Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Summary

Intercellulært Ca^{2 +}-Bølger er drevet av gap junction kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å måle intracellulære Ca^{2 +}-Bølger i cellemonolagene i respons på en lokal encellet mekanisk stimulus og dens anvendelse for å undersøke egenskapene til og regulering av gap junction kanaler og hemichannels.

Abstract

Intercellulær kommunikasjon er viktig for samordning av fysiologiske prosesser mellom celler i en rekke organer og vev, inkludert hjernen, leveren, retina, sneglehuset og blodkar. I eksperimentelle innstillinger, intercellulære Ca ^{2 +-bølger} kan bli fremkalt ved å anvende en mekanisk stimulus til en enkelt celle. Dette fører til frigivelse av de intracellulære signalmolekyler IP ₃ og Ca ^{2 +} som initierer formering av Ca ^{2 +-bølge} konsentrisk fra det mekanisk stimulert celle til nabocellene. De viktigste molekylære mekanismer som styrer intercellulært Ca ^{2 +-bølgeutbredelse} leveres av gap junction kanaler gjennom direkte overføring av IP ₃ og ved hemichannels gjennom utgivelsen av ATP. Identifisering og karakterisering av egenskapene og regulering av ulike connexin og pannexin isoformer som gap junction kanaler og hemichannels er tillatt av quantification for spredning av den intercellulære Ca ^{2 +-bølge,} siRNA, og anvendelse av inhibitorer av gap junction kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å måle intracellulære ^{Ca2 +-bølge} i monolag av primære corneale endotelial-celler lastet med Fluo4-AM som reaksjon på en kontrollert og lokalisert mekanisk stimulus provosert av en akutt, kortvarig deformasjon av cellen som et resultat for å trykke på cellemembranen med en mikromanipulator-styrt glass mikropipette med en spiss diameter på mindre enn 1 pm. Vi beskriver også isolasjon av primære bovine corneale endotelial-celler og dens bruk som modellsystem for å vurdere Cx43-hemichannel aktivitet som det drevne kraft for intercellulær Ca ^{2 +-bølger} gjennom frigjøring av ATP. Avslutningsvis diskuterer vi bruk, fordeler, begrensninger og alternativer av denne metoden i sammenheng med gap veikryss kanal og hemichannel forskning.

Introduction

Intercellulær kommunikasjon og signal er vesentlig for koordinering av fysiologiske prosesser som respons på ekstracellulære agonister ved vev-og hel-organ nivå ^1,2. Den mest direkte måten å intercellular kommunikasjon er skapt av forekomsten av gap veikryss. Gap veikryss er plaketter av gap junction kanaler, som er proteinholdige kanaler dannet av head-to-head dokking av to connexin (Cx) hemichannels av tilstøtende celler ^3,4 (figur 1). Gap veikryss tillate passasje av små signalmolekyler med en molekylvekt på mindre enn 1,5 kDa, blant Ca ^{2 +} eller IP ₃ ^5, forårsaker og modulere ^{Ca2 +-frigjøring} fra de intracellulære lagre av nabocellene ⁶ (figur 2). Gap junction kanaler er strengt regulert av intra-og intermolekylær protein interaksjoner og av cellulære signalering prosesser, som redoks modifikasjon ogfosforylering ^7. Gjs rette for koordinert respons av tilkoblede celler, og dermed fungerer som en kjemisk og elektrisk syncytium. For eksempel, er spredning av kardial aksjonspotensiale tvers av de atriale og ventrikulære myocytter mediert av Cx-baserte GJ kanaler ^85. CXS ikke bare har en rolle som gap junction kanaler, men også danne uparede hemichannels, og derved fungerer som kanaler i membraner på samme måte som vanlige ionekanaler ^8-10 (figur 1). Hemichannels delta i parakrine signalering mellom nabocellene ved å kontrollere utveksling av ioner og signalmolekyler mellom intra-og ekstracellulære miljøet.

I mange celletyper (som epitelceller, osteoblastiske celler, astrocytes, endotelceller, osv.) og organer (som hjerne, lever, netthinne, sneglehuset og blodkar), intracellulære Ca ^{2 +-bølger} er grunnleggende for koordinering av flercellede svar <sup> 11. Økninger i intracellulær Ca ^{2 +-nivåer} i en viss celle er ikke begrenset til denne celle, men forplanter seg til de omkringliggende nabocellene, for derved å etablere et intercellulært Ca ^{2 +-bølge 12,13.} Disse intercellulært Ca ^{2 +-bølger} er viktig for normal fysiologisk regulering av celle lag som syncytium og deres dysregulation har vært forbundet med patofysiologiske prosesser ^11. I hornhinnen endotelet og epitel, studerte ulike grupper ^14-24, inkludert vår egen ^25-33, mekanismer og roller intercellular kommunikasjon. I ikke-eksiterbare celler, som corneale endotelial-celler, to forskjellige moduser av intercellulær kommunikasjon forekomme ^28,29, nemlig gap junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon. Gap junctional intercellular kommunikasjon innebærer en direkte utveksling av signalmolekyler via gap veikryss ^7. Gap juncnale intercellular kommunikasjon er avgjørende for å opprettholde vev homeostase, kontrollere cellevekst, og etablere en synkronisert svar på ekstracellulær stresset ^10,34,35. I et antall patologiske tilstander, er gap junction kopling redusert på grunn av defekte CXS og herved påvirker gapet junctional intercellulær kommunikasjon ^36. Dette understreker viktigheten og innflytelse gap junctional intercellular kommunikasjon i flercellede organismer. I motsetning til gapet junctional intercellulær kommunikasjon, er parakrin intercellulær kommunikasjon ikke avhengig av celle-celle-apposisjon, siden det innebærer frigjøring av diffunderbart ekstracellulære budbringere (figur 2). Ulike typer signalmolekyler blir utgitt i ekstracellulære rommet ved å signalisere celler. Molekylet blir deretter transportert til målcellen hvor det detekteres av et spesifikt reseptorprotein. Deretter reseptor-signal kompleks induserer en cellulær respons, somble avsluttet ved fjerning av signalet, inaktivering eller desensitivisering. Utgitt lipofile ekstracellulære signalmolekyler budbringere trenge gjennom membranen og handle på intracellulære reseptorer. I motsetning, gjør hydrofile budbringere ikke krysse plasmamembranen hos det reagerer celle, men opptrer som en ligand som binder seg til overflaten-uttrykte reseptor proteiner, som deretter videresender signalet til det intracellulære miljøet. Tre store familier av celleoverflaten reseptor proteiner delta i denne prosessen: ion-channel-forbundet, enzyme-linked, og G protein-koblet. Den frigjorte messenger molekyl kan opptre på reseptorene av den samme celle (autokrin), på målceller i umiddelbar nærhet (parakrine), eller på fjerne målceller som krever sirkulasjonssystemet (endokrine).

I mange celletyper, inkludert corneal endothelium ^28,29, ATP er en av de store hydrofile, parakrine faktorene som driver forplantningen av intercellulære Ca ^{2 +-bølger 37-40.} During mekanisk deformasjon, hypoksi, betennelse eller stimulering av ulike agenter, kan ATP bli løst fra friske celler ^41-44 i respons til skjærspenning, strekke, eller osmotisk hevelse ^44,45. Forskjellige ATP-frigjøringsmekanismer er blitt postulert, inkludert vesikulært exocytose ⁴⁴ og en mengde av transport-mekanismer, slik som ATP-bindende kassett (ABC) transportører, plasmalemmal spenningsavhengige anion kanaler ^46, P2X7 receptor kanaler ^47,48, samt connexin hemichannels ^49-52 og pannexin hemichannels ^43,49,53. Extracellular ATP kan være hurtig hydrolyseres til ADP, AMP og adenosin ^54,55 ved ectonucleotidases som er til stede i det ekstracellulære miljø. Den ekstracellulært utgitt ATP og dets metabolitt ADP ⁵⁶ vil spre seg gjennom diffusjon. Den etterfølgende interaksjon av disse nukleotidene med purinergiske reseptorer i de nærliggende celler har vært implisert i propagation av intercellular Ca ^{2 +-bølger 28,37,51.} To forskjellige klasser av purinergiske reseptorer finnes: adenosin er den viktigste naturlige ligand for P1-purinoceptors, mens både purine (ATP, ADP) og pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider handle på de fleste P2-purinoceptors ^57.

Intercellulær kommunikasjon kan bli undersøkt av ulike metoder som skrape lasting, fargestoff overføring, lokale uncaging av agonister som IP ₃ og Ca ^{2 +,} mekanisk stimulering, etc.. Her beskriver vi studiet av Ca ^{2 +-bølgeutbredelse} fremkalt ved mekanisk stimulering av en enkelt celle. Fordelen med å studere Ca ^{2 +-bølgeutbredelse} av mekanisk stimulering er at det gir et enkelt verktøy for å kvantifisere spredningen av Ca ^{2 +-bølge} over tid, og det gir kvantitativt sammenligne ulike forbehandling av cellene. I hornhinnen endotelet, disse intercellulært Ca ^{2 +-bølger} tillate en cokoordinert respons fra monolaget, herved opptrer som en mulig forsvarsmekanisme av den ikke-regenerative corneal endothelium hjelpe endotelet til å motstå påkjenninger under ekstracellulære intraokulær kirurgi, eller ved eksponering for inflammatoriske mediatorer under immun avvisning eller uveitt ^58,59.

Protocol

En. Isolering av Hornhinnen endotelceller Før du begynner: Isoler celler fra friske øyne, hentet fra et lokalt slakteri, så snart som mulig etter enucleating øyet. Sørg for at øyet ble enucleated fra en ku av maksimale 18 måneder gammel, fem minutter etter avliving og bevart i Earles Balanced Salt Solution – 1% jod-løsning ved 4 ° C for transport til laboratoriet. Ta øyet ut av Earles Balanced Salt Solution – 1% jod løsning og plassere den i en petriskål (100 x 20 mm)….

Representative Results

Alle eksperimentene er utført i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, forskrifter og kontrollorganer og protokollen blir demonstrert utføres under veiledning og godkjenning av dyr omsorg og bruk komité av KU Leuven. I bovine corneale endotelial-celler (BCEC), er funksjonelle gap veikryss og uttrykt både gapet junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon bidra vesentlig til intercellulær kommunikasjon på en interaktiv måte, men den viktigste st…

Discussion

I dette manuskriptet, beskriver vi en enkel metode for å måle intracellulære ^{Ca2 +-bølgeforplantning} i monolag av primære bovine corneale endotelial-celler ved å tilveiebringe en lokal og kontrollert mekanisk stimulering ved hjelp av en mikropipette. Mekanisk stimulerte celler reagere med en lokal økning i intracellulært IP ₃ og Ca ^{2 +,} som begge er essensielle intracellulære signalmolekyler som driver intercellulære Ca ^{2 +-bølgeutbredelse 11,67.} IP ₃ er …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller