Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En metod för mus bukspottkörtel Islet Isolering och intracellulär cAMP Fastställande

Published: June 25, 2014 doi: 10.3791/50374
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Summary

Analys in vitro-β-cellsfunktion med hjälp av isolerade mus Langerhanska öar är en viktig komponent i studiet av diabetes patofysiologi och terapi. Medan många tillämpningar nedströms finns tillgängliga, detta protokoll beskriver specifikt mätning av intracellulärt cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) som en väsentlig parameter bestämning β-cellsfunktion.

Abstract

Okontrollerad glycemia är ett kännetecken för diabetes mellitus och främjar morbiditet såsom neuropati, nefropati och retinopati. Med den ökande förekomsten av diabetes, både immunmedierad typ 1 och fetma bunden typ 2, studier som syftar till att avgränsa diabetes patofysiologi och terapeutiska mekanismer är av avgörande betydelse. Den β-cellerna hos de pankreatiska Langerhanska cellöarna är ansvariga för att på lämpligt sätt utsöndra insulin som svar på förhöjda blodglukoskoncentrationer. Förutom till glukos och andra näringsämnen, är β-celler också stimuleras av specifika hormoner, benämnd inkretiner, som utsöndras från tarmen som svar på en måltid och agera på β-cellreceptorer, som ökar produktionen av intracellulär, cyklisk adenosinmonofosfat ( cAMP). Minskade β-cellsfunktionen, massa, och incretin lyhördhet är väl förstått att bidra till patofysiologin vid typ 2-diabetes, och är också alltmer kopplat wie typ 1-diabetes. Den nuvarande mus holme isolering och cAMP beslutsamhet protokoll kan vara ett verktyg för att beskriva sådant som gynnar sjukdomsutveckling och terapeutiskt syfte, särskilt de som förmedlas av inkretiner receptorer eller relaterade receptorer som verkar genom modulering av intracellulär cAMP-produktion. Medan endast cAMP-mätningar kommer att beskrivas, skapar den beskrivna holme isolering protokoll ett rent preparat som också möjliggör för många andra tillämpningar i senare led, inklusive glukosstimulerad insulinsekretion, [3H]-tymidininkorporering, proteinhalten och mRNA-uttryck.

Introduction

Den strikta underhåll av euglycemia är absolut nödvändigt för att förhindra följdsjukdomar såsom neuropati, nefropati och retinopati, som är alla kännetecken för patologi okontrollerad typ 1 och 2 diabetes 1. Minskad β-cellsfunktion och massa i både typ 1 och 2 diabetes störa blodsockernivån 2. Av följande skäl immunmedierad typ 1-diabetes beror på en förödande förlust av insulinproducerande β-celler, nedsatt β-cellsinsulinsekretion och perifer insulinsignalering i typ 2-diabetes tillsammans främja hyperglykemi, dyslipidemi, och ökad glukosproduktionen i levern, vilket så småningom leder till både förlust av β-cellmassan och insulinsekretionskapacitet från enskilda β-celler 3. Att förstå de underliggande β-cellmekanismer i utvecklingen av typ 1 och 2 diabetes kommer förhoppningsvis att ge upphov till nya terapier för att förebygga och behandla dessa sjukdomar.

In vitro-tissue kulturmodeller, såsom INS-1 och MIN6 förevigat β-cell-linjer, kan vara användbara verktyg för att förstå specifika β-cellfunktioner. Men samspelet mellan de olika celltyper inom holmen kan själva reglera β-cellsfunktion. Till exempel den parakrina påverkan av glukagon (utsläppt från α-celler) och somatostatin (utsläppt från δ-celler) i ökande och minskande insulinutsöndring, respektive, visar på betydelsen av cellcell närhet i det endokrina svaret 4. Vidare kanalförbindelser mellan β-celler potentierar frisättningen av insulin 5. Även om framsteg har gjorts i att generera insulinomceller linjer som bättre replike det fysiologiska svaret av isolerade cellöar till glukos (t.ex., INS-1-härlett 832/13 och 832/3-cellinjer i) skiljer sin glukos responsiveness fortfarande från normal råtta cellöar 6,7. Dessutom svaret av dessa klonala insulinoma cellinjertill glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) agonister kan skilja sig dramatiskt från varandra, liksom från normala öar 6. Därför kan odödliga cellinjer representerar inte den bästa modellen för analys av ämnen som påverkar cAMP produktion.

I motsats till de insulinoma-härledda cellinjer, studera β-cellsfunktion endast i hela djurmodeller har sin egen uppsättning av komplikationer. En av de största utmaningarna i arbetet med endokrin vävnad mäter den exakta koncentrationen av hormon som frigörs. Specifikt spelar levern en viktig roll metaboliserande insulin, och bukspottkörteln blodflödet går direkt till levern. Således kan en mätning plasmainsulin inte exakt beskriva de mängder insulin som utsöndras från bukspottkörteln i sig eller effekterna av olika behandlingar på graden av insulinutsöndring 8. Dessutom kan njur metabolism av glukagon begränsa tillförlitligheten glukagon ut från ö-α-celler 9. Därför isolera primära mus holmar för in vitro-experiment ger en mer exakt förståelse av hur holmen svarar på specifika stimuli för att komplettera mätningar som gjorts in vivo.

Det nuvarande protokollet för isolering av mus holmar är ett väletablerat protokoll som används av ett antal grupper (med smärre ändringar som kan bidra till att öka framgång) 10,11. Dessutom kan bestämningen av cAMP-produktion möjliggör en direkt avläsning av den incretinen responsiveness av β-cellerna. I samband med cAMP-mätning, proteinhalt och insulinsekretion också kan kvantifieras från samma cAMP prov prep, hjälper till att bestämma huruvida en defekt i β-cellfunktion ligger proximalt eller distalt i förhållande till cAMP-10. Den slutliga cAMP innehåll och insulinsekre tillämpning i detta protokoll kan vara ett mycket kraftfullt verktyg för att förstå påverkan av läkemedel och kost beståndsdelar, bland annats, den cAMP-och insulinutsöndring. Förutom stimulans från enbart glukos, kan andra föreningar användas för att mäta förändringar i cAMP-och insulinutsöndring 10,11.

Slutligen, även om insulin är det primära hormonet vi analysera från isolerade cellöar, andra hormoner såsom glukagon och somatostatin, samt cytokiner, eikosanoider och cykliskt adenosinmonofosfat, kan också mätas, antingen genom en transient stimuleringsanalys eller genom kvantifiering av deras nivåer i odlingsmedium 12. Slutligen, även utanför ramen för detta manuskript, holme isolering med den beskrivna kollagenas isoleringsmetoden möjliggör holme bevaras så att många andra tillämpningar i efterföljande led kan bedrivas, t.ex. ö-transplantation, RNA-isolering för kvantitativ realtids-PCR och microarray-metoder, protein isolering för Western blotting, holme inbäddning och immunofluorescens avbildning, och [3H]-tymidininkorporering som ett mått på holme cell replikatjon, varav en del har beskrivits i tidigare jove artiklar 13-16. Sammantaget kan följa den lilla ön isoleringsförfarande som beskrivs i protokollet ger en forskare med viktig och användbar information för att utveckla terapier och främja läkemedelsutveckling syftar till att öka β-cellsfunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med alla relevanta riktlinjer, regler och tillsynsmyndigheter. Protokollet som demonstreras utfördes under ledning och godkännande av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Wisconsin-Madison.

1. Beredning av lösningar

  1. Metoden för dödshjälp i detta protokoll är blodtappning enligt Avertin anestesi (för en översyn av alternativ, se diskussion). För att göra Avertin, tillsätt 0,625 g (1,25% eller 44,2 mM) av 2-2-2 tribromoethanol till 1,25 ml av 2-metyl-2-butanol i ett 15 ml koniskt rör och värm vid 37 ° C under 20-30 min. Vortexa lösningen på hög i 10-15 sekunder i taget för att helt lösa upp 2-2-2 tribromoethanol. När fullständigt upplöst, tillsätt lösningen till 48.75 ml dubbeldestillerat H2O, filtrera genom ett 0,45 m filter i en ny 50 ml koniska rör, linda 50 ml koniskaal rör i aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C i upp till en månad. Ta tuben till RT innan injicera möss.
  2. För att göra Hanks balanserade saltlösning (HBSS), utgör 1 L 1x HBSS från en 10x lager (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) i dubbeldestillerat H2O, tillsätt 0,35 g (4,2 mM) Nacho 3, och lagra vid 4 ° C i upp till en månad. För varje mus, kommer 105 ml av denna lösning (plus 5-10 ml extra för pipettering fel) krävas för islet isolering.
  3. Holmar är mycket känsliga för hypoxisk skada; därför är HBSS bubblades med 95% O2 / 5% CO2 för att efterlikna de koncentrationer av O2 i blodet. Särskilda gasblandningar kan köpas och en bubblande station inrättas med en pasteurpipett bifogas slangar. Efter bubbling av den erforderliga mängden av HBSS med 95% O2 / 5% CO2 under 15 min, tillsätt 0,02% RIA-kvalitet BSA (bovint serumalbumin) i volym och förvara på is under den remainder av holmen isolering.
  4. För Ficoll beredning, väg upp 32,5 g Ficoll i en 400 ml bägare, tillsätt 80 ml HBSS, och rör om vid 500 till 700 rpm under 30 min. När upplöst, häll Ficoll lösningen till en 250 ml mätglas och lägga HBSS till 130 ml-märket på den graderade cylindern för att skapa en 25% Ficoll lösning. Täck upp i mätglas med två portioner av Parafilm ® M (Pechiney plastförpackningar Company, Chicago, IL) och skaka kraftigt flera gånger.
  5. För en 23%, 20,5% och 11% Ficoll-lösning, tillsätt 27,6, 24,6 och 13,2 ml av 25% Ficoll, respektive, till 50 ml koniska rör. Sedan, ta varje lösning upp till totalt 30 ml med HBSS och skaka väl för att blanda. Alla fyra Ficoll lösningarna bör förvaras vid 4 ° C och är bra för upp till 2 veckor.
  6. Kollagenas-lösning som är lämplig för isolering av aktiva cellöar prepareras från kollagenas isolerat från Clostridium histolyticum (Material tabell). Varje parti måste testas för enzymeffektivitet. Typiskt kollagenas användes vid 0,3 till 0,5 mg per ml HBSS. Med hjälp av enzymkoncentrationer i det intervallet (vanligen 3 olika koncentrationer), bestämma kvaliteten och mängden av isolerade öar från åldersmatchade möss eller syskon för att ställa arbetsenzymkoncentrationen.
  7. När rätt koncentration bestäms, kräver varje mus 35 ml kollagenas i HBSS för hela isoleringsprotokoll. Snurra kollagenas i HBSS att lösa. Omedelbart före det kirurgiska ingreppet, pre-ladda en 5 ml spruta med kollagenaslösning, placera kanylen på och ta bort luftbubblor, och lämnar på is tills de behövdes.
  8. Den lilla ön odlingsmedier för O / N inkubation är en kompletterad RPMI 1640-media. För stamlösning Lös ett RPMI 1640-paket (Gibco, New York) i 1 liter dubbeldestillerat H2O och lägga till 1,19 g HEPES (5 mM) och 2 g Nacho 3 (24 mM). Justera pH till 7,4,filter sterilisera och förvara vid 4 ° C i mörker.
  9. För kompletterat medium, tillsätt 10% FBS och 100 IU/100 | ag / ml penicillin / streptomycin, respektive, till de lager RPMI 1640 media. Om en annan glukoskoncentration är önskvärd, kan glukosfritt RPMI 1640 medium användas och en specifik koncentration av glukos kan tillsättas.
  10. För en aktie Krebs Ringer bikarbonat buffert (Krebs), lägg till följande ingredienser att dubbla destillerat vatten vid följande koncentrationer: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), MgSO 4 (1,18 mM), KH 2 PO 4 (1,18 mM ), Nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM) och CaCl2 (2,52 mM) vid pH 7,4. CaCl2 bör tilläggas förra och denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
  11. För att göra en fungerande lager av Krebs, första gas med 95% O 2/182 5% CO2 under 10 till 15 min med en Pasteur-pipett vid 37 ° C följt av tillsats av 0,5% RIA-kvalitet BSAper volym. Härnäst glukos sattes till den önskade koncentrationen för analysen in vitro.

2. Beredning av verktyg

  1. Något trubbiga tips av 30 - och 27-G-nålar med hjälp av en skärpning sten för att runda av den skarpa punkten. Sätt en 45 graders böj i nålen ungefär en fjärdedel av en tum från spetsen med användning av en tång. Var noga med att inte pressa för hårt, vilket kommer att stänga den inre diametern på nålen.
  2. Skär 3/0 silkessutur tråden till ca 4 tum längder, en för varje mus.
  3. Täck dissekera mikroskop bas med plastfolie och tejp ner.
  4. Skär flera bitar av absorberande bänkpapper, ca 3 x 5 inches i storlek, minst 2 per mus.

3. Förbereda musen

  1. Fyll en 1 ml spruta med en ml Avertin.
  2. Injicera avertin lösning intraperitonealt vid ca 40 pl / g kroppsvikt.
  3. När musen inte longer svarar på svans eller bakfoten klämmer försiktigt överföra den till dissekera mikroskop arbetsstation.
  4. Med musen i ryggläge och huvudet vänd distalt, spraya musen med 70% vattenlösning av etanol. Var noga med att använda en tillräcklig mängd 70% etanol för att begränsa mängden päls i den exponerade brösthålan.

4. Öppning brösthålan

  1. Nyp pälsen och huden på musen mellan de båda bakbenen och göra en första snitt genom epidermis, dermis och underliggande membran.
  2. Medan han fortfarande nypa ihop huden och underliggande membran, skär mot den främre extremiteten på båda sidorna av musen noga med att undvika att skära några inre organ.
  3. Vik huden och membranflik över bröstkorgen och ta bort xiphoid processen för att möjliggöra enklare tillgång till bukspottkörteln för inflationen.
  4. Rikta musen med huvudet vänd proximalt och förflytta de inre organen i riktning mot den högra sidan av det arbete station för att avslöja den nedåtgående aorta.
  5. Såvida blod vävnad skall samlas, kan den nedåtgående aortan skäras för att slutföra euthanization. Njut av överflödigt blod med bänkpapper eller en Kimwipe för enklare tillgång till den gemensamma gallgången.

5. Blåsa bukspottkörteln

  1. Med en dissekera mikroskop, flytta tunntarmen så att den gemensamma gallgången bildar en vinkelrät linje med huvudet av musen.
  2. Ta en pincett och ta tag i tunntarmen och hitta Sphincter av Oddi (Sphincter av ampulla) i slutet av den gemensamma gallgången, som sar ut på tunntarmen från gallgången, som bildar en vit triangel på den rosa tarmen. När Sphincter av Oddi har lokaliserats, ta # 5 Dumont pincett och dra spetsen under den gemensamma gallgången så nära till tunntarmen som möjligt, försiktigt så att inte tränga igenom kanalen.
  3. Efter piercing genom tunntarmen och bindväv, användspets Dumont pincett för att ta tag i suturen och dra den enligt den gemensamma gallgången. Fästa den gemensamma gallgången så nära Sphincter av Oddi som möjligt, och se till att knuten är spända för att förhindra läckage.
  4. Ta tag i båda ändarna av sutur och dra mot svansen att sätta lite spänning på den gemensamma gallgången. Med hjälp av fria händer, gör ett litet snitt med mikro sax i gallgången precis ovanför den sista förgreningen in i levern. OBS: Det är viktigt att inte skära för nära Sphincter av Oddi eftersom det kan leda till en partiell inflation i bukspottkörteln och undvika att skära genom den gemensamma gallgången eftersom det också kommer att resultera i en dålig inflation.
  5. Håll de två ändarna av strängen med den gemensamma gallgången spänd, ta bort sprutan / kanylen som är förinstallerad med 5 ml kollagenas lösning från ishink, ställa ner sprutan och för in den trubbiga 30 G nål i snitt gallgången, försiktigt så att inte tränga igenom genom wall av kanalen. Om 30 G nål är inte tillräckligt bred för gallgången för att bilda en tätning runt, ta bort den och ersätta med den trubbiga 27 G nål.
  6. Håll nålen på plats, släpper suturen och plocka upp 5 ml spruta. Tryck långsamt in sprutkolven. OBS: Om nålen har framgångsrikt införts i den gemensamma gallgången, kommer det att växa.
  7. Fortsätt att trycka in kolven långsamt och uthyrning av i ett pulserande sätt tills den första delen av bukspottkörteln blåses upp, följt av mild konstant tryck tills bukspottkörteln inte längre blåses upp. OBS: De flesta pancreases håller 3-5 ml innan de börjar läcka. Dessutom kommer en framgångsrik inflation ha jämn fördelning av exokrin vävnad och den del av bukspottkörteln på toppen av magen kommer att blåsas upp.
  8. Ta bort nålen från den gemensamma gallgången och ställa åt sidan.

6. Pancreas Borttagning

  1. Ta en pincett i ena handen och en böjd sax iden andra. Med hjälp av pincett, ta tag i tunntarmen vid Sphincter av Oddi. Med saxen sluten, med spetsen till en separat del av bukspottkörteln från tunntarmen.
  2. Sprid saxen isär för att vidga klyftan mellan tunntarmen och bukspottkörteln.
  3. Placera "V" på saxen där tunntarmen och pankreas fästa till varandra vid den högra sidan av gapet som tidigare gjordes. Använda pincett försiktigt dra tunntarmen förbi sax för att ta bort bukspottkörteln.
  4. Fortsätt arbeta ner i tunntarmen till den rosa bindväv. Vid denna punkt, plocka upp tunntarmen nära där den fäster i magen och klipp bukspottkörteln borta från resten av tunntarmen. OBS: Se till att inte klippa bukspottkörteln som det kan börja att tömma.
  5. Greppa Försiktigt delen av bukspottkörteln knutna till magen med pincett (flata pincett fungerar bäst). Samtidigt som du drar upp försiktigt på bukspottkörteln, använd kurvand sax för att klippa bort på sambanden mellan bukspottkörteln och magen.
  6. Leta reda på mjälten och håll den med pincetten ovanför bukspottkörteln. Ta böjd sax och klippa bort anslutningarna mellan mjälten och bukspottkörteln.
  7. Hitta där bukspottkörteln är fäst till tjocktarmen. Plocka upp i tjocktarmen med pincett och använda spetsen på saxen att rota igenom. Sprid saxen ifrån varandra som tidigare för att skapa en klyfta mellan tjocktarmen och bukspottskörteln.
  8. Håll upp tjocktarmen med pincett: detta kommer att resultera i bukspottkörteln som faller bort, utsätta sina exakta kopplingar till tjocktarmen. Klipp bort de återstående anslutningarna.
  9. Hitta den rosa bindväv fäst på bukspottkörteln och tunntarmen och klipps av så nära bukspottkörteln som möjligt. OBS: Om piercing bukspottkörteln är ett bekymmer, är det tillrådligt att klippa närmare till tunntarmen som bindväv kommer att filtreras bort i senare steg.
  10. Grab så mycket i bukspottkörteln som möjligt och lyft försiktigt. Med böjd sax, skära bort de återstående anslutningarna mellan bukspottkörteln och brösthålan för att helt ta bort bukspottkörteln. Anm: De bukspottkörteln bör ändå blåsas om bort på rätt sätt.
  11. Förvara den borttagna bukspottkörteln i ~ 2,5 ml kollagenas lösning i en 50 ml koniskt rör på is tills alla andra pancreases har uppblåsta och bort för experimentet.

7. Tvättning

  1. Ta alla isolerade pancreases och flytta dem till separata 50 ml koniska rör var och en innehåller 25 ml färsk kollagenas lösning
  2. Placera 50 ml koniska rör upprätt i ett 37 ° C skakande vattenbad med förmåga att oscillera vid 220 till 250 rpm, med skakapparat avstängd.
  3. Gas vardera 50 ml koniska rör med 95% O2 / 5% CO2 under 5 min med en Pasteur-pipett.
  4. Sätt tillbaka locket varje rör tätt och lägg åt sidan i den skakande vattenbadet under ytan av vattnet. Skaka vid 220 till 250 varv per minut under 20 sek, varannan minut, upp till 16 minuter med början vid min 6. (Skaka vid 6, 8, 10, 12, 14 och 16 min)
  5. Överför omedelbart rören till en centrifug vid rumstemperatur under en snabb dragning. Ta centrifugen upp till 1500 rpm (400-500 g) och stäng av omedelbart.
  6. Med hjälp av en vakuumfälla, aspirera ungefär 22,5 ml av den kollagenaslösning utan att störa pelleten. Tvätta med 10 ml HBSS och vortex försiktigt för att bryta upp pelleten.
  7. Utför en snabb dragning i rumstemperatur upp till 1500 rpm (400-500 g).
  8. Aspirera ca 10 ml av lösningen, återigen utan att störa pelleten.
  9. Tvätta med ytterligare 10 ml iskall HBSS och skaka försiktigt för att återigen bryta upp pelleten. Upprepa snabba spinn och aspirera 10 ml av lösningen.
  10. Vortexa försiktigt pelleten i de återstående 2,5 ml HBSS lösning. Häll lösningen genomen 1000 um mesh i en ny 50 ml koniska rör. Detta kommer att ta bort den stora vävnadsrester inte ned av kollagenas.
  11. Skölj den gamla 50 ml koniska rör med 2,5 ml iskall HBSS. Använd en pasteurpipett för att skölja de sidor av röret ordentligt innan överföring av 2,5 ml HBSS genom nätet till de nya 50 ml koniska rör.
  12. Gör en ny snabbcentrifugering vid rumstemperatur vid 1500 rpm (400 till 500 g) för att pelletera vävnaden.
  13. Aspirera all HBSS genom att luta röret mot vakuumfällan. OBS: Det är mycket viktigt att inte störa pelleten eftersom detta kommer att resultera i förlust av holmar. Om pelleten är lös eller börjar röra sig i riktning mot vakuumfällan, sluta suga lösningen och återpelletera vävnaden och sedan fortsätta att aspirera den återstående lösningen.
  14. När all HBSS har avlägsnats tillsätts 4,8 ml av 25% Ficoll-lösning och virvel för att bryta upp pelleten.
  15. Skiktet försiktigt 2,4 ml av 23% Ficoll-lösning ovanpå 25% Ficoll-lösning genom tillsats av 23% Ficoll-lösning till den sida av 50 ml koniska rör. För att säkerställa jämn skiktning, vrid 50 ml koniska röret när du lägger Ficoll lösningen.
  16. Upprepa skiktning processen för 20,5% och därefter 11% Ficoll lösningar. OBS: Om 4 olika skikt inte är närvarande, lägga HBSS upp till 50 ml märket och vänd röret 4-6 gånger eller tills Ficoll gradienten inte längre existerar. Re-pellets vävnaden och försök igen steg från 7,14 till 7,16.
  17. Centrifugera 50 ml koniskt rör vid RT vid 1820 rpm (800 g) under 15 min.
  18. Häll allt i Ficoll i en färsk 50 ml koniskt rör, var noga med att lämna pellet av exokrin vävnad bakom. Lägg iskall HBSS upp till 50 ml märket och vänd röret 4-6 gånger för att blanda Ficoll och HBSS tillsammans.
  19. Centrifugera 50 ml koniskt rör vid RT vid 1820 rpm (800 g) under 5 min.
  20. Försiktigt aspirera mesta av HBSS / Ficoll blandningen med användning av en vakuum trasid. Inte störa pelleten som den är lös och kan aspireras lätt.
  21. Ta en Pasteur-pipett och överföra pelleten till en engångs odlingsrör.

8. Plocka Islets

  1. Tillsätt 5 ml plocka media (dvs.. Kompletterat RPMI 1640 eller Krebs Ringer bikarbonatbuffert) till engångskulturen röret. Anm: De plock media kommer att variera beroende på i senare led.
  2. Låt cellöar sedimentera till botten av odlingsröret i 5 min. Ta dem med en Pasteur-pipett till ett 15 mm med 60 mm Polystyren petriskål. OBS: Det är viktigt att använda en petriskål dessa inte behandlas och kommer att förhindra cellöarna från att vidhäfta till skålen.
  3. I en separat 15 mm gånger 60 mm polystyren petriskål, tillsätt 5 ml av mus islet odlingsmedium (100 ml RPMI 1640 Stock Media, 10 ml värmeinaktiverat FBS, 1 ml pen / strep, filter steriliserad).
  4. Med hjälp av en dissekera mikroskop med backlight kapacitet, använder en P-20 pipett att plocka holmarna i petriskål med holme odlingsmedier, var noga med att undvika att överföra acinar vävnad skräp. När bakgrundsbelyst, kommer holmar visas brun guld och deras yttre membran kan glittra, medan körtelvävnad visas ljusgrå och trist. Om holme preparat innehåller en stor mängd skräp, är det lämpligt att handplocka holmar två gånger i färskt medium. Att minska förorening skräp kommer att begränsa holme hopklumpning efter en natts inkubation. Lägga DNAs (3,000 U / ml) till rötningsbufferten kan också bidra till att begränsa holme hopklumpning (JWJ, personlig observation). OBS: Det är viktigt att räkna antalet holmar isolerade att planera för experiment nedströms.
  5. Inkubera cellöar O / N i en inkubator inställd på 37 ° C med 5% CO2.

9. CAMP-analys

  1. Märk 1,7 ml mikrofugrör, en för varje replikat av analysen. OBS: cAMP-analyser bör ha minst duplicates för varje behandlingsbetingelse, men mer replikat per behandling föredrages.
  2. Efter gasning Krebs Ringer bikarbonat-buffert under 15 min med 95% O2 / 5% CO2 med pasteurpipett, tillsätt 0,5% RIA-kvalitet BSA och en slutlig glukoskoncentration på 1,7 mM (preinkubation lösning). Lägg sedan till 1 ml av den nyligen gasade Krebs till varje mikrofugrör. Två ml Krebs krävs per rör för pre-inkubation och behandling tidpunkter; dock är det rekommenderat att förbereda minst 5-10 ml extra.
  3. Snurra holmar till mitten av petriskålen, och med hjälp av en P-20 pipett, handplocka holmarna till en ny 15 mm med 60 mm polystyren petriskål med 5 ml av förinkuberingen lösningen för att tvätta glukos-innehållande odlingsmedium från holmarna.
  4. Den cAMP analyssatsen används är GE Healthcare cAMP Direkt Biotrak MKB. Den prococol används är en modifiering av det som beskrivits för "intracellulärt cAMP measurement använder icke acetylering MKB-förfarandet med de nya lysisreagens, "och har optimerats för användning med det minsta antalet holmar per rör, vilket gör att ett ökat antal behandlingsvillkor och tekniska replikat. Med hjälp av en P-20 pipett minst 13 holmar i varje rör från steg 9.2, underhålla holme storlek överensstämmelse mellan rören, med 1 ml före inkubation buffert. Anmärkning: En ökning av antalet replikat är mer fördelaktigt än antalet öar per rör. Men om det finns tillräckligt många holmar för att öka antalet holmar per rör jämnt, är det lämpligt att göra det, upp till 25-50 holmar per rör.
  5. Med mikrofugröret mössor öppna, överför till en 37 ° C inkubator inställd på 5% CO2 och inkubera i 45 min för att normalisera insulinsekretion av alla holmar till en basnivå.
  6. Medan proverna inkubation, förbereda behandlingar (dvs. 8 mm, 11.1 mm, 16,7 mM glukos, etc.) i den gasade Krebs frOM steg 9.2. i 15 ml koniska rör med 1 ml extra att ta hänsyn till eventuella pipettering fel. Lägg 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) till en slutkoncentration av 200 pM. IBMX är en allmän fosfodiesterashämmare som blockerar nedbrytningen av cAMP, så att cAMP att ackumuleras i cellen som den produceras. (Notera:.. Detta är en sann cAMP produktionsanalys Se diskussionen avsnitt för tillfällen då mätning cAMP produktion inte kan vara önskvärt om IBMX är kvar av analysen, kommer fler holmar krävs per rör för att få cAMP uppgifter i linjära området för standardkurvan).
  7. Efter 45 min förinkubation, avlägsna de mikrofugrör från inkubatorn, lock och puls-vortex varje prov (mindre än 0,5 sek). Detta är för att blanda upp det insulin-gradient som sannolikt har genererats på grund av att cellöarna koncentreras i botten av röret. Man måste vara försiktig att inte virvel för hårt, eftersom detta negativt kan påverka holmen stabilitet (Obs: Cappedrör med holmar kan försiktigt knäppt eller inverterad om det inte är möjligt att puls vortex försiktigt. Dessa alternativ kommer att lägga tid på analysen, vilket bör beaktas vid planeringen av experimentet).
  8. Överför varje rör till en bordscentrifug (RT) och spinn tills cellöarna nå 10.000 rpm (7,000-7500 g) och stänger omedelbart därefter.
  9. Använd en P-1000 pipett för att avlägsna det mesta av Krebs i varje mikrofugrör och lämna ungefär 10-15 | il av Krebs på holmen pelleten. Använd en P-20 pipett för att ta bort den del som ligger närmast den lilla ön pellets. Om pellets är störd, pipett Krebs tillbaka in i röret och re-spin.
    (OBS: Om försöksledaren finner det alltför svårt att ta bort alla av Krebs från holmen pellets utan att störa det, kan de sista 10-15 pl lämnas på och redovisas i den totala volymen senare i protokollet.
  10. Erhåll en tillräcklig mängd av flytande kväve i en isolerad behållare för att snäppa frysa proverna efter inkubation.
  11. Ta proverna ur inkubatorn, mössa, virvel snabbt (mindre än 0,5 sek) snurra mikrofugrör i en bordscentrifug (RT) upp till 10.000 rpm (7,000-7500 g), och sedan stängas av omedelbart. Om insulin eller en annan metabolit är en önskad applikation nedströms, använda ett P-1000-pipett för att samla in en alikvot av medium i ett mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C fram till vidare analys. Om stimuleringen inte mediet tas ut, kan det kasseras.
    (OBS: IBMX är en stark potentiator av glukos-stimulerad insulinsekretion (GSIS) Därför kan GSIS resultaten från cAMP stimulering mediet inte korrekt representera den verkliga effekten av specifika behandlingar på GSIS, speciellt om dessa effekter är subtila.).
  12. Upprepa steg 9,9 för att ta bort så mycket stimulans medel som möjligt utan att störa den lilla ön pellets. Snap frysa holmen pelleten i flytande kväve när det är mindre än 10-15 pl Krebs kvar på holmen pelleten. När allprover har snabbfrystes, förvara vid -80 ° C fram till cAMP-mätning.
  13. På dagen för cAMP bestämning, framställa de nya lysisreagens enligt tillverkarens protokoll. Tillsätt 200 ml lysisreagens 1B till varje mikrofugrör och skaka i full fart i 30 sek. Låt rören sitta på is under 10 min, vortexa varje 2 min under 30 sek. (OBS: Protokollet rekommenderar att utföra en mikroskopisk analys med trypanblått att säkerställa cell-lys, men detta sker inte för öar).
  14. Förbered arbetsnormer och upprätta MKB mikro precis som beskrivs i tillverkarens protokoll. Efter enzymsubstratet har inkuberats med mikroplattan under 30 minuter, utför den valfria 1,0 M svavelsyra steg och bestämma absorbansen hos brunnarna vid 450 nm med användning av en mikroplattläsare.
  15. Cykliska AMP resultat kommer att redovisas som fmol / brunn. Detta skall normaliseras till den totala volymen av det ursprungliga provet (200 | il + någonresterande Krebs kvar på holmarna från steg 9,9). Därefter kan resultaten antingen normaliseras till det totala antalet skär, vilket ger fmol cAMP producerad / islet, eller lysatet prover kan utsättas för bicinkoninsyra (BCA)-proteinanalys för att normalisera resultaten för att totalt cellulärt protein (ger fmol / ^ g protein) . Den senare rekommenderas när ö-storlekar är inkonsekvent mellan prover, och kan vara ett surrogat för ö-storlek. Den Pierce BCA proteinanalyskit har använts med framgång i detta protokoll, och kräver endast 25 ml prov. BSA standarder bör utarbetas i lysisreagens 1B från lägret analyssatsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att säkerställa en hög holme avkastning under isolering, bör kirurgiska tekniker som beskrivs i protokollet följas noga. Även om de tekniker som presenteras här kommer att anpassas till varje laboratorium, finns det några viktiga steg som kommer att leda till en lyckad isolering. För att göra den gemensamma gallgången lättillgänglig, är det rekommenderat att organen förflyttas till den högra sidan av musen (fig 1). Dessutom kommer detta att bukspottkörteln att blåsa med en mindre mängd motstånd eftersom det blir mindre vikt att begränsa expansionen. Ett annat kritiskt steg för att maximera islet utbytet är ligeringen av den gemensamma gallgången nära sfinktern av Oddi (Fig. 2A-C). Ligera längre bort från Sphincter av Oddi kan resultera i en partiell inflation genom att minska mängden av kollagenaslösning som kommer in i större pankreatiska gången. Dessutom kommer en spänd knut förhindra kollagenaslösning från att komma in i tarmen.

<p class = "jove_content"> En riktig snitt i den gemensamma gallgången ska placeras tillräckligt långt bort från bifurkationen från levern men tillräckligt nära för maximal bukspottkörtel inflation (Figur 3). Ett snitt görs för nära bifurkationen kan leda till att flödet av kollagenaslösning in i levern. När kollagenas lösningen kommer in i levern, kommer den att förlora sin mörkröda färg och börjar vända vitaktig. Om detta inträffar, ta bort nålen och prova en annan kanyle längre från levern. Dessutom bör den gemensamma gallgången snitt endast delvis genom kanalen (ca 50%). Helt skjuvning av kanalen kommer att göra det svårt att täta kanalen kring nålspetsen. En riktig snitt kommer att leda till fullständig stängning av kanalen runt nålen, som producerar tillräckligt med tryck för att både fylla den gemensamma galla och bukspottskörteln kanaler (Figur 4A). Det är också viktigt att säkerställa att nålen har trängt in i gallgången och inte den omgivande manteln.När nålen har satts in på rätt sätt, ska 5 ml kollagenas lösning fylla bukspottkörteln, skapar en marmore vävnad.

Bukspottkörteln borttagningsprocessen bör utföras försiktigt för att främja maximal ö-utbyte (figur 5). Piercing pankreas kan resultera i en deflation och förlust av kollagenaslösning, vilket minskar islet utbyte. Cutting bukspottkörteln nära bindväv och andra organ kommer att förhindra deflation. Dessutom är skörden annan vävnad, t.ex. bindväv, tillsammans med bukspottkörteln inte en fråga, eftersom det kommer att tas bort i efterföljande steg. En korrekt bort bukspottkörteln förblir uppblåst efter excision före ytterligare kollagenasdigestion (Figur 6).

Distinct skikt i Ficoll-gradient kommer att leda till en ren islet förberedelse och skapa en enklare miljö för plockning cellöar (Figur 7). Gradienten säkerställer separationen av holmar fråncelldebris och bindväv som återstår efter spjälkning och mesh sikt filtrering. Dessutom är detta steg avgörande för val av rena, friska holmar för tillämpningar efter. Specifikt kommer friska holmar vara klotformig och ha en gyllenbrun till mörkbrun centrum (Figur 8). OBS: Holmar från diabetiska möss kommer att vara mycket blekare i färgen, motsvarande med minskad insulininnehåll, och bättre kan skiljas från körtelvävnad genom sin form, glans, och deras synliga nätverk av kapillärer. Alla öar är anslutna till acinar vävnad ska inte användas och ska kasseras. Dessutom bör större holmar som utvecklar en mörk, nekrotisk centrum efter en natts inkubation kasseras eftersom de inte fungerar tillfredsställande.

Såsom beskrivits i inledningen, är cAMP-produktion en viktig komponent i β-cellsfunktion; i synnerhet när det gäller incretin handling. En fördel med det protokoll som beskrivs i detta mötte hod är att man samtidigt kan få cAMP produktion och glukosstimulerad insulinsekre uppgifter. Normalt korrelerar effekterna av en agent på cAMP produktion direkt med dess inverkan på insulinsekretionen 17. För enkla experiment, håller denna regel sant ganska väl (se figur 9 för ett exempel). I det nuvarande protokollet, använder vi IBMX (en fosfodiesterashämmare) i våra behandlingar för att förhindra nedbrytning av cAMP, vilket ger den totala produktionen av cAMP.

Figur 1
Figur 1. Förskjuta inre organ. Placering av inre organ till den högra sidan av musen skapar en lättare arbetsmiljö och tillåter bukspottkörteln utrymme att expandera under uppblåsning.

Figur 2 "fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
Figur 2. Binda utanför Sphincter av Oddi (AC). Avbildas här är ingången till den gemensamma gallgången till tunntarmen vid Sphincter av Oddi. Knyta av den gemensamma gallgången på Sphincter av Oddi förhindrar kollagenas lösning kommer in i tarmarna.

Figur 3
Figur 3. Gallgången snitt. Det är bäst att göra ett snitt i den gemensamma gallgången något distalt om bifurkationen i levern för att förhindra flödet av kollagenas lösningen i levern.

0374/50374fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig4.jpg "/>
Figur 4. Kanyle i gallgången med en trubbig 30 G nål och bukspottkörteln inflation. A) 30 G-nål sätts in i den gemensamma gallgången, vilket skapar en tätning runt nålspetsen. Det är viktigt att kontrollera och att notera att nålen har förts in i den gemensamma gallgången och inte den omgivande manteln. Ett ordentligt nål kommer att ha ett ogenomskinligt utseende. B) En riktig bukspottkörteln inflationen kommer att fylla med ca 3-5 ml kollagenas lösning och har ett marmorerat utseende.

Figur 5
Figur 5. Avlägsnandet av bukspottkörteln. A) Den inledande snitt med en böjd sax inträffar nära Sphincter av Oddi. Den initiala removal börjar i riktning mot magen försiktigt så att inte punktera bukspottkörteln. B) Det sista steget är att ta bort bukspottkörteln från bindväv på tunntarmen och de sista anslutningarna till bukhålan.

Figur 6
Figur 6. De uppblåsta bukspottkörteln. En framgångsrik bukspottkörteln borttagning kommer att ge en bukspottkörtel perfusion med kollagenas lösningen. Dålig excision kommer att lämna ett mindre, tömd bukspottkörteln.

Figur 7
Figur 7. Fyra skikt av Ficoll-gradient. De fyra distinkta skikt representerar en differentieradt Ficoll täthet från 25% i botten till 11% i toppen. Den distinkta skiktning är absolut nödvändigt att ta bort skräp och exokrin glömska från holmarna.

Figur 8
Figur 8. Islet selection. Friska cellöar tenderar att ha en gyllenbrun till mörkbrun färg med en rund sfärisk form och är inte anslutna till körtelvävnad. Efter inkubation över natten (16-20 timmar) en nekrotisk center utvecklas i större holmar, som bör undantas från experiment.

Figur 9
Figur 9. Representativa högkvalitativa cAMP produktionsresultat, som visar att utsöndrat insuli kan mätas från cAMP stimulering mediet. A) Isolerade cellöar från vildtyp eller gen-knockout-möss stimulerades med 11,1 mM glukos och intracellulär cAMP-produktion mättes och normaliserades till det totala cellulära proteinet. B) Utsöndrat insulin mättes med användning av ett standardinsulin ELISA och också normaliserad till total cellulär protein. I många fall korrelerar förändringen i cAMP-produktion direkt med förstärkning i glukosstimulerad insulinutsöndring. n = 3 för varje grupp; *, P <0,05. Denna siffra var anpassad från forskning som publiceras i Kimple et al 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med förekomsten av diabetes projekterade att påverka 7,7% av världens befolkning, är kravet på nya forskningsmetoder absolut nödvändigt att både förstå och behandla diabetes 18. Den nuvarande holme isolering är ett väletablerat protokoll som används för in vitro-experiment och har presenterats tidigare med smärre ändringar 11,14,16. Även insulinsekretion är en vanlig nedströms ansökan om isolerade öar, med fokus på uppströms beståndsdelar, såsom cAMP, kan hjälpa beskriva mekanismer förstärkande produktion och utsöndring av insulin.

Valet av dödshjälp måste göras omsorgsfullt för att säkerställa både en human behandling av försöksdjur samt integritet experimentella mätningar. För islet isolering, blodtömning under anestesi är vår föredragna metod för eutanasi eftersom den tillåter islet perfusion med syresatt blod för den maximala mängden tid innan bukspottkörtelninflationen. CO 2 inandning är ett dåligt val för dödshjälp, som om den utförs i enlighet med humana protokoll, exponerar det holmarna för dåligt syresatt blod i minst 5-6 minuter innan proceduren kan börja. Halsdislokation utan bedövning skulle kunna vara en acceptabel metod med vetenskaplig motivering, men det skulle kräva betydande erfarenhet med både metoden för dödshjälp och musen dissekering och bukspottkörtel inflationsförfarandet för att säkerställa en human död och bevarande av holmen funktion. I valet blodtömning under narkos, är Avertin den föredragna bedövningsmedel i detta protokoll. Det speciella valet av Avertin är att det är ett snabbverkande och djup bedövningsmedel med många fördelar jämfört med andra ofta använda bedövningsmedel. Först gör Avertin inte vidga kärlen och inducerar kväveoxid utsläpp, liksom isofluran 19. Pankreasöar är mycket vaskulariserad, och därmed deras biologi kan påverkas negativt av isofluran exposure. För det andra, inte Avertin inte överdrivet höja blodsockernivåerna i frånvaro av glukos injektion, som kan ketamin / xylazin, vilket har visat sig höja blodsockret med 167% upp till en timme efter injektionen 20. Slutligen är det terapeutiska området för pentobarbital mycket smal i möss 21, vilket ökar risken för hypoxiska skador på skär.

I det nuvarande protokollet, är användningen av suturen tråd att ligate gallgången nära Sphincter av Oddi utnyttjas som ett alternativ till en peang. Tråden metoden ger större manövrerbarhet av gallgången och hjälper läge nålen för kanyle. Men användningen av tråd under detta steg kräver att hålla två föremål (tråd och spruta) medan hemostat tillåter fria händer att hjälpa placera gallgången. Båda isoleringstekniker ger ett liknande antal och livskraftiga holmar som visas med tidigare arbete i vårt labb och andra 10,22. Dessutom kanyle needle storlek, position och vinkel kommer att bero på användarens önskemål. Närmare bestämt är en 30 G nål som används i detta protokoll, men andra storlekar kan krävas baserat på stam eller genetisk bakgrund. Exempelvis BTBR möss har en mycket spröd gallgången och en större spårvidd kan ge en större tätning runt nålspetsen (MEK, personliga observationer). Därför rekommenderas det att ha trubbiga kanyl nålar av olika storlekar till hands under operationen, redo att byta ut vid behov. Placeringen av nålen i den gemensamma gallgången kommer också i hög grad att påverka holme avkastning. Om nålen är placerad framför bifurkation av den gemensamma gallgången, kommer genaslösning in i levern och att resultera i en dålig inflation. Emellertid, om nålen är placerad för nära sfinktern av Oddi kommer en partiell pankreatisk inflation uppstår, minskar antalet av isolerade cellöar. Trial pankreas uppblåsningar med olika nål storlekar och platser på gallgången kommer att krävasrött för att anpassa det nuvarande förfarandet och maximera holme avkastning.

En annan viktig komponent i detta förfarande för att öka antalet livskraftiga holmar är att förbereda alla reagens enligt protokollen instruktioner. Gasning buffertar med 95% O 2/5% CO 2 för att öka syresättningen kan en faktor i ö överlevnad genom hela protokollet. Tidigare arbete visar att syrekoncentrationen minskar mot det inre av den lilla ön och eventuellt reducera halten av β-celler 23 energi. Detta kan vara uppenbara efter en inkubering över natten som en mörk, nekrotisk centrum visas i odlade cellöar, som korrelerar med en minskning i in vitro-respons. Således kommer att ge tillräckligt med syre bidra till att öka holme nummer och livskraft under isoleringen och in i natten, normoxisk inkubation processen. Dessutom förbättrar korrekt beredning av kollagenas lösningen förbättrar matsmältningen av pankreasvävnad och befria than cellöar från omgivande vävnad. Om kollagenas koncentrationen är för låg, inte bara den lilla ön avkastningen vara låg, men exokrin körtelvävnad kan förbli ansluten till holmarna, som påverkar tillämpningar nedströms negativt. Å andra sidan, kanske för högt för en kollagenas koncentration förstöra holmar. Därför kommer lämpliga åtgärder för kvalitetskontroll för att säkerställa kollagenasdigestion effektivitet utan att förstöra holmar främja större avkastning.

Kollagenas isolerat från Clostridium histolyticum är det enzym som används för att befria cellöar från bukspottskörteln vävnad i detta protokoll. Den reproducerbarhet av enzymatisk aktivitet mellan olika massor av kollagenas har potential att hindra kvantitet och / eller kvalitet på isolerade öar. I det nuvarande protokollet, varje ny massa kollagenas enzym går igenom en kontroll intern kvalitetskontroll för att fastställa både kvantitet och funktionalitet holmar innan de är föremål för studien. Därför downstrEAM applikationer och mycket variation måste beaktas när man väljer ett enzym för holme isolering. Liberase ® (Roche), ett renat kollagenas blandningen, är en annan matsmältningsenzymet alternativ som har varit framgångsrika i många fall; framför allt, att få större mängder av isolerade öar 24,25. Däremot kan användningen av Liberase inte vara till nytta för att isolera funktionella holmar, eftersom det kan hindra funktion vitro 26.

Många begränsningar finns i de nuvarande holme isolering och cAMP bestämningsförfaranden som kan hindra efterföljande tillämpningar. Såsom tidigare angivits BTBR möss har en mycket ömtålig gallgången, vilket ökar svårigheten att pankreatiskt inflation och efterföljande islet isolering. Därför kan pooling holme preparat från flera möss behövas, så många in vitro-analyser, bland annat beskrivs cAMP-analysen, kräver många holmar per replikera. Dessutom, med hjälp IBMX i cAMP-analysen blockets fosfodiesterasaktivitet, vilket ger en utläsning av cAMP-produktion. Tillägg av IBMX kanske inte är tillrådligt i fall där omsättningen av cAMP produktion och nedbrytning är viktig för cellsignalering. Dock kommer borttagning IBMX från detta protokoll avsevärt sänker den slutliga cAMP innehåll holmarna, vilket kräver tillägg av många fler holmar per kopia för att få meningsfulla cAMP-värden i MKB.

Det nuvarande protokollet är ett viktigt verktyg för en holme biologi laboratorium eller de som är intresserade av det endokrina pankreas. Den cAMP komponent till detta protokoll är bara en av många i vitro-försök att förstå hur holme manipulation genom olika behandlingar kan förstärka eller slö insulinutsöndring. Även om de flesta forskning utnyttjar holmar är främst inriktat på β-cellsinsulinsekretion, kan andra celltyper bedömas för sina dynamiska relationer inom holmen 4. I kombination med andra in vitro-och in vivo-modeller, kommer holme experiment belysa mekanismerna bakom förödande pankreas sjukdomar som diabetes och insulinom. Viktigast av allt, kommer att förstå hur farmaceutiska medel direkt påverka holmar öka effekten av behandlingen och stöd i översättningen till en in vivo-modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi vill tacka Renee L. Pasker och Harpreet K. Brar för teknisk experthjälp på protokollen i detta arbete. Dessutom vill vi tacka för det mentorskap av Christopher B. Newgard vid Duke University och Alan D. Attie vid University of Wisconsin-Madison, tillsammans med stöd av sina laboratorie medlemmar, som tillät oss tid och stöd som krävs för att optimera beskrivna protokoll. Framför allt tackar vi Hans Hohmeier, Danhong Lu, och Helena Winfield i Newgard Laboratory och Mary Rabaglia i Attie Laboratoriet för produktiva diskussioner och rådgivning. Detta arbete stöddes av NIH bidrag DK080845 och Juvenile Diabetes 594
Research Foundation 17-2011-608 (MEK)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets Sigma-Aldrich C7657
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X Invitrogen (Gibco) 14065-056
HEPES Sigma-Aldrich H3375
RPMI 1640 (powder) Invitrogen (Gibco) 31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7888
3/0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-30
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
0.8 mm Forceps   Fine Science Tools 11050-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15003-08
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe BD 309646
1 ml BD syringe BD 309628
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
27 G BD Needle 1/2" Length BD 305109
Sharpening Stone Fine Science Tools 29008-01
2-2-2-tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-25G
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) Sigma-Aldrich S6014
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M9397
Penicillin-Streptomycin Invitrogen (Gibco) 15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) Fisher Scientific SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich 5879-100MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Tags

Fysiologi holme isolering insulinutsöndring β-cell diabetes cAMP produktion mus
En metod för mus bukspottkörtel Islet Isolering och intracellulär cAMP Fastställande
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuman, J. C., Truchan, N. A.,… More

Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination. J. Vis. Exp. (88), e50374, doi:10.3791/50374 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter