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Biology

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Published: June 25, 2014 doi: 10.3791/50374
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Summary

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Abstract

Glucemia no controlada es una característica de la diabetes mellitus y promueve morbilidades como la neuropatía, nefropatía, y retinopatía. Con la creciente prevalencia de la diabetes, tanto inmune tipo 1 y relacionada con la obesidad de tipo 2, los estudios dirigidos a la delimitación de la fisiopatología de la diabetes y los mecanismos terapéuticos son de importancia crítica. Los β-células de los islotes pancreáticos de Langerhans son responsables de la secreción de insulina apropiadamente en respuesta a concentraciones elevadas de glucosa en sangre. Además de la glucosa y otros nutrientes, las células β también son estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que se secretan en el intestino en respuesta a una comida y actúan sobre los receptores de células β que aumentan la producción de monofosfato de adenosina cíclico intracelular ( AMPc). Disminución de la función de las células β, la masa y la capacidad de respuesta de la incretina son bien entendidos para contribuir a la fisiopatología de la diabetes tipo 2, y también se están cada vez más vinculados widiabetes tipo 1 ª. El presente ratón aislamiento de islotes y el protocolo de determinación de cAMP puede ser una herramienta para ayudar a delinear los mecanismos que promueven la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas, en particular los que están mediadas por los receptores de la incretina o receptores que actúan a través de la modulación de la producción de cAMP intracelular relacionado. Si bien sólo se describirán las medidas de cAMP, el protocolo de aislamiento de islotes descrito crea una preparación limpia que permite también para muchas otras aplicaciones posteriores, incluyendo la glucosa estimula la secreción de insulina, [3 H]-timidina incorporación, la abundancia de proteínas, y la expresión del ARNm.

Introduction

El mantenimiento estricto de euglucemia es imperativo para prevenir la morbilidad como la neuropatía, nefropatía y retinopatía, que son todas las características de la patología de la diabetes 1 no controlada de tipo 1 y 2. Disminución de la función de las células β y la masa, tanto en la diabetes tipo 1 y 2 perturban las concentraciones de glucosa en la sangre 2. Considerando que el tipo inmunomediada 1 diabetes resulta de una devastadora pérdida de β-células productoras de insulina, la secreción de insulina de las células β alterada y la señalización de la insulina periférica en la diabetes tipo 2 en conjunto promueven la hiperglucemia, la dislipidemia y aumento de la producción hepática de glucosa, lo que finalmente se traduce en tanto la pérdida de la capacidad de la masa de células β y secretora de insulina a partir de β-células individuales 3. La comprensión de los mecanismos de las células β subyacentes en la progresión de la diabetes tipo 1 y 2 con suerte, dará lugar a nuevas terapias para prevenir y tratar estas enfermedades.

En ti vitromodelos de cultivo ncidencia, como el INS-1 y MIN6 inmortalizados líneas de células β, pueden ser herramientas útiles para la comprensión de las funciones específicas de las células β. Sin embargo, las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro de la isleta pueden ellos mismos regular la función de las células β. Por ejemplo, la influencia paracrina de glucagón (liberado de α-células) y la somatostatina (liberado de las células δ) en el aumento y la disminución de la secreción de insulina, respectivamente, demuestra la importancia de la proximidad de células de células en la respuesta endocrina 4. Por otra parte, los cruces brecha entre β-células potencian la liberación de insulina 5. Además, si bien se ha avanzado en la generación de líneas de insulinoma que mejor replican la respuesta fisiológica de los islotes aislados en glucosa (por ejemplo, el INS-1 derivado de 832/13 y 832/3 líneas celulares), su capacidad de respuesta de la glucosa aún difiere de rata normal islotes 6,7. Por otra parte, la respuesta de estas líneas celulares de insulinoma clonalesa péptido-1 (GLP-1) agonistas de tipo glucagón puede diferir drásticamente el uno del otro, así como de los islotes normales 6. Por lo tanto, las líneas de células inmortalizadas pueden no representar el mejor modelo para ensayar agentes que influyen en la producción de cAMP.

En contraste con las líneas celulares de insulinoma-derivado, el estudio de la función de células β únicamente en modelos animales enteros ofrece su propio conjunto de complicaciones. Uno de los mayores retos en el trabajo con el tejido endocrino es la medición de la concentración exacta de la hormona liberada. En concreto, el hígado juega un papel importante el metabolismo de la insulina, y el flujo de sangre páncreas va directamente al hígado. Por lo tanto, una medición de la insulina en plasma no puede representar con precisión las cantidades de insulina secretada por el páncreas en sí o el impacto de diferentes tratamientos sobre la tasa de secreción de insulina 8. Además, el metabolismo renal de glucagón puede limitar la fiabilidad de la producción de glucagón de las células de los islotes α-9. Por lo tanto, el aislamiento de islotes primarios de ratón para la experimentación in vitro proporciona una comprensión más precisa de cómo el islote está respondiendo a los estímulos específicos para complementar las mediciones realizadas in vivo.

El presente protocolo para el aislamiento de islotes de ratón es un protocolo bien establecido utilizado por varios grupos (con ligeras modificaciones que pueden ayudar a aumentar el éxito) 10,11. Además, la determinación de la producción de cAMP permite una lectura directa de la capacidad de respuesta de la incretina de las células β. En conjunción con la medición de AMPc, contenido de proteína y la secreción de insulina también se puede cuantificar a partir de la misma preparación de muestras de cAMP, lo que ayuda a determinar si un defecto en la función de las células β se encuentra proximal o distal a AMPc 10. El contenido de cAMP final y aplicación secreción de insulina en este protocolo puede ser una herramienta muy poderosa para la comprensión de la influencia de los componentes farmacéuticos y alimenticios, entre otross, el cAMP y la secreción de insulina. Además de la estimulación de glucosa sola, otros compuestos pueden ser utilizados para medir los cambios en el AMPc y la secreción de insulina 10,11.

Por último, aunque la insulina es la principal hormona que del ensayo de islotes aislados, otras hormonas, tales como glucagón y somatostatina, así como citoquinas, eicosanoides, y monofosfato de adenosina cíclico, puede también ser medido, ya sea mediante un ensayo de estimulación transitoria o por cuantificación de sus niveles en el medio de cultivo 12. Por último, aunque fuera del alcance de este manuscrito, aislamiento de islotes con el método de aislamiento de colagenasa descrito permite la preservación de los islotes de manera que muchas otras aplicaciones posteriores pueden llevarse a cabo, tales como el trasplante de islotes, el aislamiento de ARN para cuantitativa en tiempo real PCR o análisis de microarrays, proteínas aislamiento para el Western Blot, la incrustación de los islotes y de formación de imágenes de inmunofluorescencia, y la incorporación de [3H]-timidina como una medida de la replicación de células de islotescatiónico, algunos de los cuales se han descrito en artículos anteriores JoVE 13-16. En general, siguiendo el procedimiento de aislamiento de los islotes se describe en el protocolo puede proporcionar un investigador con información útil e importante para el desarrollo de terapias y promover el descubrimiento de medicamentos destinada a mejorar la función de las células β.

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Protocol

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y organismos reguladores. El protocolo que se está demostrado se llevó a cabo bajo la dirección y aprobación del Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison.

1. Preparación de Soluciones

  1. El método de la eutanasia en este protocolo es desangramiento bajo anestesia Avertin (para una revisión de las alternativas, ver Discusión). Para hacer Avertin, añadir 0,625 g (1,25% o 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoetanol a 1,25 ml de 2-metil-2-butanol en un tubo cónico de 15 ml y se calienta a 37 ° C durante 20-30 min. Agite la solución a temperatura alta durante 10 a 15 segundos a la vez para disolver completamente el 2-2-2 tribromoethanol. Una vez completamente disuelto, añadir la solución a 48,75 ml de la doble H 2 O destilada, se filtra a través de un filtro de 0,45 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml, 50 ml envolver las cónicasal tubo en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de un mes. Traiga el tubo a RT antes de inyectar ratones.
  2. Para hacer que la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), completar 1 L 1x HBSS desde un 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) en doble H 2 O destilada, añadir 0,35 g (4,2 mM) Nacho 3, y la tienda a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. Para cada ratón, se requerirán 105 ml de esta solución (además de 5 a 10 ml adicionales de error pipeteo) para el aislamiento de los islotes.
  3. Los islotes son muy susceptibles al daño hipóxico; Por lo tanto, HBSS se burbujeó con 95% O2 / 5% de CO 2 para imitar las concentraciones de O 2 en la sangre. Mezclas de gases especiales se pueden comprar y una estación de burbujeo establecieron con una pipeta Pasteur conectada a un tubo flexible. Después de burbujear la cantidad requerida de HBSS con 95% O2 / 5% de CO 2 durante 15 min, añadir BSA de calidad para RIA 0,02% (albúmina de suero bovino) por volumen y mantener en hielo para la remainder del aislamiento de islotes.
  4. Para la preparación de Ficoll, pesar 32,5 g de Ficoll en un vaso de precipitados de 400 ml, añadir 80 ml de HBSS, y se agita a 500-700 rpm durante 30 min. Una vez disuelto, se vierte la solución de Ficoll en un 250 ml de cilindro graduado y añadir HBSS hasta la marca de 130 ml en el cilindro graduado para crear una solución de Ficoll 25%. Cubra la parte superior de la probeta graduada con dos porciones de Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) y agitar enérgicamente varias veces.
  5. Para una solución de Ficoll 23%, 20,5%, y 11%, añadir 27,6, 24,6, y 13,2 ml de la 25% de Ficoll, respectivamente, a 50 ml de tubos cónicos. A continuación, llevar a cada solución hasta un total de 30 ml con HBSS y agitar bien para mezclar. Las cuatro soluciones Ficoll deben almacenarse a 4 ° C y son buenos para un máximo de 2 semanas.
  6. Solución de colagenasa que es adecuado para el aislamiento de islotes activos se preparó a partir de la colagenasa aislada de Clostridium histolyticaum (mesa de Materiales). Cada lote tiene que ser probado para la eficacia de la enzima. Típicamente, la colagenasa se utiliza en 0,3-0,5 mg por ml de HBSS. La utilización de concentraciones de la enzima en ese rango (por lo general 3 concentraciones diferentes), determinar la calidad y cantidad de los islotes aislados de ratones o compañeros de camada para establecer la concentración de enzima de trabajo de la misma edad.
  7. Una vez que la concentración correcta se determina, cada ratón requiere 35 ml de colagenasa en HBSS durante todo el protocolo de aislamiento. Agitar la colagenasa en HBSS a disolverse. Inmediatamente antes de la cirugía, antes de cargar una jeringa de 5 ml con solución de colagenasa, colocar la cánula y quitar las burbujas de aire, y dejar en hielo hasta que se necesite.
  8. Los medios de cultivo de los islotes para O / N de incubación es de un RPMI 1640 suplementado medios de comunicación. Para la solución madre, disuelva una RPMI 1640 paquetes (Gibco, Nueva York) en 1 L de doble H 2 O destilada y añadir 1,19 g de HEPES (5 mM) y 2 g Nacho 3 (24 mM). Ajustar el pH a 7,4,Se esteriliza con filtro, y se almacena a 4 ° C en la oscuridad.
  9. Para los medios de comunicación complementado, añadir 10% de SFB y 100 UI/100 g / ml de penicilina / estreptomicina, respectivamente, a los valores medios RPMI 1640. Si se desea una concentración diferente de la glucosa, glucosa libre de medio RPMI 1640 y se pueden utilizar una concentración específica de la glucosa se pueden añadir.
  10. Para una población de Krebs Ringer Tampón de bicarbonato (Krebs), añadir los siguientes ingredientes para duplicar el agua destilada en las siguientes concentraciones: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), sulfato de magnesio 4 (1,18 mM), KH 2 PO 4 (1,18 mM ), nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM), y CaCl2 (2,52 mM) a pH 7,4. CaCl2 debe añadirse última y esta solución se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 2 semanas.
  11. Para realizar una acción de trabajo de Krebs, primero de gas con 95% de O 2/182 5% de CO 2 durante 10-15 min con una pipeta Pasteur a 37 ° C seguido de la adición de 0,5% de BSA de calidad para RIApor volumen. A continuación, se añadió glucosa a la concentración deseada para el ensayo in vitro.

2. Preparación de Herramientas

  1. Ligeramente embotar la punta de 30 - y 27-G agujas usando una piedra de afilar para redondear la punta afilada. Ponga una curva de 45 grados en la aguja cerca de ¼ de pulgada de la punta con un par de alicates. Tenga cuidado de no apretar demasiado duro, que cerrar el diámetro interior de la aguja.
  2. Cortar el hilo 3/0 sutura de seda en aproximadamente longitudes de 4 pulgadas, una para cada ratón.
  3. Cubrir la base del microscopio de disección con plástico y cinta hacia abajo.
  4. Corta varios trozos de papel de banco absorbente, aproximadamente 3 x 5 pulgadas de tamaño, por lo menos 2 por ratón.

3. Preparación del ratón

  1. Llene una jeringa de 1 ml con 1 ml de Avertin.
  2. Se inyecta la solución Avertin por vía intraperitoneal a aproximadamente 40 l / gramo de peso corporal.
  3. Después de que el ratón no longer responde a la cola o pellizcos de las patas traseras, transfiera cuidadosamente a la estación de trabajo del microscopio de disección.
  4. Con el ratón en la posición supina y su cabeza mirando hacia distal, rocíe el ratón con etanol acuoso al 70%. Asegúrese de utilizar una cantidad adecuada de etanol al 70% para limitar la cantidad de piel en la cavidad torácica al descubierto.

4. Apertura de la cavidad torácica

  1. Apriete la piel y de la piel del ratón entre las dos patas traseras y hacer un corte inicial a través de la epidermis, la dermis y la membrana subyacente.
  2. Mientras que todavía pellizcar la piel y la membrana subyacente, cortar hacia la extremidad delantera en ambos lados del ratón teniendo cuidado de evitar el corte de cualquiera de los órganos internos.
  3. Doble la piel y la solapa membrana sobre la caja torácica y quitar el apéndice xifoides para permitir un acceso más fácil al páncreas para la inflación.
  4. Reorientar el ratón con frente a la cabeza proximal y mover los órganos internos hacia el lado derecho de la obra stación para revelar la aorta descendente.
  5. A menos que el tejido arterial se debe desechar, la aorta descendente se puede cortar para completar la eutanasia. Podrá tomar el exceso de sangre con papel de banco o un Kimwipe para facilitar el acceso a la vía biliar.

5. Al inflar el Páncreas

  1. Con un microscopio de disección, vuelva a colocar el intestino delgado por lo que el conducto biliar común forma una línea perpendicular con la cabeza del ratón.
  2. Tome una pinza y agarrar el intestino delgado y encontrar el esfínter de Oddi (esfínter de ampolla) en el extremo del conducto biliar común, que ensancha hacia fuera sobre el intestino delgado desde el conducto biliar, formando un triángulo blanco en el intestino de color rosa. Una vez que el esfínter de Oddi ha sido localizado, tómese # 5 pinzas Dumont y deslice la punta por debajo del conducto biliar común tan cerca del intestino delgado como sea posible, teniendo cuidado de no perforar el conducto.
  3. Después de la perforación a través del intestino delgado y tejido conectivo, utilizar elpunta del Dumont fórceps para agarrar el hilo de sutura y tire de ella bajo el conducto biliar común. Ate el conducto biliar común tan cerca del esfínter de Oddi como sea posible, asegurándose de que el nudo se tensa para evitar fugas.
  4. Tome ambos extremos de la sutura y tirar hacia la cola para poner un poco de tensión en el conducto biliar común. Usando una mano libre, hacer una pequeña incisión con las tijeras micro en el conducto biliar común, justo por encima de la última bifurcación en el hígado. Nota: Es importante no cortar demasiado cerca del esfínter de Oddi, ya que esto podría resultar en una inflación parcial del páncreas y evitar que se corte a través del conducto biliar común, ya que también dará lugar a una pobre inflación.
  5. Mientras mantiene los dos extremos de la cadena con el conducto biliar común tensa, retire la jeringa / cánula que ha sido pre-cargado con 5 ml de solución de colagenasa el cubo de hielo, redactada de la jeringa e inserte la aguja 30 G despuntado en el corte conducto biliar común, teniendo cuidado de no perforar la a través de la waLL del conducto. Si la aguja 30 G no es lo suficientemente ancho para la vía biliar para formar un sello alrededor, quitar y reemplazar con el romo 27 G aguja.
  6. Mientras sostiene la aguja en su lugar, liberar la sutura y recoger la jeringa de 5 ml. Lentamente presione el émbolo de la jeringa. Nota: Si la aguja se ha introducido con éxito en el conducto biliar común, se expandirá.
  7. Continuar presione el émbolo lenta y dejar fuera en una manera pulsátil hasta que la primera parte del páncreas se infla, seguido por la presión constante suave hasta que el páncreas ya no infla. Nota: La mayoría de los páncreas tienen 3-5 ml antes de empezar a gotear. Además, una inflación exitoso tendrá una distribución uniforme de tejido exocrino y la parte del páncreas en la parte superior del estómago se infla.
  8. Retire la aguja de la vía biliar común y un conjunto de al lado.

6. Eliminación Páncreas

  1. Tome unas pinzas en una mano y unas tijeras curvas enla otra. Usando las pinzas, sujete el intestino delgado en el esfínter de Oddi. Con las tijeras cerradas, utilizar la punta a parte separada del páncreas en el intestino delgado.
  2. Separe las tijeras, aparte de ampliar la brecha entre el intestino delgado y el páncreas.
  3. Coloque la "V" de la tijera, donde el intestino delgado y el páncreas se conectan entre sí en el lado derecho de la brecha que se acaba de hacer. Usando las pinzas tire suavemente el intestino delgado más allá de las tijeras para extirpar el páncreas.
  4. Seguir trabajando por el intestino delgado con el tejido conectivo de color rosa. En este punto, levante el intestino delgado cerca de donde se une con el estómago y el páncreas cortar lejos del resto del intestino delgado. Nota: Tenga cuidado de no cortar el páncreas, ya que puede empezar a desinflarse.
  5. Agarrar suavemente la parte del páncreas une al estómago con unas pinzas (fórceps planas funcionan mejor). Mientras tira suavemente del páncreas, utilizar la curvad tijeras para cortar lejos en las conexiones entre el páncreas y el estómago.
  6. Localice el bazo y sostenerlo con las pinzas por encima del páncreas. Tome las tijeras curvas y cortar las conexiones entre el bazo y el páncreas.
  7. Encuentra donde el páncreas está unido al intestino grueso. Levante el intestino grueso con unas pinzas y usar la punta de las tijeras para perforar. Extender las tijeras entre sí como antes para generar un espacio entre el intestino grueso y el páncreas.
  8. Mantenga el intestino grueso con fórceps: esto se traducirá en el páncreas caer, exponiendo sus conexiones precisas para el intestino grueso. Corta distancia de las conexiones restantes.
  9. Encontrar el tejido conectivo de color rosa adherido al páncreas y el intestino delgado y cortar tan cerca de los páncreas como sea posible. Nota: Si la perforación de la páncreas es una preocupación, se aconseja para cortar más cerca del intestino delgado como el tejido conectivo se filtró a cabo en pasos posteriores.
  10. Trab tanto del páncreas como sea posible y levantar suavemente. Con tijeras curvas, corte los contactos que persisten entre el páncreas y la cavidad torácica para eliminar totalmente el páncreas. Nota: El páncreas todavía deben ser inflados si se remueve correctamente.
  11. Almacenar el páncreas eliminado en ~ 2,5 ml de solución de colagenasa en un tubo cónico de 50 ml en hielo hasta que todos los otros páncreas han sido inflados y eliminado debido a que el experimento.

7. Lavadora

  1. Tome todos los páncreas aislados y moverlos para separar 50 ml tubos cónicos que contienen cada uno 25 ml de solución de colagenasa reciente
  2. Coloque los tubos de 50 ml cónicos rectos de un 37 ° C baño de agua agitando capaz de oscilar a 220-250 rpm, con el agitador apagado.
  3. Gas cada tubo cónico de 50 ml con 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 5 min con una pipeta Pasteur.
  4. Vuelva a tapar cada tubo herméticamente y colocar de lado en el agua en agitaciónbaño de debajo de la superficie del agua. Agitar a 220-250 rpm durante 20 segundos, cada dos minutos, hasta 16 minutos a partir de las 6 min. (Agitar a los 6, 8, 10, 12, 14 y 16 min)
  5. Transferir inmediatamente los tubos a una centrífuga a temperatura ambiente para dar una vuelta rápida. Traiga la centrífuga hasta 1.500 rpm (400-500 g) y se apagará inmediatamente.
  6. El uso de una trampa de vacío, aspirado de alrededor de 22,5 ml de la solución de colagenasa sin perturbar el sedimento. Lavar con 10 ml de HBSS y agitar suavemente para disolver el precipitado.
  7. Realice otra vuelta rápida a temperatura ambiente hasta 1500 rpm (400-500 g).
  8. Aspirar unos 10 ml de la solución, de nuevo sin perturbar el sedimento.
  9. Lavar con otros 10 ml de hielo frío HBSS y vortex suavemente para romper de nuevo el pellet. Repita el giro y aspirado rápido 10 ml de la solución.
  10. Agite suavemente el sedimento en los restantes 2,5 ml de solución de HBSS. Verter solución a travésun 1,000 m de malla en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Esto eliminará la gran restos de tejido no digerido por la colagenasa.
  11. Enjuague el viejo tubo cónico de 50 ml con 2,5 ml de hielo frío HBSS. Utilizar una pipeta Pasteur para enjuagar los lados del tubo a fondo antes de transferir el 2,5 ml de HBSS a través de la malla en los nuevos 50 ml de tubo cónico.
  12. Realice otra vuelta rápida a temperatura ambiente a 1.500 rpm (400-500 g) para sedimentar el tejido.
  13. Aspirar todo el HBSS por la inclinación del tubo hacia la trampa de vacío. Nota: Es muy importante para no perturbar el sedimento como esto se traducirá en la pérdida de los islotes. Si la pastilla está suelto o comienza a moverse hacia la trampa de vacío, detener la aspiración de la solución y volver a sedimentar el tejido y luego continuar para aspirar la solución restante.
  14. Una vez que todo el HBSS ha eliminado, añadir 4,8 ml de solución de Ficoll 25% y agitar para disolver el precipitado.
  15. Capa con cuidado 2,4 ml de 2Solución de Ficoll 3% en la parte superior de la solución de Ficoll 25% mediante la adición de la solución de Ficoll 23% para el lado del tubo cónico de 50 ml. Para garantizar incluso en capas, girar el tubo cónico de 50 ml al añadir la solución de Ficoll.
  16. Repita el proceso de estratificación de 20,5% y luego 11% de soluciones de Ficoll. Nota: Si 4 capas distintas no están presentes, agregue HBSS hasta la marca de 50 ml y se invierta el tubo 4-6 veces o hasta que el gradiente de Ficoll ya no existe. Re-sedimentar el tejido y vuelva a intentar los pasos 07.14 a 07.16.
  17. Haga girar el tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente a 1820 rpm (800 g) durante 15 min.
  18. Vierta todo el Ficoll en un tubo cónico de 50 ml fresca, teniendo cuidado de dejar el sedimento de tejido exocrino atrás. Agregue el hielo frío HBSS hasta la marca de 50 ml y se invierta el tubo 4-6 veces para mezclar el Ficoll y HBSS juntos.
  19. Haga girar el tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente a 1820 rpm (800 g) durante 5 min.
  20. Aspirar con cuidado la mayor parte de la mezcla de HBSS / Ficoll utilizando un tra vacíop. No perturbar el sedimento ya que está suelto y se puede aspirar fácilmente.
  21. Tome una pipeta Pasteur y transferir el precipitado a un tubo de la cultura desechable.

8. Recogiendo Islotes

  1. Añadir 5 ml de medio de picking (es decir. Complementado RPMI 1640 o Krebs Ringer bicarbonato de búfer) en el tubo de la cultura desechable. Nota: Los medios de comunicación de picking variarán dependiendo de las aplicaciones posteriores.
  2. Deje que los islotes se depositan en la parte inferior del tubo de cultivo durante 5 min. Transferir utilizando una pipeta Pasteur a un 15 mm por plato Petri de poliestireno de 60 mm. Nota: Es importante utilizar una placa de Petri ya que estos no se tratan y se evitará que los islotes de adherido a la cápsula.
  3. En una separada de 15 mm por 60 mm de poliestireno caja de Petri, añadir 5 ml de medio de cultivo de los islotes de ratón (100 ml RPMI 1640 Stock Media, 10 ml FBS inactivado por calor, 1 ml penicilina / estreptomicina, filtro esterilizado).
  4. Con la ayuda de un microscopio de disección con backligcapacidad ht, utilice una pipeta P-20 para recoger los islotes en la placa de Petri que contiene los islotes medios de cultivo, teniendo cuidado de evitar la transferencia de restos de tejido acinar. Cuando a contraluz, aparecerá islotes de color marrón-oro y su membrana externa pueden brillar, mientras que el tejido acinar aparecerá de color gris claro y sin brillo. Si la preparación de los islotes contiene una gran cantidad de residuos, es aconsejable recoger a mano islotes dos veces en medio fresco. La reducción de la contaminación de los desechos limitará aglutinación islote después de una incubación durante la noche. Adición de DNAsa (3000 U / ml) al tampón de digestión también puede ayudar a limitar la formación de grumos de los islotes (JWJ, observación personal). Nota: Es importante tener en cuenta el número de islotes aislados para planificar experimentos posteriores.
  5. Incubar los islotes de O / N en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.

9. Ensayo de AMPc

  1. Etiqueta de 1,7 ml de tubos de microfuga, uno para cada repetición del ensayo. Nota: Los ensayos de cAMP deben tener por lo menos duse prefieren complica para cada condición de tratamiento, pero más repeticiones por tratamiento.
  2. Después de la desgasificación de Krebs Ringer Tampón de bicarbonato durante 15 min con 95% de O2 / 5% de CO 2 con la pipeta Pasteur, añadir 0,5% de BSA de calidad para RIA y una concentración final de glucosa de 1,7 mM (solución de preincubación). A continuación, añadir 1 ml de la Krebs recién gaseados a cada tubo de microcentrífuga. Se requieren dos ml de Krebs por tubo para los puntos de pre-incubación y tiempo de tratamiento; sin embargo se recomienda para preparar al menos 5-10 ml adicional.
  3. Agitar los islotes en el medio de la placa de Petri, y el uso de una pipeta P-20, mano-recoger los islotes a un nuevo 15 mm por 60 mm de placa de Petri de poliestireno que contiene 5 ml de la solución de preincubación para lavar el medio de cultivo que contiene glucosa- de los islotes.
  4. El kit de ensayo de cAMP utilizado es el GE Healthcare cAMP directo Biotrak EIA. El prococol utilizado es una modificación del descrito por "meas AMPc intracelulardición utilizando el procedimiento de EIA no acetilación con los nuevos reactivos de lisis, "y ha sido optimizado para su uso con el mínimo número de islotes por tubo, lo que permite un mayor número de condiciones de tratamiento y repeticiones técnica. El uso de un P-20 pipeta al menos 13 islotes en cada tubo desde el paso 9.2, manteniendo el tamaño de los islotes coherencia entre tubos, con 1 ml de tampón de pre-incubación. Nota: El aumento del número de repeticiones es más beneficioso que el número de islotes por tubo. Sin embargo, si hay suficientes islotes para aumentar el número de islotes por tubo de manera uniforme, es recomendable hacer así, hasta 25-50 islotes por tubo.
  5. Con los tapones de los tubos de microcentrífuga abierta, transferir a una incubadora a 37 ° C fijado en el 5% de CO 2 y se incuba durante 45 min a normalizar la secreción de insulina de los islotes a un nivel básico.
  6. Mientras que las muestras están incubando, preparar los tratamientos (es decir, 8 mm, 11,1 mm, 16,7 mM de glucosa, etc) en el fr Krebs gaseadosom paso 9.2. en tubos de 15 ml cónicos, con 1 ml adicionales para tener en cuenta cualquier error de pipeteado. Añadir 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) hasta una concentración final de 200 mM. IBMX es un inhibidor general de la fosfodiesterasa que bloquea la degradación de AMPc, lo que permite la acumulación de AMPc en la célula a medida que se produce. (Nota:.. Este es un verdadero ensayo de producción de cAMP, consulte la sección de discusión de casos en los que la medición de la producción de cAMP puede no ser deseable Si IBMX se deja fuera del análisis, se requerirán más islotes por tubo con el fin de obtener datos de cAMP en el intervalo lineal de la curva estándar).
  7. Después de los 45 min de preincubación, retire los tubos de microcentrífuga de la incubadora, la tapa y el pulso-vórtice cada muestra (menos de 0,5 segundos). Esto es para mezclar el gradiente de la insulina que probablemente se ha generado debido a los islotes de ser concentrada en la parte inferior del tubo. Se debe tener cuidado de no agite con demasiada dureza, ya que esto podría afectar negativamente a la estabilidad de los islotes (Nota: Convocadotubos con islotes pueden posaron o invertidas si no es posible a pulso-vórtice suavemente suavemente. Estas opciones se sumará el tiempo para el ensayo, lo que debería tenerse en cuenta al planificar el experimento).
  8. Transfiera cada tubo a una centrífuga de mesa (RT) y girar hasta que los islotes alcanzan 10.000 rpm (7,000-7500 g) y luego se apagan inmediatamente.
  9. Utilizar una pipeta P-1000 para eliminar la mayor parte de la de Krebs en cada tubo de microcentrífuga, dejando aproximadamente 10-15 l de Krebs en el sedimento de los islotes. Utilizar una pipeta P-20 para eliminar la parte más cercana el sedimento de los islotes. Si se altera de pellets, pipetear el de Krebs de nuevo en el tubo y volver a girar.
    (Nota: Si el experimentador le resulta demasiado difícil de quitar todo el Krebs del sedimento islote sin perturbarla, el último 10-15 l se puede dejar activado y representó en el volumen total más tarde en el protocolo.
  10. Obtener una cantidad adecuada de nitrógeno líquido en un recipiente aislado para romper congelar las muestras después de la incubación.
  11. Tomar las muestras de la incubadora, la tapa y agitar rápidamente (menos de 0,5 seg) girar los tubos de microcentrífuga en una centrífuga de mesa (RT) de hasta 10.000 rpm (7,000-7500 g), y luego se apaga inmediatamente. Si la insulina u otro metabolito es una aplicación aguas abajo lo desea, utilice una pipeta P-1000 para recoger una alícuota de medio en un tubo de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C hasta su posterior análisis. Si no se recogieron los medios de estimulación, que puede ser desechada.
    (Nota: IBMX es un fuerte potenciador de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de GSIS medio de estimulación de cAMP no pueden representar con precisión el verdadero efecto de los tratamientos específicos en GSIS, especialmente si estos efectos son sutiles.).
  12. Repita el paso 9.9 para quitar tanto medio de estimulación de lo posible y sin perturbar el sedimento de los islotes. Snap congelar el sedimento de los islotes en nitrógeno líquido una vez que hay menos de 10-15 l de Krebs a la izquierda en el sedimento de los islotes. Una vez que todo elLas muestras han sido instantánea congelada, almacenar a -80 ° C hasta la medición de cAMP.
  13. En el día de la determinación de AMPc, la preparación de los nuevos reactivos de lisis de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Añadir 200 ml de reactivo de lisis 1B a cada tubo de microcentrífuga y agitar a toda velocidad durante 30 segundos. Deje que los tubos se sientan en hielo durante 10 min, vórtex cada 2 min durante 30 segundos. (Nota: El protocolo recomienda llevar a cabo un análisis microscópico con azul de tripano para asegurar la lisis celular, pero esto no se realiza para islotes).
  14. Preparar los estándares de trabajo y establecer la microplaca EIA exactamente como se describe en el protocolo del fabricante. Después de que el sustrato de la enzima se ha incubado con la microplaca durante 30 min, realizar el paso de ácido sulfúrico 1,0 M opcional, y determinar la absorbancia de los pocillos de microplacas a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
  15. Resultados de AMP cíclico se registran como fmol / pocillo. Esto debe ser normalizado al volumen total de la muestra original (200 l + cualquierKrebs residual dejado en los islotes desde el paso 9.9). A continuación, los resultados pueden o bien ser normalizados para el número total de islotes, dando AMPc producido fmol / islote, o muestras de lisado puede ser sometida a ácido bicinconínico de ensayo de proteínas (BCA) para normalizar los resultados a la proteína celular total (dando proteína fmol / mg) . Este último se recomienda cuando los tamaños de los islotes son incompatibles entre las muestras, y puede ser un sustituto para el tamaño de los islotes. El kit de ensayo de proteínas Pierce BCA se ha utilizado con éxito en este protocolo y sólo requiere 25 ml de muestra. Las normas de la BSA deben prepararse en el reactivo de lisis 1B del kit de ensayo de cAMP.

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Representative Results

Para asegurar un alto rendimiento durante el aislamiento de los islotes, las técnicas quirúrgicas descritas en el protocolo deben ser seguidos de cerca. Aunque las técnicas que aquí se presentan se adaptarán a cada laboratorio, hay algunos pasos críticos que conduzcan a un aislamiento exitoso. Con el fin de hacer que el conducto biliar común de fácil acceso, se recomienda que los órganos ser desplazados hacia el lado derecho del ratón (Figura 1). Además, esto permitirá que el páncreas se infla con una cantidad más pequeña de la resistencia ya que habrá menos expansión restringir peso. Otro paso fundamental para maximizar el rendimiento de los islotes es la ligadura del conducto biliar común cerca del esfínter de Oddi (Figuras 2A-C). La ligadura más lejos del esfínter de Oddi puede resultar en una inflación parcial mediante la reducción de la cantidad de solución de colagenasa de entrar en el conducto pancreático principal. También, un nudo tenso evitará solución de colagenasa de entrar en el intestino.

<p class = "jove_content"> Una incisión adecuada en el conducto biliar común debe estar ubicado lo suficientemente lejos de la bifurcación del hígado, pero lo suficientemente cerca como para que la inflación de páncreas máxima (Figura 3). Una incisión hecha demasiado cerca de la bifurcación puede dar lugar al flujo de la solución de colagenasa en el hígado. Cuando la solución de colagenasa entra en el hígado, perderá su color rojo oscuro y comenzar a girar blanquecino. Si esto ocurre, retire la aguja y trate otra canalización más lejos del hígado. Además, la incisión conducto biliar común sólo debe ser parte del camino a través del conducto (aproximadamente 50%). Completamente esquila el conducto hará que sea difícil para sellar el conducto alrededor de la punta de la aguja. Una incisión apropiada dará lugar a un cierre completo del conducto alrededor de la aguja, produciendo suficiente presión para llenar el tanto biliar común y conductos pancreáticos (Figura 4A). También es importante asegurarse de que la aguja ha entrado en el conducto biliar común y no la vaina circundante.Una vez que la aguja ha sido insertada correctamente, 5 ml de la solución de colagenasa deben llenar el páncreas, la creación de un tejido marbleized.

El proceso de eliminación de páncreas se debe realizar con delicadeza para promover el rendimiento de los islotes máxima (Figura 5). Piercing el páncreas puede dar lugar a una deflación y la pérdida de solución de colagenasa, reduciendo el rendimiento de los islotes. Cortar el páncreas próximas al tejido conectivo y otros órganos evitará la deflación. También, otro tejido de cosecha, tal como el tejido conectivo, junto con el páncreas no es un problema, ya que se eliminará en etapas posteriores. Un páncreas eliminado correctamente permanecerán infladas después de la escisión antes de la digestión colagenasa (Figura 6).

Capas distintas en el gradiente de Ficoll conducirán a una preparación de islotes limpia y crear un entorno más fácil para recoger islotes (Figura 7). El gradiente asegura la separación de islotes derestos de células y el tejido conectivo que permanece después de la filtración la digestión y la pantalla de malla. Además, este paso es crucial para la selección, islotes sanos limpios para aplicaciones posteriores. Específicamente, islotes sanos serán de forma esférica y tiene un marrón de oro al centro de color marrón oscuro (Figura 8). Nota: Los islotes de ratones diabéticos serán mucho más pálida en color, que corresponde con una disminución de contenido de insulina, y pueden ser mejor distingue de tejido acinar por su forma, el brillo, y su red visible de los capilares. Cualquier islotes conectados a tejido acinar no se deben utilizar y se deben desechar. Por otra parte, los islotes más grandes que desarrollan un centro oscuro, necrótico, después de una noche de incubación deben desecharse ya que no funcionan correctamente.

Como se describe en la introducción, la producción de cAMP es un componente importante de la función de las células β; en particular, con relación a la acción de la incretina. Uno de los beneficios para el protocolo descrito en este reunió Hod es que se puede obtener al mismo tiempo la producción de AMPc y los datos de secreción de insulina estimulada por glucosa. Típicamente, el impacto de un agente en la producción de cAMP se correlaciona directamente con su impacto sobre la secreción de la insulina 17. Para los experimentos simples, esta regla se mantiene bastante bien (véase la Figura 9 para un ejemplo). En el presente protocolo, utilizamos IBMX (un inhibidor de la fosfodiesterasa) en nuestros tratamientos para prevenir el catabolismo de cAMP, dando a la producción total de cAMP.

Figura 1
Figura 1. El desplazamiento de los órganos internos. Colocación de los órganos internos en el lado derecho del ratón crea un ambiente de trabajo más fácil y permite la sala de páncreas se expanda durante el inflado.

Figura 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
Figura 2. Atar el esfínter de Oddi (AC). Representa aquí es la entrada del conducto biliar común hacia el intestino delgado en el esfínter de Oddi. Atar el conducto biliar común en el esfínter de Oddi impide solución de colagenasa entren en los intestinos.

Figura 3
Figura 3. Incisión del conducto biliar común. Lo mejor es hacer un corte en el conducto biliar común ligeramente distal a la bifurcación en el hígado para prevenir el flujo de la solución de colagenasa en el hígado.

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Figura 4. Canulación del conducto biliar común por un romo 30 G de la aguja y la inflación páncreas. A) El G aguja 30 se inserta en el conducto biliar común, la creación de un sello alrededor de la punta de la aguja. Es importante revisar y tomar nota de que la aguja se ha insertado en el conducto biliar común y no la vaina que rodea. Una aguja correctamente insertado tendrá una apariencia opaca. B) Una inflación páncreas adecuada llenará con aproximadamente 3-5 ml de solución de colagenasa y tienen un aspecto jaspeado.

La figura 5
Figura 5. La eliminación del páncreas. A) La incisión inicial hecho con un par de tijeras de curvado se produce cerca del esfínter de Oddi. El rem inicialovalada comienza en la dirección de ser el estómago cuidado de no perforar el páncreas. B) El paso final es la eliminación del páncreas a partir del tejido conectivo en el intestino delgado y los últimos conexiones a la cavidad peritoneal.

La figura 6
Figura 6. El páncreas inflados. Una eliminación páncreas exitoso producirá un páncreas perfundido con la solución de colagenasa. Pobre extirpación deja una, páncreas más pequeño desinflado.

La figura 7
Figura. 7 Cuatro capas del gradiente de Ficoll. Las cuatro capas distintas representan un diferencialdensidad Ficoll t del 25% en la parte inferior a un 11% en la parte superior. La superposición distinta es imprescindible para eliminar los desechos y el desuso exocrina de los islotes.

Figura 8
Figura 8. Selección Islet. Islotes sanos tienden a tener un color dorado a marrón oscuro con una forma esférica redonda y no están conectados a acinares tejido. Después de una incubación durante la noche (16-20 h) un centro necrótico se desarrolla en los islotes más grandes, que deben ser excluidos de los experimentos.

Figura 9
Figura 9. Resultados de alta calidad de producción de cAMP representativos, lo que demuestra que insul secretadaen se puede medir desde el medio de la estimulación de cAMP. A) islotes aislados de tipo salvaje o el gen de ratones knockout se estimularon con 11,1 mM de glucosa y la producción de cAMP intracelular se midió y se normalizó para la proteína celular total. B) insulina secretada se midió usando un ELISA estándar de insulina, y también normalizada total celular proteína. En muchos casos, el cambio en la producción de cAMP se correlaciona directamente con el aumento en la secreción de insulina estimulada por glucosa. n = 3 para cada grupo; *, P <0,05. Esta figura es una adaptación de una investigación publicada en Kimple et al 10.

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Discussion

Con el predominio de la diabetes proyectados para afectar el 7,7% de la población mundial, la obligación de aplicar técnicas de investigación novedosas es imprescindible tanto para comprender y tratar la diabetes 18. El actual aislamiento de islotes es un protocolo bien establecido utilizado para la experimentación in vitro y se ha presentado con anterioridad, con ligeras modificaciones 11,14,16. Aunque la secreción de insulina es una aplicación común aguas abajo de islotes aislados, centrándose en los componentes aguas arriba, tales como cAMP, pueden ayudar a delinear los mecanismos que potencian la producción y secreción de insulina.

La elección de la eutanasia debe hacerse cuidadosamente para asegurar tanto el tratamiento humanitario de los animales de laboratorio, así como la integridad de las mediciones experimentales. Para el aislamiento de los islotes, desangramiento bajo anestesia es nuestro método preferido para la eutanasia, ya que permite la perfusión de islotes con sangre oxigenada para la cantidad máxima de tiempo antes de páncreasla inflación. Inhalación de CO2 es una mala elección para la eutanasia, como si se realiza de acuerdo a los protocolos humanitarios, que expone los islotes de sangre poco oxigenada durante al menos 5-6 minutos antes de comenzar el procedimiento. La dislocación cervical sin anestesia podría ser un método aceptable con justificación científica, pero esto requeriría una importante experiencia tanto con el método de la eutanasia y la disección del ratón y procedimiento inflación páncreas con el fin de garantizar una muerte humana y la preservación de la función de los islotes. En la elección de desangramiento bajo anestesia, Avertin es el anestésico preferido en este protocolo. La elección particular de Avertin es que es un anestésico de acción rápida y profunda con muchas ventajas sobre otros anestésicos de uso común. En primer lugar, Avertin no se dilata vasos e inducen la liberación de óxido nítrico, al igual que el isoflurano 19. Islotes pancreáticos están altamente vascularizados, y por lo tanto su biología pueden ser afectados negativamente por exposur isofluranoe. En segundo lugar, Avertin no aumentar excesivamente los niveles de glucosa en sangre en ausencia de la inyección de glucosa, como puede ketamina / xilazina, que se ha demostrado que aumentan la glucosa en sangre por 167% hasta una hora después de la inyección 20. Por último, el rango terapéutico para pentobarbital es muy estrecha en ratones 21, aumentando la posibilidad de daño hipóxico a los islotes.

En el presente protocolo, el uso de hilo de sutura para ligar el conducto biliar común cerca del esfínter de Oddi se utiliza como una alternativa a una pinza hemostática. El método de rosca permite una mayor maniobrabilidad del conducto biliar común y ayuda a posicionar la aguja para la canalización. Sin embargo, el uso de hilo durante este paso requiere la celebración de dos objetos (hilo y agujas), mientras que la pinza permite manos libres para ayudar a colocar el conducto biliar. Ambas técnicas de aislamiento producen un número similar de e islotes viables como se muestra con el trabajo previo en nuestro laboratorio y otros 10,22. Por otra parte, Nee canulacióntamaño dle, la posición, y el ángulo dependerá de la preferencia del usuario. Específicamente, una aguja de 30 G se utiliza en este protocolo, pero otros tamaños puede ser necesario basado en la cepa o antecedentes genéticos. Por ejemplo, los ratones BTBR tienen un conducto biliar común muy friable y un calibre mayor puede proporcionar un sello mayor alrededor de la punta de la aguja (MEK, observaciones personales). Por lo tanto, se recomienda han embotado agujas de cánulas de diferentes tamaños en la mano durante la cirugía, listo para cambiar a cabo si es necesario. La posición de la aguja en el conducto biliar común también afectará en gran medida el rendimiento de los islotes. Si la aguja se coloca en frente de la bifurcación del conducto biliar común, solución de colagenasa entrará en el hígado y dar lugar a una pobre inflación. Sin embargo, si la aguja se coloca demasiado cerca del esfínter de Oddi, se producirá una inflación parcial de páncreas, disminuyendo el número de islotes aislados. Inflaciones pancreáticas de prueba con diferentes tamaños de agujas y ubicaciones en el conducto biliar común serán Requirojo para personalizar el presente procedimiento y maximizar el rendimiento de los islotes.

Otro componente importante de este procedimiento para aumentar el número de islotes viables es preparar todos los reactivos como por las instrucciones de protocolos. Gassing los tampones con 95% O 2/5% CO 2 para aumentar la oxigenación puede un factor en la supervivencia de los islotes a lo largo del protocolo. El trabajo previo demuestra que la concentración de oxígeno disminuye hacia el interior del islote, reduciendo potencialmente el contenido de energía de β-células 23. Esto puede ser evidente después de una incubación durante la noche como un centro oscuro, necrótico aparecerá en los islotes cultivados, que se correlaciona con una disminución en la capacidad de respuesta in vitro. Por lo tanto, proporcionar suficiente oxígeno ayudará a aumentar el número de islotes y viabilidad durante el aislamiento y en el proceso de incubación durante la noche, normóxico. Además, la preparación apropiada de la solución de colagenasa mejorará la digestión de tejido pancreático y liberar tél islotes de tejido circundante. Si la concentración de colagenasa es demasiado bajo, no sólo el rendimiento de los islotes ser baja, pero el tejido acinar exocrina puede permanecer unido a los islotes, lo que afecta negativamente a las aplicaciones posteriores. Por otro lado, demasiado alto de una concentración de colagenasa puede destruir los islotes. Por lo tanto, las medidas adecuadas de control de calidad para asegurar la eficiencia de la digestión colagenasa sin la destrucción de los islotes promoverán mayores rendimientos.

La colagenasa aislada de Clostridium histolyticum es la enzima que se utiliza para liberar islotes de tejido pancreático en este protocolo. El irreproducibilidad de la actividad enzimática entre los diferentes lotes de colagenasa tiene el potencial de obstaculizar la cantidad y / o calidad de islotes aislados. En el presente protocolo, cada lote nuevo de enzima colagenasa pasa por un control de calidad interno para determinar la cantidad y funcionalidad de los islotes antes de que sean objeto de estudio. Por lo tanto, downstraplicaciones EAM y variación mucho deben tenerse en cuenta al elegir una enzima para el aislamiento de los islotes. Liberase ® (Roche), una mezcla de colagenasa purificada, es otra enzima alternativa digestivo que ha tenido éxito en muchos casos; en particular, en la obtención de mayores cantidades de islotes aislados 24,25. Sin embargo, el uso de Liberase no puede ser beneficioso para el aislamiento de islotes funcionales, ya que puede obstaculizar en función in vitro 26.

Existen muchas limitaciones en las actuales de aislamiento de islotes y de determinación de cAMP procedimientos que puedan afectar a las aplicaciones posteriores. Como se dijo anteriormente, los ratones BTBR tienen un conducto biliar común muy frágil, lo que aumenta la dificultad de la inflación y aislamiento de islotes de páncreas posterior. Por lo tanto, puede ser necesario la mezcla de preparaciones de islotes de varios ratones, ya que muchos ensayos in vitro, incluido el ensayo de AMPc descrito, requieren muchos islotes por réplica. Además, el uso de IBMX en el bloque de ensayo de cAMPs actividad de la fosfodiesterasa, dando una lectura de datos de la producción de cAMP. La adición de IBMX puede no ser aconsejable en los casos en los que es importante para la señalización celular del ciclo de la producción y la degradación de cAMP. Sin embargo, la eliminación de IBMX de este protocolo reduce significativamente el contenido de AMPc final de los islotes, que requiere la adición de muchos más islotes por réplica con el fin de obtener los valores de AMPc significativas en el EIA.

El presente protocolo es una herramienta esencial para un laboratorio de biología de los islotes o los interesados ​​en el páncreas endocrino. El componente de cAMP a este protocolo es sólo uno de muchos experimentos in vitro para entender cómo la manipulación de los islotes a través de diversos tratamientos puede aumentar la secreción de insulina o roma. Aunque la mayoría de investigaciones utilizando islotes se centra principalmente en la secreción de insulina de las células β, otros tipos de células pueden ser evaluados por sus relaciones dinámicas dentro del islote 4. En combinación con otra in vitro e in modelos in vivo, la experimentación islote arrojará luz sobre los mecanismos que subyacen a enfermedades pancreáticas relacionadas devastadoras como la diabetes y los insulinomas. Lo más importante, la comprensión de cómo los agentes farmacéuticos afectan directamente islotes mejorará la eficacia del tratamiento y la ayuda en la traducción a un modelo in vivo.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Renee L. Pasker y Harpreet K. Brar para la asistencia técnica de expertos sobre los protocolos descritos en este trabajo. Además, nos gustaría agradecer la tutoría de Christopher B. Newgard en la Universidad de Duke y Alan D. Attie en la Universidad de Wisconsin-Madison, junto con el apoyo de los miembros de su laboratorio, que nos permitió el tiempo y el apoyo necesarios para optimizar la protocolos descritos. En particular, agradecemos a Hans Hohmeier, Danhong Lu, y Helena Winfield en el Laboratorio Newgard y María Rabaglia en el Laboratorio Attie para los debates y asesoramiento de producción. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DK080845 y Diabetes Juvenil 594
Fundación de Investigación de subvención 17-2011-608 (a MEK)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets Sigma-Aldrich C7657
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X Invitrogen (Gibco) 14065-056
HEPES Sigma-Aldrich H3375
RPMI 1640 (powder) Invitrogen (Gibco) 31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7888
3/0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-30
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
0.8 mm Forceps   Fine Science Tools 11050-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15003-08
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe BD 309646
1 ml BD syringe BD 309628
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
27 G BD Needle 1/2" Length BD 305109
Sharpening Stone Fine Science Tools 29008-01
2-2-2-tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-25G
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) Sigma-Aldrich S6014
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M9397
Penicillin-Streptomycin Invitrogen (Gibco) 15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) Fisher Scientific SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich 5879-100MG

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