Межклеточной Ca<sup> 2 +</sup>-Волны обусловлено щелевые каналы и полуканалы. Здесь мы описываем метод измерения межклеточных Са<sup> 2 +</sup>-Волн в монослоев клеток в ответ на местные одноклеточные механический стимул и его применение для исследования свойств и регулирование щелевые каналы и полуканалы.
Межклеточной коммуникации имеет важное значение для координации физиологических процессов между клетками в различных органах и тканях, в том числе головного мозга, печени, сетчатки, улитки и сосудов. В экспериментальных условиях, межклеточные Са 2 +-волны могут быть вызваны применением механической стимул к одной ячейке. Это приводит к высвобождению внутриклеточных сигнальных молекул IP-3 и Са 2 +, которые инициируют распространения Са 2 +-волны концентрически с механически стимулированных ячейки в соседних ячейках. Основные молекулярные пути, которые контролируют межклеточную Ca 2 +-волн предоставляются щелевых каналов, через прямую передачу IP 3 и полуканалы посредством высвобождения АТФ. Идентификация и характеристика свойств и регулирование различных коннексином и pannexin изоформы, что щелевые каналы и полуканалы допускаются quantificatioн распространения межклеточного Са 2 +-волны, миРНК, а также использование ингибиторов щелевых каналов и полуканалы. Здесь мы опишем метод для измерения межклеточных Ca 2 +-волны в монослоя эндотелия роговицы первичной клетки, нагруженные Fluo4-AM в ответ на контролируемые и локализованные механический стимул спровоцированы острые, кратковременные деформации ячейки в результате прикосновения к клеточной мембране с микроманипулятор-стекло с контролируемым размером микропипетки с наконечником диаметром менее 1 мкм. Мы также описывают выделение первичной бычьей роговицы эндотелиальные клетки и ее использование в качестве модельной системы для оценки Cx43-гемиканала активность в качестве ведомого силу для межклеточных Са 2 +-волн через высвобождение АТФ. Наконец, обсуждается использование, преимущества, ограничения и варианты этого метода в контексте разрыв канал перехода и гемиканала исследований.
Межклеточные связи и сигнализации имеют важное значение для координации физиологических процессов в ответ на внеклеточный агонистов на тканевом и оптово-органном уровне 1,2. Наиболее прямым способом межклеточной коммуникации создается возникновение щелевые контакты. Щелевые контакты являются бляшки каналов щелевых контактов, которые являются белковые каналы, образованные голова к голове стыковка двух коннексином (Cx) полуканалы соседних ячеек 3,4 (рис. 1). Щелевые соединения для прохода небольших сигнальных молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа, в том числе Са 2 + или 3 IP 5, в результате чего и модуляции Са 2 +-высвобождения из внутриклеточных запасов соседних ячеек 6 (фиг. 2). Каналов щелевых соединений жестко регулируется по внутри-и межмолекулярных взаимодействий белков и клеточных сигнальных процессах, как изменение и окислительно-восстановительныефосфорилирования 7. GJS облегчения согласованных действий связанных клеток, тем самым выступая в качестве химических и электрических синцитий. Например, распространение потенциала действия сердца через предсердных и желудочковых миоцитов опосредовано Cx основе каналов ГДж 85. CxS не только играют роль каналов щелевых контактов, но и формируют непарных полуканалы, тем самым функционируют как каналы в мембранах аналогично регулярных ионных каналов 8-10 (рис. 1). Полуканалы участвовать в паракринная сигнализации между соседними ячейками, контролируя обмена ионов и сигнальных молекул между внутри-и внеклеточной среде.
Во многих типах клеток (например, эпителиальные клетки, клетки остеобластов, астроциты, эндотелиальные клетки и т.д.) и органов (например, мозга, печени, сетчатки, улитки и сосудистой), межклеточные Са 2 +-волны имеют основополагающее значение для координации многоклеточных ответов <suP> 11. Увеличение внутриклеточного Са 2 + уровня в определенной ячейке не ограничивается этой клетке, но распространяются на окружающие соседние клетки, тем самым создавая межклеточных Са 2 +-волны 12,13. Эти межклеточные Са 2 +-волны имеют важное значение для нормальной физиологической регуляции клеточного слоя, как синцития и их регуляции был связан с патофизиологических процессах 11. В эндотелий роговицы и эпителия, различные группы 14-24, в том числе наши собственные 25-33, изучал механизмы и роли межклеточной коммуникации. В не-возбудимых клеток, как и эндотелиальные клетки роговицы, два различных режима межклеточной коммуникации происходят 28,29, а именно щелевые межклеточные связи и паракринные межклеточной коммуникации. Межклеточных щелевых контактов, коммуникация предполагает прямого обмена сигнальными молекулами через щелевые контакты 7. Gap переходаминых межклеточной коммуникации имеет решающее значение для поддержания тканевого гомеостаза, контроле пролиферации клеток, а также создание синхронизированных ответ на внеклеточный стресса 10,34,35. В ряде патологий, связь щелевых контактов снижается из-за дефектных CxS, и тем самым влияет щелевых межклеточных взаимодействий 36. Это подчеркивает важность и влияние щелевых межклеточных взаимодействий в многоклеточных организмах. В отличие от щелевых межклеточных коммуникаций, паракринные межклеточной коммуникации не зависит от межклеточной аппозиции, так как он связан с высвобождением диффузии внеклеточных мессенджеров (рис. 2). Различные типы сигнальных молекул высвобождаются во внеклеточном пространстве путем передачи сигналов клетками. Молекула затем транспортируется в клетки-мишени, где он обнаружен конкретный белок рецептора. Впоследствии рецептор-сигнал комплекс индуцирует клеточный ответ, которыйпрекращается путем удаления сигнала, инактивации или десенсибилизации. Выхода липофильных внеклеточной сигнализации посланников проникают в мембрану и действуют на внутриклеточные рецепторы. С другой стороны, гидрофильный посланники не проходят через плазматическую мембрану ответ клетки, но действовать как лиганд, который связывается с поверхностью экспрессированный рецептор белков, которые затем передают сигнал на внутриклеточную среду. Три основных семейств белков клетки поверхностным рецептором участвовать в этом процессе: ионно-канала связаны между собой, энзим-связанного, и протеин-связанные. Выпущен мессенджера молекула может действовать на рецепторы той же клетке (аутокринная) на клетки-мишени в непосредственной близости (паракринная) или на удаленные клетки-мишени, которые требуют системы кровообращения (эндокринной).
Во многих типах клеток, включая эндотелий роговицы 28,29, АТФ является одним из основных гидрофильными, паракринная факторами, которые определяют распространение межклеточных Са 2 +-волны 37-40. Дурния механической деформации, гипоксия, воспаление или стимуляции различными агентами, АТФ может быть освобожден от здоровых клеток 41-44 в ответ на напряжение сдвига, растягивать или осмотическое набухание 44,45. Различные АТФ-релиз механизмов было постулировано, в том числе везикулярный экзоцитоз 44 и множество транспортных механизмов, таких как АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеры, плазмалеммы потенциал-зависимых анионных каналов 46, Р2Х7 рецептора каналов 47,48, а также коннексином полуканалы 49-52 и pannexin полуканалы 43,49,53. Внеклеточного АТФ может быть быстро гидролизуется до АДФ, АМФ и аденозин 54,55 по ectonucleotidases, которые присутствуют во внеклеточной среде. Внеклеточно выпущен АТФ и АДФ его метаболита 56 будет распространяться путем диффузии. Последующее взаимодействие этих нуклеотидов с пуринергической рецепторов в соседних ячейках было вовлечено в рropagation межклеточного Ca 2 +-волны 28,37,51. Два различных классов пуринергической рецепторы присутствуют: аденозин является основным природным лигандом для P1-пуриноцепторов, в то время как пурин (АТФ, АДФ) и пиримидиновые (UTP, UDP) нуклеотидов действовать на наиболее P2-пуриноцепторов 57.
Межклеточной коммуникации могут быть исследованы различными методами, такими как загрузка путем соскоба перенос красителя, местные uncaging агонистов, как IP 3 и Ca 2 +, механическое раздражение, и т.д.. Здесь мы опишем изучение Ca 2 +-волн вызванного механической стимуляции одной ячейки. Преимущество изучения Са 2 +-волн при механическом раздражении в том, что он обеспечивает легкий инструмент для количественной оценки распространения Ca 2 +-волны в течение долгого времени, и это позволяет количественно сравнения различных предварительной обработки клеток. В эндотелий роговицы, эти межклеточные Ca 2 +-волны позволяют сотрудничествасогласованный ответ от монослоя, добровольно выступает в качестве возможного механизма защиты нерегенеративная эндотелий роговицы помогают противостоять эндотелий внеклеточный напряжений при внутриглазной хирургии, или под воздействием медиаторов воспаления во время иммунного отторжения или увеит 58,59.
В этой рукописи, мы опишем простой метод измерения межклеточных Ca 2 +-волн в монослоям первичных бычьих эндотелиальных клеток роговицы путем предоставления локализованных и контролируемой механической стимуляции с помощью микропипетки. Механически стимулированных клетки реаг?…
The authors have nothing to disclose.
Научно-исследовательская работа выполнена в лаборатории при поддержке грантов от Фонда исследований в области – Фландрия (FWO; номера грантов и G.0545.08 G.0298.11), Межвузовской достопримечательность поляков программы (бельгийские политики в области науки; P6/28 номер гранта и P7/13) и встроена в FWO Исследования, поддерживаемые сообществом. ЦРБ после защиты докторской диссертации научно-исследовательского фонда – Фландрия (FWO). Авторы очень благодарны всем нынешним и бывшим членам лаборатории молекулярной и клеточной сигнализации (Католический университет Левена), д-р SP Шринивас (Университет Индианы Школа оптометрии, США), лаборатория доктора Leybaert (Гентский университет) и Доктор Vinken (БСУ), которые предоставили полезные обсуждения, оптимизированные процедуры или были вовлечены в разработку инструментов для изучения коннексином полуканалы.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Column1 |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 14155-048 | |
Iodine | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | 38060-1EA | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 11960-044 | |
L-glutamine (Glutamax) | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 35050-038 | |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A2942 | |
Antibiotic-antimycotic mixture | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 15240-096 | |
Trypsin | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 25300-054 | |
Dulbecco’s PBS | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | 14190-091 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) | F14217 | |
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A265 | |
Apyrase VI | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A6410 | |
Apyrase VII | Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) | A6535 | |
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) | Custom peptide synthesis | ||
Gap27 (SRPTEKTIFII) | Custom peptide synthesis | ||
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) | Custom peptide synthesis | ||
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) | Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium) | ||
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) | Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium) | ||
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) | Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium) | ||
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) | Thermo Electron (Ulm, Germany) | ||
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) | Thermo Electron (Ulm, Germany) | ||
Two chambered glass slides | Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) | 155380 | |
Confocal microscope | Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) | LSM510 | |
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) | PI Polytech (Karlsruhe, Germany) | P-280 | |
HVPZT-amplifier | PI Polytech (Karlsruhe, Germany) | E463 HVPZT-amplifier | |
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) | World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA | 4878 | |
Microelectrode puller | Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) | WZ DMZ-Universal Puller |