るその他。鉗子を使用して、オッディ括約筋の小腸を把握する。ハサミを閉じた状態で、小腸からの膵臓の別の部分にチップを使用しています。
2. 小腸および膵臓の間のギャップを広げるために離れてはさみを広げた。
3. 小腸および膵臓だけで作られたギャップの右側で互いに付着するはさみの「V」を配置します。鉗子を使用すると、静かに膵臓を削除するためにハサミを過ぎて小腸を引き出します。
4. ピンクの結合組織に小腸を下に働き続ける。この時点では、それが胃に付着する場所の近くに小腸をピックアップし、離れて小腸の残りの部分からの膵臓を切り取る。注：それが収縮し始める可能性がある膵臓を切り取るないように注意してください。
5. 優しく鉗子（フラット鉗子は最高の仕事）と胃に付着膵臓の一部をつかむ。膵臓を軽く引き上げながら、カーブを使用膵臓と胃の間の接続で離れ中略するDハサミ。
6. 脾臓の位置を確認し、膵臓上記鉗子でそれを保持する。湾曲したハサミを取り、脾臓と膵臓の間の接続を切り取る。
7. 膵臓が大腸に付着している見つける。ピンセットで大腸をピックアップし、を通して突くハサミの先端を使用しています。大腸と膵臓との間のギャップを生成する前に離れてはさみを広げた。
8. 鉗子で大腸を保持：これは、膵臓が大腸にその正確な接続を公開、脱落が発生します。残りの接続を離れて切り取る。
9. 膵臓と小腸に付着しピンク色の結合組織を見つけて、可能な限り、膵臓の近くにカット。注意：膵臓ピアスが懸念される場合には、それは結合組織は、後のステップで除外されるように、小腸に近いカットすることをお勧めします。
10. Gできるだけ膵臓の多くとRABは静かに持ち上げます。湾曲したハサミで、完全に膵臓を削除するために、膵臓と胸腔間の残りの接続を切り取る。注：正しく削除された場合、膵臓はまだ膨張させる必要があります。
11. 他のすべての膵臓が膨張し、実験のために除去されるまで、氷上で50ミリリットルコニカルチューブ中のコラゲナーゼ溶液の〜2.5ミリリットル中に取り出し、膵臓に保管してください。

