La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l'esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Summary

Intercellulare Ca^{2 +}-Onde sono guidati da canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca^{2 +}-Onde in monostrati di cellule in risposta ad uno stimolo meccanico unicellulare locale e la sua applicazione per investigare le proprietà e la regolazione dei canali gap junction e hemichannels.

Abstract

Comunicazione intercellulare è essenziale per il coordinamento dei processi fisiologici tra le cellule in una varietà di organi e tessuti, compreso il cervello, fegato, retina, coclea e vascolare. In impostazioni sperimentali, intercellulare Ca ^{2 +-onde} possono essere provocato applicando uno stimolo meccanico a una singola cella. Ciò conduce al rilascio delle molecole di segnalazione intracellulare IP ₃ e Ca ^{2 +} che avviare la propagazione del Ca ^{2 +-onda} concentricamente dal cellulare stimolata meccanicamente alle cellule vicine. I principali meccanismi molecolari che controllano intercellulare Ca ^{2 +-propagazione} dell'onda sono forniti da gap canali di giunzione attraverso il trasferimento diretto di IP ₃ e dal hemichannels attraverso il rilascio di ATP. Identificazione e caratterizzazione delle proprietà e la regolazione dei diversi connessina e isoforme pannexin come canali gap junction e hemichannels sono consentiti dalla quantification della diffusione del intercellulare Ca ^{2 +-onda,} siRNA, e l'uso di inibitori di canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca ^{2 +-onda} in monostrati di cellule endoteliali corneali primarie caricato con Fluo4-AM in risposta ad uno stimolo meccanico controllata e localizzata provocata da un acuto deformazione, di breve durata della cellula come risultato di toccare la membrana cellulare con una micropipetta di vetro micromanipolatore controllato con un diametro di punta di meno di 1 um. Abbiamo anche descrivono l'isolamento delle specie bovina cellule endoteliali corneali primarie e il suo utilizzo come sistema modello per valutare l'attività Cx43-hemichannel come la forza guidato per intercellulare Ca ^{2 +-onde} attraverso il rilascio di ATP. Infine, si discute l'uso, i vantaggi, i limiti e le alternative di questo metodo nel contesto di apertura di canale di giunzione e di ricerca hemichannel.

Introduction

Comunicazione e di segnalazione intercellulare sono essenziali per il coordinamento dei processi fisiologici in risposta ad agonisti extracellulari al tessuto e il livello di ^1,2 intera-organo. Il modo più diretto di comunicazione intercellulare è creato dalla presenza di giunzioni. Giunzioni gap sono placche di canali gap junction, che sono i canali proteici formati da docking testa a testa di due connessine (Cx) hemichannels delle celle adiacenti ^3,4 (Figura 1). Giunzioni permettono il passaggio di piccole molecole di segnalazione con un peso molecolare di meno di 1,5 kDa, comprese Ca ^{2 +} ₃ o ⁵ IP, causando e modulando Ca ^{2 +-liberazione} dalle riserve intracellulari delle cellule vicine ⁶ (Figura 2). Canali gap junction sono strettamente regolati dalle interazioni delle proteine ​​intra-ed intermolecolari e da processi di segnalazione cellulare, come la modifica redox efosforilazione ^7. GJs facilitano la risposta coordinata delle celle collegate, agendo quindi come un prodotto chimico e sincizio elettrico. Per esempio, la diffusione di potenziale cardiaco di tutti i miociti atriali e ventricolari è mediato da canali GJ Cx basate ^85. Cxs non solo hanno un ruolo come canali giunzioni gap, ma anche formano hemichannels spaiati, così funzionando come canali in membrane similmente a canali ionici regolari ^8-10 (Figura 1). Hemichannels partecipano segnalazione paracrina tra cellule adiacenti controllando lo scambio di ioni e molecole di segnalazione tra l'ambiente intra ed extracellulare.

In molti tipi di cellule (come le cellule epiteliali, cellule osteoblastiche, astrociti, cellule endoteliali, ecc) e di organi (come il cervello, il fegato, la retina, coclea e il sistema vascolare), intercellulare Ca ^{2 +-onde} sono fondamentali per il coordinamento delle risposte pluricellulari <sup> 11. Aumenti di ^{Ca2 +} intracellulare livelli in una certa cella non sono limitati a questa cella, ma propagano alle cellule vicine circostanti, stabilendo così un intercellulare Ca ^{2 +-wave 12,13.} Questi intercellulare Ca ^{2 +-onde} sono importanti per il normale regolazione fisiologica di strati di cellule come un sincizio e loro disregolazione è stato associato a processi fisiopatologici ^11. Nel endotelio corneale e l'epitelio, diversi gruppi di ^14-24, compreso il nostro ^25-33, hanno studiato i meccanismi ei ruoli della comunicazione intercellulare. In cellule non eccitabili, come le cellule endoteliali corneali, due distinte modalità di comunicazione intercellulare verificano ^28,29, cioè gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Gap giunzionale comunicazione intercellulare comporta uno scambio diretto di molecole di segnalazione tramite gap giunzioni ^7. Gap giunzionecomunicazione intercellulare zionale è fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti, il controllo della proliferazione cellulare, e stabilendo una risposta sincronizzata allo stress extracellulare ^10,34,35. In un certo numero di patologie, gap accoppiamento giunzione è ridotta a causa di CXS difettosi, e con la presente colpisce gap giunzionale comunicazione intercellulare ^36. Questo sottolinea l'importanza e l'influenza del gap giunzionale comunicazione intercellulare negli organismi multicellulari. In contrasto gap giunzionale comunicazione intercellulare, comunicazione intercellulare paracrina non dipende apposizione cellula-cellula, in quanto comporta il rilascio di messaggeri extracellulari diffusibili (Figura 2). Diversi tipi di molecole di segnalazione vengono rilasciati nello spazio extracellulare dalle cellule segnalazione. La molecola viene quindi trasportato alla cellula bersaglio dove viene rilevato da una proteina recettore specifico. Successivamente il complesso recettore-segnale induce una risposta cellulare, cheviene terminato dalla rimozione del segnale, inattivazione o desensibilizzazione. Usciti lipofile messaggeri di segnalazione extracellulare penetrano la membrana e agiscono sui recettori intracellulari. In contrasto, messaggeri idrofile non attraversano la membrana plasmatica della cellula rispondere, ma agiscono come un ligando che si lega a proteine ​​recettori di superficie espresse, che poi trasmettere il segnale per l'ambiente intracellulare. Tre grandi famiglie di proteine ​​recettori di superficie delle cellule partecipano a questo processo: canale ionico-linked, enzyme-linked, e G-proteine ​​legate. La molecola messaggero rilasciato può agire sui recettori della stessa cella (autocrina), su cellule bersaglio in prossimità (paracrina) o su cellule bersaglio distanti che richiedono il sistema circolatorio (endocrino).

In molti tipi cellulari, tra endotelio corneale ^28,29, ATP è uno dei principali fattori paracrini idrofili, che guidano la propagazione di intercellulare Ca ^{2 +-onde 37-40.} During deformazione meccanica, ipossia, infiammazione o stimolazione da vari agenti, ATP possono essere rilasciati dalle cellule sane ^41-44 in risposta alle sollecitazioni di taglio, allungamento, o rigonfiamento osmotico ^44,45. Meccanismi ATP-rilascio diverse sono state postulate, tra esocitosi vescicolare ⁴⁴ e una pletora di meccanismi di trasporto, come ad esempio cassette (ABC) trasportatori ATP-binding, plasmalemmal canali anionici voltaggio-dipendenti, ⁴⁶ canali del recettore P2X7 ^47,48, così come connessina hemichannels ^49-52 e pannexin hemichannels ^43,49,53. ATP extracellulare può essere rapidamente idrolizzato ad ADP, AMP, adenosina ^54,55 da ectonucleotidases che sono presenti nell'ambiente extracellulare. L'ATP extracellulare rilasciato e il suo metabolita ADP ⁵⁶ si diffonderanno in diffusione. La successiva interazione di questi nucleotidi con recettori purinergici nelle cellule vicine è stata implicata nella propagation di intercellulare Ca ^{2 +-onde 28,37,51.} Due differenti classi di recettori purinergici sono presenti: adenosina è il ligando naturale principale per P1-recettori purinici, mentre sia purina (ATP, ADP) e pirimidine (UTP, UDP) nucleotidi agiscono su più recettori purinici ^P2-57.

Comunicazione intercellulare può essere indagato con metodi diversi, come carico raschiare, il trasferimento di colore, uncaging locale di agonisti come IP ₃ e Ca ^{2 +,} la stimolazione meccanica, ecc. Qui si descrive lo studio di Ca ^{2 +-propagazione} dell'onda suscitata da stimolazione meccanica di una singola cellula. Il vantaggio di studiare Ca ^{2 +-propagazione} delle onde di stimolazione meccanica è che fornisce un facile strumento per quantificare la diffusione del Ca ^{2 +-onda} nel tempo e permette confrontando quantitativamente diversi pretrattamenti delle cellule. Nell'endotelio corneale, questi intercellulare Ca ^{2 +-onde} consentire un corisposta coordinata dal monostrato, con la presente in qualità di un possibile meccanismo di difesa del non-rigenerativa dell'endotelio corneale aiutando l'endotelio a resistere alle sollecitazioni extracellulari durante l'intervento chirurgico intraoculare, o in caso di esposizione di mediatori infiammatori durante rigetto immunitario o uveite ^58,59.

Protocol

1. Isolamento di cellule endoteliali corneali Prima di iniziare: Isolare le cellule dagli occhi freschi, ottenuti da un macello locale, il più presto possibile dopo enucleare l'occhio. Assicurarsi che l'occhio è stato enucleato da una mucca di massimi 18 mesi di età, a cinque minuti post mortem e conservate in soluzione salina bilanciata di Earle – soluzione di iodio 1% a 4 ° C per il trasporto al laboratorio. Prendete l'occhio di soluzione salina bilanciata del Ea…

Representative Results

Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione e il protocollo viene dimostrato viene eseguita sotto la guida e l'approvazione della cura degli animali e del Comitato utilizzo del KU Leuven. Nelle cellule endoteliali corneali bovina (BCEC), giunzioni gap funzionali sono espresse e sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrine contribuiscono in modo significativo alla co…

Discussion

In questo manoscritto, si descrive un metodo semplice per misurare intercellulare Ca ^{2 +-propagazione} delle onde in monostrati di cellule endoteliali corneali bovina primarie, fornendo una stimolazione meccanica localizzato e controllato utilizzando una micropipetta. Cellule stimolate meccanicamente rispondono con un aumento locale della IP intracellulare ₃ e Ca ^{2 +,} che sono entrambi essenziali molecole di segnalazione intracellulare che guidano intercellulare Ca ^{2 +-propagazione</…}

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller