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Biology

Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Published: June 25, 2014 doi: 10.3791/50374
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Summary

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Abstract

La glicemia incontrollata è una caratteristica del diabete mellito e promuove patologie come la neuropatia, nefropatia e retinopatia. Con la crescente prevalenza del diabete, sia immuno-mediata di tipo 1 e obesità legati tipo 2, gli studi volti a delineare fisiopatologia del diabete e dei meccanismi terapeutici sono di importanza critica. I β-cellule delle isole pancreatiche di Langerhans sono responsabili opportunamente secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio nel sangue. Oltre al glucosio e altri nutrienti, i β-cellule sono stimolate dagli ormoni specifici, incretins, che sono secreti dall'intestino in risposta ai pasti e agire sui recettori β-cellule che aumentano la produzione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (definito cAMP). Diminuzione della funzione β-cellulare, massa, e la reattività incretine sono ben compresi, per contribuire alla fisiopatologia del diabete di tipo 2, e sono anche sempre più collegate with diabete di tipo 1. L'attuale topo isolamento delle isole e il protocollo determinazione cAMP possono essere uno strumento per aiutare a delineare i meccanismi che promuovono la progressione della malattia e gli interventi terapeutici, in particolare quelli che sono mediate dai recettori incretine o recettori che agiscono attraverso la modulazione della produzione di cAMP intracellulare legato. Mentre saranno descritte soltanto misurazioni cAMP, il protocollo di isolamento isolotto descritto crea un preparato pulito che consente anche per molte altre applicazioni a valle, come il glucosio stimolata la secrezione di insulina, [3 H]-timidina, proteine ​​abbondanza, e l'espressione di mRNA.

Introduction

La rigorosa manutenzione di euglicemia è indispensabile per evitare morbosità come la neuropatia, nefropatia e retinopatia, che sono tutte caratteristiche della patologia di incontrollata di tipo 1 e 2 il diabete 1. Funzione β-cellulare ridotto e di massa sia di tipo 1 e diabete 2 perturbano le concentrazioni di glucosio nel sangue 2. Considerando che tipo immuno-mediata 1 diabete risultati da una perdita devastante di β-cellule che producono insulina, alterata secrezione di insulina β-cellulare e la segnalazione periferica all'insulina nel diabete di tipo 2 insieme promuovono iperglicemia, dislipidemia, e aumento della produzione epatica di glucosio, che alla fine si traduce in sia la perdita della massa β-cellulare e la secrezione di insulina capacità da singoli β-cellule 3. La comprensione dei meccanismi alla base β-cellule nella progressione di tipo 1 e diabete 2 si spera, darà luogo a nuove terapie per prevenire e curare queste malattie.

In vitro timodelli di coltura SSUE, come l'INS-1 e MIN6 immortalati linee di β-cellule, possono essere strumenti utili per la comprensione delle funzioni β-cellulari specifici. Tuttavia, le interazioni tra i diversi tipi cellulari all'interno isolotto si possono regolare la funzione β-cellulare. Ad esempio, l'influenza paracrina di glucagone (rilasciato da α-cellule) e somatostatina (rilasciato da δ-cellule) in aumentando e diminuendo la secrezione di insulina, rispettivamente, dimostra l'importanza della prossimità cella cella nella risposta endocrina 4. Inoltre, giunzioni gap tra β-cellule potenziano il rilascio di insulina 5. Inoltre, sebbene progressi sono stati fatti nel generare linee insulinoma che meglio replicato la risposta fisiologica di isole isolate al glucosio (ad esempio, l'INS-1-derivato 832/13 e 832/3 linee cellulari), la rispondenza glucosio differenti rispetto ratto normale isolotti 6,7. Inoltre, la risposta di queste linee cellulari clonali insulinomaal peptide-1 (GLP-1) agonisti glucagone-simile possono differire notevolmente l'uno dall'altro, così come da isolotti normali 6. Pertanto, le linee cellulari immortalizzate non possono rappresentare il modello migliore per saggiare gli agenti che hanno un impatto sulla produzione di cAMP.

In contrasto con le linee cellulari derivate insulinoma, studiando funzione β-cellula esclusivamente in modelli animali interi offre una propria serie di complicazioni. Una delle maggiori sfide nel lavoro con tessuto endocrino sta misurando la concentrazione precisa di ormone rilasciato. In particolare, il fegato gioca un ruolo importante metabolizzare insulina, e il pancreas flusso sanguigno va direttamente al fegato. Così, una misura insulinemia non può ritrarre con precisione le quantità di insulina essere secreti dal pancreas stesso o l'impatto di trattamenti diversi sul tasso di secrezione insulinica 8. Inoltre, il metabolismo renale di glucagone può limitare l'affidabilità di uscita glucagone dall'Islet α-cellule 9. Pertanto, isolando isole primari di topo per la sperimentazione in vitro fornisce una comprensione più precisa di come l'isolotto sta rispondendo a stimoli specifici per integrare le misurazioni effettuate in vivo.

Il presente protocollo per l'isolamento di isole di topo è un protocollo ben consolidata utilizzato da un certo numero di gruppi (con lievi modifiche che possono contribuire ad aumentare il successo) 10,11. Inoltre, la determinazione della produzione di cAMP consente una lettura diretta della reattività incretin delle β-cellule. In combinazione con la misurazione cAMP, contenuto proteico e la secrezione di insulina possono anche essere quantificato dal medesimo preparazione del campione cAMP, contribuendo a determinare se un difetto nella funzione β-cellula si trova prossimale o distale di cAMP 10. Il contenuto di cAMP e l'applicazione finale secrezione insulinica in questo protocollo può essere uno strumento molto potente per comprendere l'influenza delle componenti farmaceutici, alimentari, tra l'altros, in cAMP e la secrezione di insulina. Oltre alla stimolazione da solo glucosio, altri composti possono essere utilizzati per misurare le variazioni di cAMP e secrezione insulinica 10,11.

Infine, anche se l'insulina è il principale ormone che saggio da isole isolate, altri ormoni, quali il glucagone e la somatostatina, così come le citochine, eicosanoidi e adenosina monofosfato ciclico, può anche essere misurata, mediante un saggio stimolazione transiente o quantificazione di ai livelli del terreno di coltura 12. Infine, anche se al di fuori del campo di applicazione di questo manoscritto, isolamento delle isole con il metodo di isolamento collagenasi descritto consente per la conservazione isolotto in modo che molte altre applicazioni a valle possono essere perseguiti, come il trapianto di isole, l'isolamento di RNA per quantitativa in tempo reale PCR o microarray analisi, proteine isolamento per Western blotting, isolotto incorporamento e di imaging immunofluorescenza, e l'incorporazione di [3H]-timidina come misura di replicazione delle cellule insularizione, alcuni dei quali sono stati descritti in precedenti articoli JoVE 13-16. Nel complesso, seguendo la procedura di isolamento delle isole descritta nel protocollo può fornire un ricercatore con informazioni importanti e utili per lo sviluppo di terapie e promuovere la scoperta di farmaci volti a migliorare la funzione β-cellulare.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il protocollo ha dimostrato di essere stata eseguita sotto la guida e l'approvazione della cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Wisconsin-Madison.

1. Preparazione di soluzioni

  1. Il metodo di eutanasia in questo protocollo è dissanguamento sotto anestesia Avertin (per una rassegna delle alternative, vedi la discussione). Per rendere Avertin, aggiungere 0,625 g (1,25% o 44,2 mM) di 2-2-2 tribromoethanol a 1,25 ml di 2-metil-2-butanolo in un tubo da 15 ml e scaldare a 37 ° C per 20-30 min. Agitare la soluzione in alto per 10-15 secondi alla volta per sciogliere completamente il 2-2-2 tribromoethanol. Una volta completamente sciolto, aggiungere la soluzione a 48,75 ml della doppia H 2 O distillata, filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron in un nuovo tubo conico da 50 ml, avvolgere i 50 ml conicheal tubo in un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per un massimo di un mese. Portare il tubo di RT prima di iniettare topi.
  2. Per rendere soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS), portare a 1 L 1x HBSS da uno stock di 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) in camera doppia H 2 O distillata, aggiungere 0,35 g (4,2 mm) nacho 3, e conservare a 4 ° C per 1 mese. Per ogni mouse, 105 ml di questa soluzione (più di 5-10 ml in più per pipettaggio errore) saranno necessari per l'isolamento delle isole.
  3. Isolotti sono molto sensibili al danno ipossico; Pertanto, HBSS è gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2 per simulare le concentrazioni di O 2 nel sangue. Miscele speciali di gas possono essere acquistati e una stazione spumeggiante impostato con una pipetta Pasteur attaccato al tubo flessibile. Dopo gorgogliare la quantità necessaria di HBSS con 95% O 2/5% di CO 2 per 15 minuti, aggiungere 0,02% BSA grado RIA (albumina sierica bovina) in volume e mantenere in ghiaccio per il remainder dell'isolamento isolotto.
  4. Per la preparazione Ficoll, pesare 32,5 g di Ficoll in un becher da 400 ml, aggiungere 80 ml di HBSS, e agitare a 500-700 rpm per 30 min. Una volta sciolto, versare la soluzione Ficoll in un cilindro graduato da 250 ml e aggiungere HBSS a volume 130 ml sul cilindro graduato per creare una soluzione di Ficoll 25%. Coprire la parte superiore del cilindro graduato con due porzioni di Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) e agitare vigorosamente più volte.
  5. Per una soluzione Ficoll 23%, 20,5% e 11%, aggiungere 27,6, 24,6 e 13,2 ml di 25% Ficoll, rispettivamente, a 50 ml provette coniche. Poi, portare ogni soluzione fino a un totale di 30 ml con HBSS e agitare bene per amalgamare. Tutte e quattro le soluzioni Ficoll devono essere conservati a 4 ° C e sono buoni per un massimo di due settimane.
  6. Soluzione di collagenasi che è adatto per isolare isolotti attivi è preparato da collagenasi isolato da Clostridium histolyticum (tabella Materials). Ogni partita deve essere testato per l'efficienza enzima. Tipicamente, collagenasi viene utilizzato a 0,3-0,5 mg per ml di HBSS. Utilizzando le concentrazioni di enzimi in quella fascia (di solito 3 differenti concentrazioni), determinare la qualità e la quantità delle isole isolate da topi o fratellini per impostare la concentrazione dell'enzima di lavoro di pari età.
  7. Una volta che la corretta concentrazione viene determinata, ciascun topo richiede 35 ml di collagenasi in HBSS per l'intero protocollo di isolamento. Agitare la collagenasi in HBSS a dissolversi. Immediatamente prima della chirurgia, pre-caricare una siringa da 5 ml con la soluzione di collagenasi, posizionare la cannula e togliere le bolle d'aria, e lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  8. I terreni di coltura isolotto per O / N incubazione è completato RPMI 1640 supporti. Per la soluzione di riserva, sciogliere un RPMI 1640 pacchetto (Gibco, New York) in 1 L di doppio H 2 O distillata e aggiungere 1,19 g HEPES (5 mm) e 2 g nacho 3 (24 mm). Regolare il pH a 7,4,filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C al buio.
  9. Per i media integrati, aggiungere il 10% FBS e 100 IU/100 mg / ml di penicillina / streptomicina, rispettivamente, lo stock RPMI 1640 supporti. Se una diversa concentrazione di glucosio è desiderato, privo di glucosio RPMI 1640 supporti possono essere usate e una determinata concentrazione di glucosio può essere aggiunto.
  10. Per uno stock di Krebs Ringer bicarbonato Buffer (Krebs), aggiungere i seguenti ingredienti per raddoppiare acqua distillata alle seguenti concentrazioni: NaCl (118,41 mm), KCl (4.69 mM), MgSO 4 (1,18 mm), KH 2 PO 4 (1.18 mM ), nacho 3 (25 mm), HEPES (5 mm), e CaCl 2 (2.52 mM) a pH 7.4. CaCl 2 deve essere aggiunto per ultimo e questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per 2 settimane.
  11. Per fare un lavoro stock di Krebs, primo gas con 95% O 2/182 5% di CO 2 per 10-15 min con una pipetta Pasteur a 37 ° C, seguita da aggiunta di 0,5% di grado RIA BSAin volume. Successivamente, il glucosio viene aggiunto alla concentrazione desiderata per il saggio in vitro.

2. Preparazione degli strumenti

  1. Leggermente smussato le punte di 30 - e gli aghi 27 G con una pietra affilatura per arrotondare la punta acuminata. Mettere una curva a 45 gradi l'ago circa ¼ di pollice dalla punta con un paio di pinze. Fare attenzione a non stringere troppo forte, che chiudere il diametro interno dell'ago.
  2. Tagliare il filo 3/0 seta sutura in circa lunghezze da 4 pollici, una per ogni mouse.
  3. Coprire la base del microscopio dissezione con pellicola trasparente e nastro di plastica verso il basso.
  4. Tagliare alcuni pezzi di carta assorbente panchina, circa 3 x 5 pollici di dimensioni, per almeno il 2 per mouse.

3. Preparazione del mouse

  1. Riempire una siringa da 1 ml con 1 ml Avertin.
  2. Iniettare la soluzione avertin intraperitoneale a circa 40 ml / g di peso corporeo.
  3. Dopo il mouse N. Longer risponde alla coda o pizzichi piede posteriore, trasferire accuratamente alla postazione di lavoro microscopio da dissezione.
  4. Con il mouse in posizione supina e la testa rivolta distalmente, spruzzare il mouse con 70% etanolo acquoso. Accertarsi di utilizzare una adeguata quantità di etanolo al 70% per limitare la quantità di pelo nella cavità toracica esposta.

4. Apertura della Cavità toracica

  1. Pizzicare la pelliccia e pelle del topo tra le due zampe posteriori e fare un taglio iniziale attraverso l'epidermide, derma e membrana sottostante.
  2. Mentre ancora pizzicando la pelle e membrana sottostante, tagliare verso dell'arto anteriore su entrambi i lati del mouse avendo cura di evitare di tagliare eventuali organi interni.
  3. Piegare la pelle e la membrana lembo sopra la gabbia toracica e rimuovere il processo xifoideo per consentire un più facile accesso al pancreas per l'inflazione.
  4. Riorientare il mouse con la testa rivolta prossimalmente e spostare gli organi interni verso il lato destro del lavoro stzione per rivelare l'aorta discendente.
  5. A meno che il tessuto del sangue deve essere raccolto, l'aorta discendente può essere tagliato per completare euthanization. Asciugare il sangue in eccesso con carta panchina o una Kimwipe per facilitare l'accesso al dotto biliare comune.

5. Gonfiare il Pancreas

  1. Con un microscopio da dissezione, riposizionare il piccolo intestino così il dotto biliare comune forma una linea perpendicolare con la testa del mouse.
  2. Prendere una pinza e afferrare l'intestino tenue e trovare sfintere di Oddi (sfintere di ampolla) alla fine del dotto biliare comune, che strombatura affaccia tenue dal dotto biliare, formando un triangolo bianco sull'intestino rosa. Una volta che la sfintere di Oddi è stato localizzato, prendere un # 5 pinze Dumont e far scorrere la punta sotto il dotto biliare comune più vicino al piccolo intestino come possibile, facendo attenzione a non forare il condotto.
  3. Dopo aver forato attraverso l'intestino tenue e del tessuto connettivo, utilizzare lapunta del Dumont pinza per afferrare la sutura e tirarlo sotto il dotto biliare comune. Legare il dotto biliare comune più vicino alla sfintere di Oddi possibile, assicurandosi che il nodo è tesa per evitare perdite.
  4. Afferrare entrambe le estremità della sutura e tirare verso la coda per mettere qualche tensione sul dotto biliare comune. Usando una mano libera, fare una piccola incisione con le forbici micro nel dotto biliare comune appena sopra l'ultima biforcazione nel fegato. Nota: È importante non tagliare troppo vicino alla sfintere di Oddi come ciò potrebbe comportare un gonfiaggio parziale del pancreas ed evitare di tagliare attraverso il dotto biliare comune come sarà anche comportare una scarsa inflazione.
  5. Tenendo le due estremità della corda con il dotto biliare comune tesa, rimuovere la siringa / cannula che è stato pre-caricato con 5 ml di soluzione di collagenasi dal secchiello del ghiaccio, appoggiare la siringa ed inserire l'ago smussato 30 G nel taglio dotto biliare comune, facendo attenzione a non bucare il tramite del wall del condotto. Se l'ago da 30 G non è sufficientemente ampio per il dotto biliare per formare un sigillo attorno, rimuovere e sostituire con il smussate 27 ago G.
  6. Tenendo l'ago in posizione, rilasciare la sutura e prendete la siringa da 5 ml. Premere lentamente lo stantuffo della siringa. Nota: Se l'ago è stato inserito con successo nel dotto biliare comune, si espanderà.
  7. Continuare a premere il pistone lentamente e lasciando fuori in modo pulsatile fino alla prima parte del pancreas gonfia, seguita dalla pressione costante delicatamente fino pancreas gonfia più. Nota: La maggior parte pancreas tengono 3-5 ml prima di iniziare a perdere. Inoltre, una inflazione successo avrà una distribuzione uniforme del tessuto esocrino e la parte del pancreas sulla parte superiore dello stomaco sarà gonfiato.
  8. Togliere l'ago dal dotto biliare comune e partì a lato.

6. Pancreas rimozione

  1. Prendete una pinza in una mano e un paio di forbici curve inl'altra. Utilizzando le pinze, afferrare il piccolo intestino al sfintere di Oddi. Con le forbici chiuse, utilizzare la punta di una parte separata del pancreas del piccolo intestino.
  2. Stendere le forbici oltre ad allargare il divario tra il piccolo intestino e il pancreas.
  3. Posizionare la "V" delle forbici dove il piccolo intestino e pancreas fissano tra loro sul lato destro della gap appena fatta. Utilizzando la pinza tirare delicatamente l'intestino tenue passato le forbici per rimuovere il pancreas.
  4. Continuare a lavorare lungo il piccolo intestino al tessuto connettivo rosa. A questo punto, sollevare il piccolo intestino vicino dove si attacca allo stomaco e tagliare il pancreas lontano dal resto del piccolo intestino. Nota: Fare attenzione a non tagliare il pancreas come si può iniziare a sgonfiarsi.
  5. Afferrare delicatamente la parte del pancreas attaccati allo stomaco con una pinza (pinza piatta funzionano meglio). Mentre tirando delicatamente sul pancreas, usare la curvad forbici per tagliare via le connessioni tra il pancreas e lo stomaco.
  6. Individuare la milza e tenerlo con le pinze sopra il pancreas. Prendere le forbici curve e tagliare le connessioni tra la milza e il pancreas.
  7. Trovare dove il pancreas è attaccato al crasso. Raccogliete l'intestino crasso con una pinza e utilizzare la punta delle forbici per colpire attraverso. Diffondere le forbici a parte come prima per generare un divario tra l'intestino crasso e il pancreas.
  8. Reggere crasso con pinza: questo si tradurrà nel pancreas allontanamento, esponendo le sue esatte connessioni crasso. Tagliare via le connessioni rimanenti.
  9. Trova il tessuto connettivo rosa attaccato al pancreas e nell'intestino tenue e tagliare il più vicino al pancreas possibile. Nota: Se penetrante il pancreas è un problema, si consiglia di tagliare più vicino al piccolo intestino come il tessuto connettivo verrà filtrato nei passaggi successivi.
  10. Solrab tanto del pancreas possibile e sollevare delicatamente. Con forbici curve, tagliare via le rimanenti connessioni tra il pancreas e la cavità toracica per rimuovere completamente il pancreas. Nota: Il pancreas devono ancora essere gonfiati se rimosso correttamente.
  11. Conservare il pancreas rimossi in ~ 2,5 ml di soluzione di collagenasi in un tubo da 50 ml su ghiaccio fino a che tutti gli altri pancreas sono stati gonfiati e rimossi per l'esperimento.

7. Lavaggio

  1. Prendere tutte pancreas isolato e spostarli per separare 50 ml provette coniche contenenti ciascuna 25 ml di soluzione di collagenasi fresco
  2. Posizionare i tubi conici da 50 ml in posizione verticale a 37 ° C agitando bagnomaria in grado di oscillare a 220-250 giri al minuto, con lo shaker spento.
  3. Gas ciascun tubo da 50 ml con 95% O 2/5% di CO 2 per 5 minuti con una pipetta Pasteur.
  4. Richiudere ogni tubo ermeticamente e mettere di traverso in acqua agitazionebagno sotto la superficie dell'acqua. Agitare a 220-250 rpm per 20 secondi, ogni minuto, fino a 16 min a partire da 6 min. (Agitare a 6, 8, 10, 12, 14, e 16 min)
  5. Trasferire immediatamente le provette per una centrifuga a temperatura ambiente per una rotazione rapida. Portare la centrifuga fino a 1500 giri (400-500 g) e spegnere immediatamente.
  6. Utilizzando una trappola vuoto, aspirare circa 22,5 ml della soluzione di collagenasi senza disturbare il pellet. Lavare con 10 ml HBSS e vortice delicatamente per rompere il pellet.
  7. Eseguire un altro giro veloce a temperatura ambiente fino a 1.500 giri (400-500 g).
  8. Aspirare circa 10 ml di soluzione, ancora una volta senza disturbare il pellet.
  9. Lavare con altri 10 ml di ghiaccio freddo HBSS e vortice delicatamente per rompere nuovamente il pellet. Ripetere lo spin e aspirato rapide 10 ml di soluzione.
  10. Vortice delicatamente il pellet nei restanti 2,5 ml di soluzione HBSS. Versare la soluzione attraversoa 1.000 micron maglia in un nuovo tubo conico da 50 ml. Questo rimuoverà il grande frammenti di tessuto non digerito dal collagenasi.
  11. Sciacquare il vecchio tubo da 50 ml con 2,5 ml di ghiaccio freddo HBSS. Utilizzare una pipetta Pasteur per sciacquare i lati del tubo accuratamente prima di trasferire il 2,5 ml di HBSS attraverso la maglia nelle nuove tubo da 50 ml.
  12. Eseguire un altro giro veloce a temperatura ambiente a 1.500 giri (400-500 g) per far sedimentare il tessuto.
  13. Aspirare tutta la HBSS inclinando il tubo verso la trappola vuoto. Nota: E 'molto importante per non disturbare il pellet in quanto ciò comporta la perdita di isolotti. Se il pellet è allentato o inizia a muoversi verso la trappola vuoto, fermare aspirando la soluzione e ri-pellet il tessuto e poi continuare ad aspirare la soluzione rimanente.
  14. Dopo che tutti i HBSS è stato rimosso, aggiungere 4,8 ml di soluzione di Ficoll 25% e agitare per rompere il pellet.
  15. Strato attentamente 2.4 ml di 2Soluzione Ficoll 3% sulla superficie della soluzione Ficoll 25% aggiungendo la soluzione di Ficoll 23% al lato del tubo conico 50 ml. Per assicurare una stratificazione, ruotare il tubo conico da 50 ml quando si aggiunge la soluzione Ficoll.
  16. Ripetere il processo di stratificazione per il 20,5% e quindi le soluzioni Ficoll 11%. Nota: se 4 strati distinti non sono presenti, aggiungere HBSS fino alla tacca dei 50 ml e invertire il tubo 4-6 volte o fino a quando il gradiente Ficoll non esiste più. Re-pellet il tessuto e riprovare passi 7,14-7,16.
  17. Centrifugare la provetta conica da 50 ml a RT a 1.820 rpm (800 g) per 15 min.
  18. Versare tutto il Ficoll in una provetta conica da 50 ml fresco, avendo cura di lasciare il pellet di tessuto esocrino dietro. Aggiungere il ghiaccio freddo HBSS fino alla tacca dei 50 ml e capovolgere la provetta 4-6 volte per mescolare il Ficoll e HBSS insieme.
  19. Centrifugare la provetta conica da 50 ml a RT a 1.820 rpm (800 g) per 5 min.
  20. Aspirare accuratamente la maggior parte della miscela HBSS / Ficoll utilizzando un tradi vuotop. Non disturbare il pellet come è allentato e può essere aspirato facilmente.
  21. Prendere una pipetta Pasteur e trasferire il pellet in una provetta monouso cultura.

8. Picking Isolotti

  1. Aggiungere 5 ml di mezzi di raccolta (ad esempio. Completato RPMI 1640 o Krebs Ringer bicarbonato buffer) al tubo cultura usa e getta. Nota: I media raccolta variano a seconda delle applicazioni a valle.
  2. Affittare gli isolotti si depositano sul fondo della provetta di coltura per 5 min. Li Trasferire con una pipetta Pasteur a un 15 millimetri da 60 millimetri piatto di Petri in polistirolo. Nota: È importante usare una piastra di Petri in quanto questi non sono trattati e impedirà gli isolotti di aderire al piatto.
  3. In un separato 15 millimetri per 60 millimetri di polistirolo piastra di Petri, aggiungere 5 ml di topo cultura isolotto dei media (100 ml RPMI 1640 della media, 10 ml, inattivato al calore FBS, 1 ml Pen / Strep, filtro sterilizzati).
  4. Con l'aiuto di un microscopio dissezione con backligcapacità di HT, utilizzare un P-20 pipetta per raccogliere le isolette nel piatto di Petri contenente isolotto di coltura, avendo cura di evitare di trasferire i residui di tessuto acinare. Quando retroilluminato, isolotti appariranno marrone-oro e la loro membrana esterna possono brillare, mentre il tessuto acinare apparirà grigio chiaro e opaco. Se la preparazione isolotto contiene una grande quantità di detriti, si consiglia di selezionare manualmente isolotti due volte in terreno fresco. Ridurre la contaminazione detriti limiterà isolotto aggregazione dopo una notte di incubazione. Aggiunta DNAse (3.000 U / ml) al tampone di digestione può anche aiutare a limitare isolotto aggregazione (JWJ, osservazione personale). Nota: è importante contare il numero di isole isolate per pianificare esperimenti a valle.
  5. Incubare la isolotti O / N in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.

9. CAMP Assay

  1. Etichettare 1,7 ml provette per microcentrifuga, uno per ciascun replicato del dosaggio. Nota: saggi di cAMP devono avere almeno duplicates per ogni condizione di trattamento, ma più repliche per il trattamento sono da preferire.
  2. Dopo gassing il Krebs Ringer bicarbonato tampone per 15 minuti con il 95% O 2/5% di CO 2 con la pipetta Pasteur, aggiungere lo 0,5% di BSA grado RIA e una concentrazione di glucosio finale di 1,7 mm (soluzione preincubazione). Quindi, aggiungere 1 ml di Krebs appena gasati ad ogni provetta per microcentrifuga. Due ml di Krebs è richiesto per provetta per i punti di pre-incubazione e il tempo di trattamento; comunque si consiglia di preparare almeno 5-10 ml supplementare.
  3. Agitare il isolotti al centro del piatto Petri, e utilizzando un P-20 pipetta, selezionare manualmente gli isolotti di nuovo 15 millimetri di 60 mm polistirene piastra di Petri contenente 5 ml della soluzione di preincubazione per lavare il terreno di coltura contenente glucosio dalle isolette.
  4. Il kit di analisi cAMP utilizzata è la GE Healthcare cAMP diretto BioTrak VIA. Il prococol utilizzato è una modifica di quello descritto per "meas cAMP intracellularesura utilizzando la procedura VIA non acetilazione con i reagenti di lisi romanzo, "ed è stato ottimizzato per l'uso con il numero minimo di isolotti per provetta, consentendo un aumento del numero di condizioni di trattamento e replicati tecnici. Utilizzando un P-20 pipetta di trasferimento almeno 13 isolette in ogni provetta dal punto 9.2, mantenendo la coerenza dimensione isolotto tra i tubi, con 1 ml di buffer di pre-incubazione. Nota: L'aumento del numero di repliche è più vantaggioso rispetto al numero di isolotti per provetta. Tuttavia, se ci sono abbastanza isolotti per aumentare il numero di isolotti per provetta in modo uniforme, è consigliabile farlo, fino a 25-50 isolotti per provetta.
  5. Con i tappi tubo microfuge aperto, travasare in un incubatore a 37 ° C fissato al 5% di CO 2 e incubare per 45 min a normalizzare la secrezione di insulina di tutte le isole ad un livello base.
  6. Mentre i campioni vengono incubazione preparare i trattamenti (cioè 8 mm, 11,1 mM, glucosio 16,7 mM, ecc) nel Krebs fr gasatoom punto 9.2. in 15 ml provette coniche, di 1 ml in più per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio. Aggiungere 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) ad una concentrazione finale di 200 mM. IBMX è un inibitore della fosfodiesterasi generale che blocca la degradazione del cAMP, permettendo l'accumulo di cAMP cella che viene prodotto. (Nota:.. Questo è un vero saggio di produzione di cAMP, vedere la sezione di discussione di casi in cui la misurazione della produzione di cAMP non può essere desiderabile Se IBMX è lasciato fuori del test, più isole saranno necessari per provetta al fine di ottenere i dati di cAMP nel range lineare della curva standard).
  7. Dopo l'45 min di pre-incubazione, rimuovere i tubi microcentrifuga dal termostato, tappo e impulsi vortice ogni campione (inferiore a 0,5 sec). Questo è di mescolare il gradiente insulina che è stato probabilmente generato a causa delle isolette essere concentrati sul fondo della provetta. Bisogna fare attenzione a non vortice troppo duramente, in quanto ciò potrebbe influire negativamente sulla stabilità isolotto (Nota: Cappedtubi con isolotti possono essere delicatamente flicked o invertiti se non è possibile impulsi-vortice delicatamente. Queste opzioni si aggiunge il tempo per il test, che dovrebbe essere considerato quando si pianifica l'esperimento).
  8. Trasferire ogni tubo a una centrifuga da tavolo (RT) e girare fino a quando le isole raggiungere 10.000 giri al minuto (7,000-7500 g), e poi si spengono subito.
  9. Utilizzare una pipetta P-1000 per rimuovere la maggior parte del Krebs in ciascuna provetta da microcentrifuga, lasciando circa 10-15 ml di Krebs sul pellet isolotto. Utilizzare una pipetta P-20 per rimuovere la porzione più vicina al pellet isolotto. Se il pellet è disturbato, dispensare il Krebs nel tubo e re-spin.
    (Nota: se lo sperimentatore trova troppo difficile rimuovere tutti i Krebs dal pellet isolotto senza disturbarla, l'ultimo 10-15 microlitri può essere lasciato acceso e contabilizzata nel volume totale tardi nel protocollo.
  10. Ottenere una adeguata quantità di azoto liquido in un contenitore isolato di scattare congelare i campioni dopo incubazione.
  11. Prendete i campioni fuori dell'incubatore, berretto, vortice rapidamente (meno di 0,5 sec) girare i tubi microcentrifuga in una centrifuga da tavolo (RT) fino a 10.000 rpm (7,000-7500 g), e poi spento immediatamente. Se insulina o di un altro metabolita è un'applicazione a valle desiderata, utilizzare una pipetta P-1000 per raccogliere una aliquota di mezzo in una provetta per microcentrifuga e conservare a -20 ° C fino ad ulteriore analisi. Se supporti stimolazione non vengono raccolti, può essere scartato.
    (Nota: IBMX è un forte potenziatore della secrezione di insulina glucosio-stimolata (GSIS) Pertanto, i risultati ottenuti da GSIS cAMP mezzo di stimolazione possono non rappresentare accuratamente il vero effetto di trattamenti specifici su GSIS, soprattutto se questi effetti sono sottili.).
  12. Ripetere passo 9.9 per rimuovere quanto più mezzo di stimolazione possibile senza disturbare il pellet isolotto. Snap congelare il pellet isolotto in azoto liquido una volta che ci si trova a meno di 10-15 ml di Krebs lasciato sul pellet isolotto. Una volta che tutte lecampioni sono stati congelati a scatto, conservare a -80 ° C fino misurazione cAMP.
  13. Il giorno della determinazione cAMP, preparare i reagenti di lisi nuovi secondo il protocollo dei produttori. Aggiungere 200 ml di reagente di lisi 1B per ciascuna provetta da microcentrifuga e vortex alla massima velocità per 30 sec. Lasciate che i tubi si siedono in ghiaccio per 10 minuti, vortex ogni 2 min 30 sec. (Nota: Il protocollo raccomanda di effettuare un'analisi microscopica con trypan blu per garantire la lisi cellulare, ma questo non è eseguita per le isole).
  14. Preparare gli standard di lavoro e impostare la micropiastra EIA esattamente come descritto nel protocollo del produttore. Dopo che il substrato enzimatico è stato incubato con la micropiastra per 30 minuti, eseguire la fase facoltativa 1.0 M di acido solforico, e determinare l'assorbanza dei pozzetti a 450 nm usando un lettore di micropiastre.
  15. Risultati AMP ciclico saranno registrati come fmol / pozzetto. Questo dovrebbe essere normalizzato al volume totale del campione originale (200 microlitri + qualsiasiKrebs residuo lasciato sulle isolette dal punto 9.9). Successivamente, i risultati possono sia essere normalizzati per il numero totale di isolotti, dando fmol cAMP prodotto / isolotto, o campioni lisato può essere sottoposto ad acido bicinconinico saggio (BCA) proteina per normalizzare i risultati di proteina cellulare totale (dando proteina fmol / mg) . Quest'ultimo è consigliato quando le dimensioni delle isole sono incoerenti tra i campioni, e può essere un surrogato per le dimensioni delle isole. Il kit di analisi delle proteine ​​Pierce BCA è stato utilizzato con successo in questo protocollo, e richiede solo 25 ml di campione. Gli standard BSA devono essere preparati in lisi reagente 1B dal kit di analisi cAMP.

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Representative Results

Per garantire un alto rendimento isolotto durante l'isolamento, tecniche chirurgiche descritte nel protocollo devono essere seguiti attentamente. Sebbene le tecniche qui presentate saranno su misura per ogni laboratorio, ci sono alcuni passaggi critici che porterà ad un isolamento di successo. Al fine di rendere il dotto biliare comune facilmente accessibile, si raccomanda che gli organi spostati a destra del mouse (Figura 1). Inoltre, questo permetterà il pancreas a gonfiare con una quantità inferiore di resistenza poiché ci sarà minore espansione peso limitazione. Un altro passo fondamentale per massimizzare la resa isolotto è la legatura del dotto biliare comune vicino alla sfintere di Oddi (figure 2A-C). Legando più lontano dallo sfintere di Oddi può provocare una parziale inflazione riducendo la quantità di soluzione di collagenasi entrare nel dotto pancreatico principale. Inoltre, un nodo teso impedirà soluzione di collagenasi di entrare nell'intestino.

<p class = "jove_content"> Una corretta incisione nel dotto biliare comune deve essere posizionato lontano dalla biforcazione dal fegato ma abbastanza vicino per gonfiaggio pancreatica massima (Figura 3). Un'incisione fatta troppo vicino alla biforcazione può portare al flusso di soluzione di collagenasi nel fegato. Quando la soluzione collagenasi entra nel fegato, perderà il suo colore rosso scuro e cominciare a girare biancastra. In questo caso, rimuovere l'ago e provare un altro incannulamento ulteriormente dal fegato. Inoltre, il dotto biliare comune incisione dovrebbe essere solo in parte attraverso il condotto (circa 50%). Completamente troncatura del condotto renderà difficile per sigillare il condotto intorno alla punta dell'ago. Una corretta incisione provocherà la chiusura completa del condotto intorno all'ago, producendo una pressione sufficiente a riempire la bile sia comune e pancreatiche (Figura 4A). E 'inoltre importante garantire l'ago è entrato il dotto biliare comune e non la guaina circostante.Una volta che l'ago è stato inserito correttamente, 5 ml della soluzione di collagenasi devono riempire il pancreas, creando un tessuto marmorizzato.

Il processo di rimozione pancreas deve essere eseguita delicatamente per promuovere la massima resa isolotto (Figura 5). Piercing pancreas può comportare una deflazione e perdita della soluzione di collagenasi, riducendo la resa isolotto. Tagliare il pancreas vicino al tessuto connettivo e altri organi impedirà sgonfiaggio. Inoltre, la raccolta di altri tessuti, come tessuto connettivo, insieme con il pancreas non è un problema, come verrà rimosso nei passaggi successivi. A pancreas completamente rimosso rimane gonfio dopo escissione prima ulteriore digestione con collagenasi (Figura 6).

Strati distinti nel gradiente Ficoll porterà ad una preparazione isolotto pulita e creare un ambiente più facile per scegliere isolotti (Figura 7). La pendenza assicura la separazione di isolotti dadetriti cellulari e del tessuto connettivo che rimane dopo la digestione e schermo maglia filtrante. Inoltre, questo passaggio è cruciale per la selezione puliti, isolotti sani per successivi utilizzi. In particolare, isolotti sani saranno di forma sferica e hanno un colore marrone dorato al centro marrone scuro (Figura 8). Nota: Le isole di topi diabetici saranno molto più pallido di colore, corrispondente alla riduzione del contenuto di insulina, e possono essere meglio distinto dal tessuto acinare per la loro forma, la lucentezza e la loro rete di capillari visibili. Eventuali isolotti collegati al tessuto acinare non devono essere utilizzati e devono essere eliminati. Inoltre, isolotti più grandi che sviluppano un buio, un centro necrotico dopo una notte di incubazione devono essere eliminati in quanto non funzionano correttamente.

Come descritto in premessa, la produzione di cAMP è una componente importante della funzione β-cellulare; in particolare, per quanto riguarda l'azione incretine. Un vantaggio per il protocollo descritto in questo riunito hod è che si può avere contemporaneamente la produzione di cAMP e dati secrezione di insulina glucosio-stimolata. In genere, l'impatto di un agente sulla produzione di cAMP correla direttamente con il suo impatto sulla secrezione di insulina 17. Per gli esperimenti semplici, questa regola vale abbastanza bene (vedi Figura 9 per un esempio). Nel presente protocollo, utilizziamo IBMX (un inibitore della fosfodiesterasi) nei nostri trattamenti per prevenire il catabolismo del cAMP, dando la produzione totale di cAMP.

Figura 1
Figura 1. Cilindrata di organi interni. Posizionando gli organi interni al lato destro del mouse crea un ambiente di lavoro più facile e permette la camera pancreas di espandersi durante il gonfiaggio.

Figura 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
Figura 2. Legare fuori la sfintere di Oddi (AC). Raffigurato ecco l'ingresso del dotto biliare comune al piccolo intestino al sfintere di Oddi. Legatura del dotto biliare comune al sfintere di Oddi impedisce soluzione di collagenasi di entrare intestini.

Figura 3
Figura 3. Comune incisione dotto biliare. E 'meglio fare un taglio nel dotto biliare comune, leggermente distale alla biforcazione nel fegato per impedire il flusso della soluzione di collagenasi nel fegato.

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Figura 4. Incannulazione del dotto biliare comune da una smussata 30 ago G e l'inflazione pancreas. A) L'ago G 30 è inserito nel dotto biliare comune, creando una tenuta intorno alla punta dell'ago. È importante controllare e da notare che l'ago è stato inserito nel dotto biliare comune e non la guaina circostante. Un ago inserito correttamente avrà un aspetto opaco. B) Una corretta inflazione pancreas si riempirà di circa 3-5 ml di soluzione di collagenasi e hanno un aspetto marmorizzato.

Figura 5
Figura 5. La rimozione del pancreas. A) L'incisione iniziale effettuata con un paio di forbici curve si verifica vicino alla sfintere di Oddi. Il rem inizialeovale inizia nella direzione dello stomaco facendo attenzione a non forare il pancreas. B) Il passo finale è la rimozione del pancreas dal tessuto connettivo sul piccolo intestino e ultimi connessioni alla cavità peritoneale.

Figura 6
Figura 6. Il pancreas gonfiati. Una rimozione pancreas successo produrrà un pancreas perfuso con soluzione di collagenasi. Scarso escissione lascerà un piccolo, pancreas sgonfiato.

Figura 7
Figura 7. Quattro strati del gradiente Ficoll. I quattro strati distinti rappresentano un differenzialedensità t Ficoll dal 25% al ​​fondo per l'11% al top. La stratificazione distinto è indispensabile per rimuovere i detriti e esocrine disuso dagli isolotti.

Figura 8
Figura 8. Selezione Islet. Isolotti sani tendono ad avere un colore marrone dorato al marrone scuro con una forma sferica rotonda e non sono collegati a acinar tessuto. Dopo una notte di incubazione (16-20 ore), un centro necrotico si sviluppa nelle isole più grandi, che dovrebbero essere esclusi da esperimenti.

Figura 9
Figura 9. Rappresentante di alta qualità, risultati di produzione di cAMP, dimostrando che isol secretoin può essere misurata dal mezzo di stimolazione cAMP. A) Isolato isolotti da wild-type o gene topi knockout sono state stimolate con glucosio 11,1 mM e produzione di cAMP intracellulare è stato misurato e normalizzato alla proteina cellulare totale. B) Secernuto insulina è stata misurata utilizzando un insulina ELISA standard, e normalizzata alla totale cellulare proteina. In molti casi, la variazione della produzione di cAMP correla direttamente con l'aumento in glucosio stimolata la secrezione di insulina. n = 3 per ogni gruppo; *, P <0,05. Questa cifra è stata adattata da una ricerca pubblicata nel Kimple et al 10.

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Discussion

Con la prevalenza di diabete proiettate a pregiudicare il 7,7% della popolazione mondiale, l'esigenza di nuove tecniche di ricerca è fondamentale sia per capire e curare il diabete 18. L'attuale isolamento delle isole è un protocollo ben consolidata utilizzati per la sperimentazione in vitro ed è stato presentato in precedenza con lievi modifiche 11,14,16. Anche se la secrezione di insulina è un'applicazione a valle comune di isole isolate, concentrandosi su componenti a monte, come ad esempio cAMP, può aiutare a delineare meccanismi potenzia la produzione di insulina e la secrezione.

La scelta dell'eutanasia deve essere fatta minuziosamente per assicurare sia il trattamento umano degli animali da laboratorio, nonché l'integrità delle misure sperimentali. Per l'isolamento delle isole, dissanguamento sotto anestesia è il nostro metodo preferito per l'eutanasia in quanto permette isolotto perfusione di sangue ossigenato per la quantità massima di tempo prima del pancreasinflazione. CO 2 inalazione è una scelta sbagliata per l'eutanasia, come se essa è stata eseguita secondo protocolli umane, espone gli isolotti al sangue scarsamente ossigenato per almeno 5-6 minuti prima della procedura può iniziare. Dislocazione cervicale senza anestesia potrebbe essere un metodo accettabile con giustificazione scientifica, ma ciò richiederebbe una notevole esperienza sia con il metodo di eutanasia e la dissezione mouse e gonfiaggio pancreas, al fine di assicurare la morte umana e conservazione della funzione isolotto. Nella scelta dissanguamento sotto anestesia, Avertin è l'anestetico preferito in questo protocollo. La scelta particolare di Avertin è che è una azione rapida e profonda anestesia con molti vantaggi rispetto ad altri anestetici comunemente usati. In primo luogo, Avertin non si dilata vascolare e induce il rilascio di ossido di azoto, come fa isoflurane 19. Isole pancreatiche sono altamente vascolarizzati, e quindi la loro biologia possono essere influenzati negativamente da exposur isofluranoe. In secondo luogo, Avertin non eccessivamente aumentare i livelli di glucosio nel sangue in assenza di iniezione glucosio, come ketamina / xilazina, che ha dimostrato di aumentare il glucosio nel sangue 167% fino a un'ora dopo l'iniezione 20. Infine, l'intervallo terapeutico per pentobarbital è molto stretta in topi 21, aumentando la probabilità di danno ipossico alle isolette.

Nel presente protocollo, l'uso di filo di sutura per legare il dotto biliare comune vicino sfintere di Oddi è utilizzata come alternativa a una pinza emostatica. Il metodo del filo consente una maggiore manovrabilità del dotto biliare comune e aiuta la posizione dell'ago per cateterismo. Tuttavia, l'uso di filo durante questa fase richiede possesso di due oggetti (Discussione e siringhe), mentre il emostato permette una mano libera per contribuire a posizionare il dotto biliare. Entrambe le tecniche di isolamento producono un numero simile di isolotti e vitali come mostrato con il lavoro precedente, nel nostro laboratorio e altri 10,22. Inoltre, incannulamento needimensione dle, la posizione e angolo dipende dalle preferenze dell'utente. In particolare, un ago G 30 è utilizzato in questo protocollo, ma in altre dimensioni può essere richiesto sulla base di sforzo o background genetico. Ad esempio, i topi BTBR hanno un dotto biliare comune molto friabile e un calibro più grande può fornire una maggiore tenuta attorno alla punta dell'ago (MEK, osservazioni personali). Pertanto, si raccomanda di avere gli angoli aghi cannula di dimensioni diverse su mano durante l'intervento chirurgico, pronti a passare se necessario. La posizione dell'ago nel dotto biliare comune avrà anche un impatto notevolmente la resa isolotto. Se l'ago è posizionato di fronte alla biforcazione del dotto biliare comune, soluzione di collagenasi entrerà nel fegato e causare una scarsa inflazione. Tuttavia, se l'ago è posizionato troppo vicino alla sfintere di Oddi, si verificherà un inflazione pancreatico parziale, diminuendo il numero di isole isolate. Inflazioni pancreatiche di prova con i vari formati dell'ago e posizioni sul dotto biliare comune saranno requirosso per personalizzare la presente procedura e massimizzare la resa isolotto.

Un altro componente importante di questa procedura per aumentare il numero di isolotti vitali è quello di preparare tutti i reagenti secondo le istruzioni protocolli. Gasare i buffer con il 95% O 2/5% di CO 2 per aumentare l'ossigenazione può un fattore di sopravvivenza isolotto in tutto il protocollo. Lavoro precedente dimostra che la concentrazione di ossigeno diminuisce verso l'interno del isolotto, riducendo potenzialmente il contenuto energetico del β-cellule 23. Questo può essere evidente dopo una notte di incubazione come scuro, centro necrotico apparirà in isolotti coltivate, che correla con una diminuzione della reattività in vitro. Così, fornendo abbastanza ossigeno contribuirà ad aumentare il numero di isole e vitalità durante l'isolamento e nella notte, processo di incubazione normossico. Inoltre, il corretto preparazione della soluzione di collagenasi migliorerà la digestione del tessuto pancreatico e liberare tegli isolotti dal tessuto circostante. Se la concentrazione di collagenasi è troppo bassa, non solo la resa isolotto essere bassa, ma il tessuto esocrino acinoso può rimanere attaccato alle isole, influenzando negativamente applicazioni a valle. D'altra parte, troppo alto di una concentrazione collagenasi può distruggere gli isolotti. Pertanto, misure adeguate di controllo della qualità per garantire l'efficienza collagenasi digestione senza la distruzione di isolotti promuoveranno maggiori rendimenti.

Collagenase isolato dal Clostridium histolyticum è l'enzima utilizzato per liberare le isole dal tessuto pancreatico in questo protocollo. Il irriproducibilità dell'attività enzimatica tra diversi lotti di collagenasi ha il potenziale per ostacolare la quantità e / o qualità di isole isolate. Nel presente protocollo, ogni nuovo lotto di collagenasi enzima passa attraverso un controllo di qualità interno per determinare sia la quantità e la funzionalità delle isole prima che siano soggette a studiare. Pertanto, downstrapplicazioni EAM e molto di variazione devono essere considerati quando si sceglie un enzima per l'isolamento delle isole. Liberase ® (Roche), una miscela collagenasi purificata, è un'altra alternativa enzima digestivo che ha avuto successo in molti casi; in particolare, per ottenere elevate quantità di isolette isolate 24,25. Tuttavia, l'uso di Liberase non può essere utile per isolare isolotti funzionali, come può ostacolare in funzione vitro 26.

Esistono molte limitazioni nelle attuali procedure di isolamento delle isole e determinazione cAMP che possono ostacolare applicazioni a valle. Come precedentemente affermato, topi BTBR hanno un condotto molto fragile biliare comune, che aumenta la difficoltà di inflazione pancreatica e successivo isolamento isolotto. Pertanto, miscelazione di preparazioni isolotto di diversi topi possono essere richiesti, come molti in vitro, tra cui il saggio cAMP descritto, richiedono molte isolette per replica. Inoltre, utilizzando IBMX nel blocco saggio cAMPattività s fosfodiesterasi, dando una lettura-out della produzione di cAMP. L'aggiunta di IBMX potrebbe non essere consigliabile nei casi in cui la ciclistica della produzione di cAMP e degrado è importante per la segnalazione cellulare. Tuttavia, la rimozione IBMX da questo protocollo riduce significativamente il contenuto finale cAMP degli isolotti, che richieda l'aggiunta di molti altri isolotti per replica al fine di ottenere valori significativi cAMP nella VIA.

Il presente protocollo è uno strumento essenziale per un laboratorio isolotto di biologia o di coloro che sono interessati nel pancreas endocrino. Il componente cAMP a questo protocollo è solo uno dei molti esperimenti in vitro per capire come manipolazione isolotto attraverso vari trattamenti possono migliorare o secrezione di insulina smussato. Sebbene la maggior parte delle ricerche utilizzando isolotti si concentra principalmente sulla β-cellule di secrezione di insulina, altri tipi di cellule possono essere valutati per i loro rapporti dinamici all'interno dell'isolotto 4. In combinazione con altri in vitro ed in vivo modelli, isolotto sperimentazione farà luce sui meccanismi alla base delle malattie pancreatiche legate devastanti come il diabete e insulinoma. Ancora più importante, capire come gli agenti farmaceutici impatto diretto isolotti migliorerà l'efficacia del trattamento e l'aiuto nella traduzione di un modello in vivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar per l'assistenza tecnica di esperti sui protocolli descritti in questo lavoro. Inoltre, vorremmo riconoscere il mentoring di Christopher B. Newgard alla Duke University e Alan D. Attie presso l'Università del Wisconsin-Madison, con il supporto dei loro membri di laboratorio, che ci ha permesso il tempo e il supporto necessario per ottimizzare l' protocolli descritti. In particolare, ringraziamo Hans HOHMEIER, Danhong Lu, e Helena Winfield nel Laboratorio Newgard e Maria Rabaglia nel Laboratorio Attie per le discussioni produttive e consigli. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DK080845 sovvenzione e Juvenile Diabetes 594
Research Foundation concessione 17-2011-608 (a MEK)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets Sigma-Aldrich C7657
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X Invitrogen (Gibco) 14065-056
HEPES Sigma-Aldrich H3375
RPMI 1640 (powder) Invitrogen (Gibco) 31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7888
3/0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-30
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
0.8 mm Forceps   Fine Science Tools 11050-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15003-08
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe BD 309646
1 ml BD syringe BD 309628
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
27 G BD Needle 1/2" Length BD 305109
Sharpening Stone Fine Science Tools 29008-01
2-2-2-tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-25G
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) Sigma-Aldrich S6014
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M9397
Penicillin-Streptomycin Invitrogen (Gibco) 15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) Fisher Scientific SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich 5879-100MG

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