7。洗浄

1. すべての孤立膵臓を取り、それぞれが新鮮なコラゲナーゼ溶液25mlを含む50ミリリットルのコニカルチューブを分離するためにそれらを移動
2. シェーカーの電源を切った状態で、220〜250 rpmで振動が可能な水浴を振って、37℃で直立50ミリリットルの円錐管を配置します。
3. 95％O _2/5のパスツールピペットで5分間％のCO _2をそれぞれ50mlコニカルチューブから気体。
4. しっかりと各チューブをおさらいし、振とう水浴中で横向きに配置します水面下に入浴。 20秒間220〜250 rpmで振とうする、他のすべての分、分6から始まる、最大16分（6、8、10、12、14振とう、および16分）
5. すぐにクイックスピン室温で遠心分離機にチューブを移す。 1,500 RPM（400〜500グラム）に遠心分離機を起動し、すぐにオフにしてください。
6. 真空トラップ、吸引ペレットを乱すことなく、コラゲナーゼ溶液約22.5ミリリットルを使用した。ペレットを分割する優しく10ミリリットルのHBSSとボルテックスで洗浄する。
7. 1,500 RPM（400〜500グラム）まで室温でさらに迅速なスピンを実行します。
8. 再びペレットを乱すことなく、溶液の吸引除去を約10ミリリットル、。
9. 再びペレットを分割する優しく氷冷HBSS渦の別の10ミリリットルで洗浄する。ソリューションの迅速なスピンと吸引10ミリリットルを繰り返します。
10. 優しくHBSS溶液の残りの2.5ミリリットルでペレットをボルテックスする。に溶液を注ぐ千程度は、新しい50ミリリットルコニカルチューブにメッシュ。これは、コラゲナーゼによって消化されない大きな組織片を除去します。
11. 氷冷HBSSの2.5ミリリットル古い50ミリリットルコニカルチューブを洗浄します。徹底的に新しい50ミリリットルコニカルチューブにメッシュのHBSS 2.5ミリリットルを転送する前に、チューブの側面をすすぐためにパスツールピペットを使用してください。
12. 組織をペレット化を1,500 rpm（400〜500グラム）で室温でさらに迅速なスピンを実行します。
13. 真空トラップに向かってチューブを傾けてHBSSのすべてを吸引除去する。注：これは膵島の損失をもたらすようにペレットを乱さないことが非常に重要である。ペレットが緩んでいるか、真空トラップに向かって移動を開始する場合は、ソリューションを吸引を停止し、組織を再ペレット化した後、残った溶液を吸引し続けています。
14. 一度にすべてのHBSSペレットを分割する25％Ficol液や渦の4.8ミリリットルを加え、削除されました。
15. 2の2.4ミリリットルを慎重にレイヤ50ミリリットルコニカルチューブの側面に23％のFicoll溶液を添加して25％のFicoll液の上に3％のフィコールソリューション。フィコール溶液を添加した場合であっても階層化を保証するために、50ミリリットルコニカルチューブを回転させます。
16. 20.5％のための階層化プロセスを繰り返した後、11％のFicollソリューションを提供しています。注：4の異なる層が存在しない場合は、50ミリリットルマークまでHBSSを追加し、フィコール勾配が存在しなくなった4〜6回まで、またはチューブを反転させる。組織を再ペレット化し、ステップ7.14から7.16を再試行してください。
17. 15分間1,820 rpmで（800 g）でRTで50 mLコニカルチューブをスピン。
18. 背後の外分泌組織のペレットを残すように注意しながら、新鮮な50ミリリットルコニカルチューブにフィコールのすべてを注ぐ。 50ミリリットルマークまで氷冷HBSSを追加し、一緒にフィコールとHBSSを混在させるチューブを4-6回転倒。
19. 5分間1,820 rpmで（800 g）でRTで50 mLコニカルチューブをスピン。
20. 慎重に真空TRAを使用して、HBSS /フィコール混合物の大部分を吸引P。それが緩んで、容易に吸引することができるようにペレットを乱さないようにしてください。
21. パスツールピペットを取り、使い捨て培養チューブにペレットを移す。

8。島をピッキング

1. 使い捨て培養管にピッキングメディアの5ミリリットル（ すなわち 。補充した1640またはクレブスリンガー重炭酸緩衝液）を追加します。注意：ピッキングメディアがダウンストリームのアプリケーションによって異なります。
2. 膵島は、5分間の培養チューブの底に沈降しましょう​​。 60ミリメートルポリスチレンペトリ皿によって15ミリメートルにパスツールピペットを用いて転送します。注：これは、これらが治療されず、皿に付着する膵島を防止するように、ペトリ皿を使用することが重要である。
3. （;濾過滅菌100ミリリットルのRPMI 1640株式·メディア、10ミリリットル熱不活性化FBS、1ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシン）60ミリメートルポリスチレンシャーレで区切り15ミリメートルでは、マウスの膵島培養培地の5ミリリットルを追加。
4. backligと解剖顕微鏡の支援を受けてhtの能力は、腺房組織破片を転送しないように注意しながら、膵島培養培地を含むペトリ皿に膵島を選択するP-20ピペットを使用。ときはバックライト付き腺房組織はライトグレーとくすんで見えますが、島は、茶色がかった金とその外膜が輝くことが表示されます。膵島調製物は破片が大量に含まれている場合は、新鮮な培地中に二回島を手で選ぶことをお勧めします。デブリ汚染を減少させることは、一晩のインキュベーション後に膵島凝集を制限する。消化緩衝液にDNA分解酵素（3,000 U / ml）を追加すると、膵島凝集（JWJ、個人観察）を制限するために役立つことがあります。注意：これは、下流の実験を計画する分離膵島の数をカウントすることが重要です。
5. 5％CO ₂で37℃に設定したインキュベーターで、膵島のO / Nインキュベートする。

図9のcAMPアッセイ

1. 1.7ミリリットルマイクロチューブ、アッセイの各複製のための1にラベルを付けます。注意：cAMPアッセイは、少なくともドゥが必要ですそれぞれの処理条件におけるplicatesが、治療ごとに複数の反復が好ましい。
2. パスツールピペットで95％O _{2/5％CO 2}で15分間、クレブスリンガー重炭酸塩緩衝液をガス処理した後、0.5％RIAグレードBSAおよび1.7mMの（プレインキュベーション溶液）の最終グルコース濃度を加える。次に、各マイクロチューブに新鮮にガス処刑クレブスの1ミリリットルを加える。クレブス2mlのプレインキュベーションは、処理時間点に対してチューブあたり必要とされる;しかしそれは、余分な、少なくとも5〜10ミリリットル用意することをお勧めします。
3. ペトリ皿の中央に島を旋回し、P-20ピペットを用いて、グルコース含有培地を洗浄するプレインキュベーション溶液5mlを含有するの60mmのポリスチレンペトリ皿新品15mmの膵島を手で選ぶ小島から。
4. 使用cAMPアッセイキットはGEヘルスケアのcAMPの直接バイオトラックEIAです。使用prococolは「細胞内のcAMPの測定のため記載したものの変形であるurementは、新規な溶解試薬と非アセチル化EIA手順を使用して "及び処理条件及び技術的反復数の増加を可能にする、チューブ当たりの膵島数の最小値で使用するために最適化されている。 P-20ピペットを用いて、工程9.2から各チューブ内に少なくとも13の膵島を転送1mlのプレインキュベーション緩衝液で、管の間の膵島サイズの一貫性を維持する。注：繰り返しの数を増やすと、チューブあたり島の数よりも有益である。均等にチューブあたり島の数を増やすための十分な小島がある場合は、それがチューブあたり25〜50の小島まで、そうすることをお勧めします。
5. 微量遠心チューブの蓋を開いた状態で、5％CO ₂に設定した37℃のインキュベーターに移し、45分間のベースラインレベルへのすべての膵島のインスリン分泌を正常化するためにインキュベートする。
6. サンプルがインキュベートされていますが、ガスを供給したクレブスFRでの治療（ すなわち 8ミリモル、11.1ミリモル、16.7 mMグルコースなど）を準備するOMステップ9.2。 15ミリリットルコニカルチューブ内の、任意のピペッティング誤差を考慮するための余分な1ミリリットルと。 200μMの最終濃度の3 - イソブチル-1 - メチルキサンチン（IBMX）を追加します。 IBMXブロックcAMPの分解は、それが生成されるcAMPは、細胞内に蓄積することを可能にする一般的なホスホジエステラーゼ阻害剤である。 （注：これは、真のcAMP産生アッセイでcAMP産生を測定することは望ましくないことがあるとき、インスタンスのための議論を参照してくださいIBMXは、アッセイから除外されている場合は、より多くの島は中のcAMPのデータを得るために、チューブごとに必要となります。標準曲線の直線範囲）。
7. 45分間のプレインキュベーションの後、インキュベーター、キャップとパルス渦各サンプル（0.5秒未満）からマイクロチューブを取り外します。これは可能性が高いため、チューブの底に集中している小島に生成されたインスリン勾配を混合することである。頂いた：これは否定的に膵島安定性（注に影響を与える可能性があるとして注意を、あまりにも厳しくボルテックスしないように注意しなければならない膵島を有するチューブを穏やかにフリックするか、穏やかに渦をパルスすることができない場合に反転させてもよい。これらのオプションは、実験を計画する際に考慮されるべきアッセイ）までの時間が追加されます。
8. 島が万回転（7,000-7500 G）に達するまで、テーブルトップ遠心機（RT）とスピンに各チューブを転送し、すぐにオフにしてください。
9. 小島ペレットにクレブスの約10〜15μLを残して、各マイクロチューブにクレブスのほとんどを除去するために、P-1000ピペットを使用してください。最も近い部分膵島ペレットを除去するために、P-20ピペットを使用してください。ペレットを乱された場合、ピペットクレブスバックチューブおよび再スピンに。
   （注：実験者が、それはあまりにも難しいことを妨げることなく、膵島ペレットからクレブスをすべて削除すると認める場合には、最後の10から15μlをオンのままにし、後でプロトコル総容量を占めたことがあります。
10. インキュベーション後にサンプルを凍結スナップする断熱容器内の液体窒素の十分な量を得る。
11. すぐに保育器、キャップ、渦からサンプルを採取し（0.5秒未満）を10,000 rpm（7,000-7500グラム）までのテーブルトップ遠心機（RT）にマイクロチューブを回転してから、すぐに遮断してください。インスリンまたは他の代謝物が必要な下流のアプリケーションである場合には、さらなる分析まで-20℃でマイクロチューブや店舗内の媒体の一定分量を収集するために、P-1000ピペットを使用しています。刺激培地が収集されていない場合は、廃棄することができる。
    （注：IBMXはグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）の強力な増強であるため、cAMP刺激媒体から取得したGSISの結果は正確にこれらの効果が微妙な場合は特に、GSIS上の特定の治療法の真の効果を表していない場合があります）。
12. 膵島ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの刺激培地を除去するためのステップ9.9を繰り返します。クレブス未満10から15μlを膵島ペレットに残ってがしたら、スナップ、液体窒素中で膵島ペレットを凍結する。すべての回サンプルは、cAMPの測定まで-80℃で凍結し、店をスナップしている。
13. cAMP測定の日に、製造者のプロトコルによる新規溶解試薬を準備します。 30秒間最高速度で、各マイクロチューブと渦に200ミリリットルの溶解試薬1Bを追加します。チューブは30秒ごとに2分をボルテックス、氷上で10分間放置します。 （注：プロトコルは、細胞溶解を確実にするためにトリパンブルーで顕微鏡分析を実施することをお勧めしますが、これは小島のために実行されません）。
14. 作業標準を準備し、製造業者のプロトコルに記載されているとおりに、EIAマイクロプレートを設置。酵素基質は、30分間、マイクロプレートと共にインキュベートした後、任意の1.0 M硫酸工程を実行し、マイクロプレートリーダーを用いて450nmでマイクロプレートウェルの吸光度を決定する。
15. サイクリックAMP結果のfmol /ウェルとして記録されます。これは、元のサンプル（200μL+任意の全量を正規化する必要があります残留クレブス）は、ステップ9.9からの小島に残された。次に、結果は、いずれかのfmolのcAMPは/膵島を生成し、又は溶解物サンプルは（フェムトモル/μgタンパク質を与える）全細胞タンパク質に結果を正規化するビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイに供することができる与え、膵島の総数を正規化することができる。後者は、膵島サイズはサンプル間の一貫性がある場合に推奨され、膵島の大きさのための代理することができます。ピアースBCAタンパク質アッセイキットは、このプロトコルでの成功を収めて使用され、サンプルのわずか25ミリリットルを必要とされています。 BSA標準は、cAMPアッセイキットからの溶解試薬1Bに準備する必要があります。

Representative Results

単離の間、高膵島収量を確保するために、プロトコルに概要の外科技術は、密接に従うべきである。ここで紹介するテクニックは、各研究室に合わせて調整することになるが、成功した分離につながるいくつかの重要なステップがあります。総胆管は簡単にアクセスできるようにするためには、臓器をマウスの右側（ 図1）に変位することをお勧めします。さらに、この拡張を制限する小さな重みが存在するので、膵臓は抵抗の少ない量で膨張することを可能にする。膵島収量を最大化するために、別の重要なステップは、オッディ括約筋（ 図2A-C）に近い総胆管結紮である。さらに離れるオッディ括約筋からライゲートする主要な膵管に入るコラゲナーゼ溶液の量を減少させることによって、部分的膨張をもたらし得る。また、ピンと張った結び目は、腸に入るのコラゲナーゼ溶液を防ぐことができます。

<Pクラスは、= "jove_content">総胆管への適切な切開を離れて、肝臓からの分岐点が、最大膵臓インフレのために十分に近い（ 図3）から十分に配置する必要があります。分岐部に近すぎる切開は、肝臓へのコラゲナーゼ溶液の流れを導くことができる。コラゲナーゼ溶液が肝臓に入ると、それはその暗赤色を失い、白っぽく点灯を開始します。この問題が発生した場合は、針を取り外し、肝臓からさらに別のカニュレーションを試してみてください。さらに、総胆管切開は、ダクト（約50％）を介して一部の方法でなければなりません。完全にダクトをせん断することは、困難な針の先端の周りのダクトを密封するために行います。適切な切開は総胆と膵管（ 図4a）を満たすのに十分な圧力の両方を生産する、針の周りのダクトの完全閉鎖になります。これは、針が総胆管ではなく、周囲の鞘に入っていることも重要である。針が適切に挿入された後、コラゲナーゼ溶液5mlをmarbleized組織の作成、膵臓を記入すべきである。

膵臓除去プロセスは、最大の膵島収量（ 図5）を促進するために微妙に行われるべきである。膵臓を貫通すると、膵島収量を減少させる、コラゲナーゼ溶液の収縮および損失をもたらし得る。結合組織および他の臓器に近い膵臓を切断してデフレを防ぐことができます。それは、その後の工程で除去されるように、また、膵臓と一緒に、このような結合組織などの他の組織を採取することは、問題ではありません。適切に削除膵臓は前にさらにコラゲナーゼ消化（ 図6）に切除した後に膨張させたままになります。

フィコール勾配の異なる層は、クリーンな膵島の準備につながり、島を選ぶためのより容易な環境（ 図7）を作成します。勾配はからの膵島の分離を保証します消化とメッシュスクリーンのフィルタリング後に残る細胞破片と結合組織。さらに、このステップでは、ダウンストリームアプリケーションのために、クリーンで健康的な島を選択するための非常に重要です。具体的には、健康的な島は球形であることと、暗褐色の中心（ 図8）に黄金色になります。注意：糖尿病マウスからの膵島が減少インスリン含量に対応する、色が非常に青白くなり、その形状、光沢、および毛細血管の彼らの目に見えるネットワークにより腺房組織から良く区別することができる。腺房組織に接続された任意の膵島は使用すべきではないと廃棄されるべきである。彼らが正常に機能しないようにまた、一晩インキュベートした後、暗い、壊死性の中心を開発する大きな島は、廃棄されるべきである。

導入部で述べたように、cAMP産生はβ細胞機能の重要な成分であり;インクレチンの作用に関しては、特に。この中で説明されたプロトコルへの一つの利点は、会った HODひとつ同時にcAMP産生およびグルコース刺激性インスリン分泌データを取得することができることである。一般的には、cAMP産生に対する薬剤の影響は、直接インスリン分泌¹⁷への影響と相関している。単純な実験のために、このルールは、（例えば、 図9を参照）かなりよく当てはまる。この議定書では、cAMPの総生産量を与えて、cAMPの異化を防ぐために、私たちの治療にIBMX（ホスホジエステラーゼ阻害剤）を使用します。

図1。内臓を変位さ。マウスの右側に内臓を位置決めが容易になり、作業環境が作成され、膵臓の部屋は、インフレ時に拡張することができます。

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図2。オッディ括約筋（AC）をオフに結び付ける。ここに示しているがオッディ括約筋の小腸への総胆管の入り口である。オッディ括約筋で総胆管をオフに接続すると、腸に入るのコラゲナーゼ溶液を防ぐことができます。

図3。総胆管切開。それは肝臓にコラゲナーゼ溶液の流れを防止するために、肝臓への分岐部にわずかに遠位総胆管での切断を行うのがベストです。

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図4。平滑化30gの針と膵臓インフレによる総胆管カニューレ挿入。 A）30 G針が針の先端の周りにシールを作成し、総胆管に挿入される。それはチェックし、針が総胆管ではなく、周囲のシース内に挿入された注目することが重要である。適切に挿入された針は、不透明な外観を持つことになります。B）適切な膵臓のインフレ率は約3〜5ミリリットルコラゲナーゼ溶液ので記入し、大理石の外観を持つことになります。

図5。膵臓の除去。 A）はさみの湾曲したペアで作られた最初の切開はオッディ括約筋の近くで発生します。初期REM楕円形は、膵臓に穴を開けないように注意して胃の方向に開始されます。B）最後のステップは、小腸や腹膜腔への最後のいくつかの接続での結合組織から膵臓を削除しています。

図6。膨張した膵臓。成功した膵臓の除去はコラゲナーゼ溶液で灌流膵臓が得られます。貧しい切除が小さく、収縮した膵臓を残す。

図7。フィコール勾配の4層。4つの別個の層は差動でを表す上部の一番下に25パーセントから11パーセントまでのTフィコール密度。明確なレイヤリングは小島から破片や外分泌廃用を除去することが不可欠です。

図8。島の選択。健康な島は丸い球状ダークブラウン色に黄金色を持っている傾向があり、組織を房に接続されていない。一晩のインキュベーション（16〜20時間）後に壊死性の中心は実験から除外すべき大きな小島で開発しています。

図9。代表高品質のcAMP産生の結果、INSUL分泌実証ではcAMP刺激培地から測定することができる。 A）野生型または遺伝子ノックアウトマウスから単離した膵島を測定し、全細胞タンパク質に対して標準化した11.1 mMグルコース及び細胞内cAMP産生を刺激した。B）分泌されたインスリンは、標準的なインスリンELISAを用いて測定し、また、全細胞に対して正規化したタンパク質。多くの場合、cAMP産生の変化は、グルコース刺激性インスリン分泌の増加と直接相関する。各群n = 3; *はp <0.05。この数字はKimple ら ¹⁰に発表された研究から適応されました。

Discussion

糖尿病の有病率は世界人口の7.7％に影響を与えると予測して、新たな研究技術の必要性を理解し、糖尿病の^18の治療の両方に不可欠である。現在の膵島単離は、in vitro実験のために使用される十分に確立されたプロトコルであり、若干の修正^11,14,16と、以前に提示されてきた。インスリン分泌が孤立した島のための共通のダウンストリームアプリケーションであるが、このようなcAMPの上流の成分、に焦点を当て、インスリン産生および分泌を増強メカニズムを描く助けるかもしれない。

安楽死の選択は、実験動物の人道的な扱いだけでなく、実験測定の整合性の両方を確保するために思慮深くなされなければならない。それは前に膵臓への時間の最大量に対して酸素化血液が膵島灌流を可能にするように、膵島単離のために、麻酔下での放血安楽死のための私達の好ましい方法であるインフレ。 CO ₂吸入は、それが人間的なプロトコルに従って実行されるかのように、手順を開始する前に、それは、少なくとも5〜6分間が不十分な酸素を血液に島を公開し、安楽死のためのお粗末な選択です。麻酔なしで、頚椎脱臼は科学的根拠に許容可能な方法かもしれないが、これは人道的な死と膵島機能の保全を確保するために安楽死させる方法と、マウスの解剖と膵臓インフレ手順の両方で豊富な経験を必要とする。麻酔下で放血を選ぶ際に、アベルチンは、このプロトコルにおいて好ましい麻酔薬である。アベルチンの特定の選択は、他の一般的に使用される麻酔薬に比べて多くの利点を持つ速効性と深い麻酔薬であるということである。まず、アベルチンは、血管系を拡張せず、イソフルラン^19が行うように、一酸化窒素放出を誘導する。膵島は、高度に血管であるので、それらの生物学は、負にイソフルランexposurによって影響され得るE。注射の²⁰時間後に167％のアップにより血糖値を上昇させることが示されている/キシラジンを、ケタミンができるように、第2、アベルチンが過度に、グルコース注射の非存在下で血中グルコースレベルを上昇させない。最後に、ペントバルビタールの治療範囲は、膵島への低酸素性損傷の機会を増加させる、マウス²¹で非常に狭い。

本プロトコルでは、オッディ括約筋の近くに総胆管を結紮するための縫合糸の使用は、止血剤の代替として利用される。スレッドの方法は、総胆管のより大きな操作性を可能にし、カニューレ挿入するための針を位置決めするのに役立つ。しかし、このステップ中にスレッドを使用すると、止血が胆管を配置助けるためにフリーハンドを可能にするのに対して、2オブジェクト（スレッドと注射器）を保持する必要があります。両方のアイソレーション技術は、同様の数と私たちの研究室や他の^10,22の前の仕事に示すように実行可能な島をもたらす。また、カニューレ挿入旧姓DLEサイズ、位置、および角度は、ユーザの好みに依存するであろう。具体的には、30 G針がこのプロトコルで使用されるが、他のサイズの株または遺伝的背景に基づいて、必要とされ得る。例えば、BTBRマウスは、非常にもろい総胆管を有し、より大きなゲージ針の先端（MEK、パーソナル観察）の周囲に大きなシールを提供することができる。したがって、必要に応じて、スイッチアウトする準備ができて、手術中に手持ちの異なるサイズのカニューレ針を鈍らせていることをお勧めします。総胆管における針の位置も大幅膵島の収率に影響を与える。針が総胆管の分岐部の前方に配置されている場合、コラゲナーゼ溶液は、肝臓に入り、乏しい膨張をもたらす。針がオッディ括約筋に近すぎる配置された場合は、部分的な膵臓インフレが孤立した島の数を減らす、発生します。総胆管上の様々な針のサイズと場所との裁判膵臓の膨張はrequiになります現在の手順をカスタマイズし、膵島収量を最大化するために赤い。

生存可能な膵島の数を増やすには、この手順の別の重要な構成要素は、プロトコルの指示に従ってすべての試薬を調製することである。酸素化を増加させるために、95％O _{2/5％CO 2}を有するバッファをプロトコルを通じて膵島生存におけるガス発生要因ができる。以前の研究は、酸素濃度が潜在的にβ-細胞の²³のエネルギー量を低減する、膵島の内部に向かって減少することを示している。暗い、壊死性の中心は、インビトロ応答性の低下と相関し、培養された島に表示されるように、これは一晩のインキュベーション後に明らかである。このように、十分な酸素を供給することは、分離の際に、一晩、正常酸素インキュベーションプロセスに膵島数及び生存率を高めるのに役立ちます。また、コラゲナーゼ溶液の適切な準備は膵臓組織の消化を高め、Tを解放します彼は周囲の組織からのランゲルハンス。コラゲナーゼ濃度が低すぎるだけでなく、膵島収量が低くなるが、外分泌腺の腺房組織に悪影響下流のアプリケーションに影響を与え、膵島に取り付けられたままであってもよい。一方、コラゲナーゼ濃度が高すぎるは、膵島を破壊することができる。そのため、膵島の破壊なしにコラゲナーゼ消化効率を確保するための適切な品質管理対策は、高い収率を推進していきます。

クロストリジウムヒストリチカムから分離コラゲナーゼは、このプロトコルでの膵臓組織からの膵島を解放するために使用される酵素である。コラゲナーゼの異なるロット間の酵素活性の非再現性は、単離された膵島の量および/または品質を妨げる可能性を有する。この議定書では、コラゲナーゼ酵素のそれぞれの新しい多くは、彼らが研究の対象となる前に、膵島の量と機能性の両方を決定するための内部品質管理チェックを通過します。したがって、downstr膵島単離のための酵素を選択する際にEAMアプリケーションやロットのばらつきを考慮する必要がある。リベラーゼ®（Roche）を、精製されたコラゲナーゼブレンドは、多くの場合、成功している他の消化酵素の代替であり;特に、単離された膵島^24,25のより高い量を得ることである。それは、in vitro機能²⁶ に妨げる可能性がしかし、リベラーゼの使用は、機能的な膵島を分離するために有益でない場合があります。

多くの制限は、下流のアプリケーションを妨げる可能性がある現在の膵島単離およびcAMP判別手順に存在する。前述のように、BTBRマウスは、膵臓膨張とその後の膵島単離の困難さを増大させる非常に壊れやすい総胆管を有する。そのため、いくつかのマウスから膵島の準備をプールすることは反復ごとに多くの島を必要とし、説明したcAMPアッセイを含む、in vitroアッセイの多くのように、必要になることがあります。さらに、cAMPアッセイブロックにIBMXを使用してcAMP産生の読み出しが示されるのホスホジエステラーゼ活性。 IBMXの添加は、cAMP産生と分解の循環が細胞のシグナル伝達のために重要であるケースではお勧めできない場合があります。しかしながら、このプロトコルからIBMXを除去する有意EIAにおいて意味のcAMPの値を得るために、レプリケートあたりより多くの膵島の添加を必要とする、最終的な膵島のcAMP含量を低下させる。

この議定書は、膵島生物学研究室や内分泌膵臓に興味のある人のための不可欠なツールです。この議定書のcAMPのコンポーネントは、インスリン分泌を高めるか、鈍いことができる方法膵島操作様々な治療を通じて理解するだけで1 vitro実験で多くのです。膵島を利用したほとんどの研究は、主にβ細胞のインスリン分泌に焦点を当てているが、他の細胞型は、膵島⁴内での動的な関係を評価することができる。 試験管と私の他との組み合わせでN vivoモデル、膵島の実験は、糖尿病やインスリノーマなどの壊滅的な膵臓関連の疾患のメカニズムを解明します。最も重要なことは、医薬品を直接小島に与える影響を理解することは、in vivoモデルへの変換における治療と援助の有効性を強化します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG