Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Summary

Intercelular Ca^{2 +} Las ondas son conducidas por canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí se describe un método para medir intercelular Ca^{2 +}-Ondas en monocapas de células en respuesta a un estímulo mecánico de una sola célula local y su aplicación para investigar las propiedades y la regulación de los canales y hemichannels brecha de la salida.

Abstract

La comunicación intercelular es esencial para la coordinación de procesos fisiológicos entre las células en una variedad de órganos y tejidos, incluyendo el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y la vasculatura. En la configuración experimental, intercelular Ca ^{2 +-ondas} puede ser obtenido mediante la aplicación de un estímulo mecánico a una sola celda. Esto conduce a la liberación de las moléculas intracelulares de señalización IP ₃ y Ca ^{2 +} que iniciar la propagación de la Ca ² de la onda ⁺ concéntricamente desde la célula estimulada mecánicamente a las células vecinas. Las principales vías moleculares que controlan intercelular Ca ² de propagación de la onda ⁺ son proporcionados por los canales de salida brecha a través de la transferencia directa de IP ₃ y hemichannels a través de la liberación de ATP. Identificación y caracterización de las propiedades y la regulación de diferentes conexina y isoformas pannexin como canales y hemichannels brecha de la salida son permitidas por el quantification de la propagación de la intercelular Ca ² de la onda ^+, ARNsi, y el uso de inhibidores de canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí, se describe un método para medir intercelular Ca ² de la onda ⁺ en monocapas de células endoteliales corneales primarias cargado con Fluo4-AM en respuesta a un estímulo mecánico controlado y localizado provocado por una deformación aguda, de corta duración de la célula como resultado de tocar la membrana celular con una micropipeta de vidrio micromanipulador-controlado con un diámetro de la punta de menos de 1 m. También describe el aislamiento de células endoteliales corneales bovinas primarias y su uso como sistema modelo para evaluar la actividad Cx43-hemicanal como la fuerza impulsada por intercelular Ca ^{2 +-ondas} a través de la liberación de ATP. Finalmente, se discute el uso, ventajas, limitaciones y alternativas de este método en el contexto del canal brecha de la salida y la investigación hemicanal.

Introduction

La comunicación intercelular y la señalización son fundamentales para la coordinación de los procesos fisiológicos en respuesta a los agonistas extracelular en el tejido y ^1,2 a nivel de todo el órgano. La forma más directa de comunicación intercelular es creada por la aparición de uniones. Gap cruces son las placas de los canales de salida brecha, que son canales proteicos formados por la cabeza a la cabeza de acoplamiento de dos (Cx) hemichannels conexina de células adyacentes ^3,4 (Figura 1). Gap cruces permiten el paso de pequeñas moléculas de señalización con un peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluyendo Ca ^{2 +} o IP ₃ ^5, causando y la modulación de Ca ^{2 +-liberación} de los almacenes intracelulares de las células vecinas ⁶ (Figura 2). Canales de salida brecha están fuertemente regulados por intra e intermolecular interacciones de las proteínas y los procesos de señalización celular, como la modificación redox yfosforilación ^7. Gjs facilitar la respuesta coordinada de células conectadas, actuando como un sincitio química y eléctrica. Por ejemplo, la propagación del potencial de acción cardíaco a través de los miocitos auriculares y ventriculares está mediada por canales GJ Cx basados ​​en ^85. Cxs no sólo tienen un papel como canales de salida brecha, pero también forman hemichannels no apareados, de esta manera funcionarán como canales en las membranas de manera similar a los canales de iones regulares ^8-10 (Figura 1). Hemichannels participan en la señalización paracrina entre las células vecinas mediante el control del intercambio de iones y moléculas de señalización entre el medio ambiente intra-y extracelular.

En muchos tipos de células (como las células epiteliales, células osteoblásticas, astrocitos, células endoteliales, etc) y los órganos (como el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y el sistema vascular), intercelular Ca ^{2 +} olas son fundamentales para la coordinación de las respuestas multicelulares <sup> 11. Los aumentos en intracelulares de Ca ⁺ niveles ² en una determinada célula no se limitan a esta célula, pero se propagan a las células vecinas que rodean, estableciendo de ese modo un Ca intercelular ² de la onda ^{+ 12,13.} Estos intercelular Ca ^{2 +-ondas} son importantes para la regulación fisiológica normal de las capas de células como un sincitio y su desregulación se ha asociado con los procesos fisiopatológicos ^11. En el endotelio corneal y el epitelio, los diferentes grupos de ^14-24, incluyendo la nuestra ^25-33, estudiaron los mecanismos y las funciones de la comunicación intercelular. En células no excitables, como las células endoteliales de la córnea, dos modos distintos de la comunicación intercelular se producen ^28,29, a saber brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina. Brecha ocasiones la comunicación intercelular implica un intercambio directo de moléculas de señalización a través de las uniones comunicantes ^7. Gap juncla comunicación intercelular nal es crítico para mantener la homeostasis del tejido, el control de la proliferación celular, y el establecimiento de una respuesta sincronizada al estrés extracelular ^10,34,35. En una serie de patologías, acoplamiento brecha de la salida se reduce debido a Cxs defectuosos, y por este medio que afecta brecha ocasiones la comunicación intercelular ^36. Esto pone de relieve la importancia y la influencia de la brecha ocasiones la comunicación intercelular en los organismos multicelulares. En contraste con brecha ocasiones la comunicación intercelular, la comunicación intercelular paracrina no depende de la aposición de célula a célula, ya que implica la liberación de mensajeros extracelulares difusibles (Figura 2). Los diferentes tipos de moléculas de señalización se liberan en el espacio extracelular por señalización de células. La molécula se transporta a la célula diana donde se detecta por una proteína receptora específica. Posteriormente, el complejo receptor-señal induce una respuesta celular, que sese termina mediante la retirada de la señal, la inactivación o la desensibilización. Lipofílicas mensajeros de señalización extracelular Lanzamiento penetrar la membrana y actúan sobre los receptores intracelulares. En contraste, mensajeros hidrofílicos no atraviesan la membrana plasmática de la célula responder, sino que actúan como un ligando que se une a las proteínas del receptor expresado en la superficie, que luego se retransmiten la señal para el medio ambiente intracelular. Tres grandes familias de proteínas del receptor de la superficie celular que participen en este proceso: los canales iónicos-ligado, unido a enzima y la proteína G-vinculados. La molécula mensajera liberado puede actuar sobre los receptores de la misma célula (autocrina), sobre las células diana en estrecha proximidad (paracrina), o en las células diana distantes que requieren el sistema circulatorio (endocrina).

En muchos tipos de células, incluyendo endotelio corneal ^28,29, ATP es uno de los principales factores hidrófilos, paracrinos que impulsan la propagación de intercelular Ca ^{2 +-ondas 37-40.} DurING deformación mecánica, la hipoxia, la inflamación o la estimulación por diversos agentes, el ATP puede ser liberado de las células sanas ^41-44 en respuesta a la tensión de corte, estiramiento, o osmótica hinchazón ^44,45. Diferentes mecanismos de ATP de liberación se han postulado, incluyendo exocitosis vesicular ⁴⁴ y una plétora de mecanismos de transporte, tales como transportadores de unión a ATP de cassette (ABC), canales de aniones dependientes de voltaje plasmalemmal ^46, P2X7 canales de los receptores de ^47,48, así como conexina hemichannels ^49-52 y pannexin hemichannels ^43,49,53. ATP extracelular puede ser hidroliza rápidamente a ADP, AMP y adenosina ^54,55 por ectonucleotidasas que están presentes en el medio ambiente extracelular. El ATP liberado extracelularmente y su metabolito ADP ⁵⁶ se extenderán a través de la difusión. La posterior interacción de estos nucleótidos con los receptores purinérgicos en las células vecinas se ha implicado en la propagation de intercelular Ca ^{2 +} olas ^28,37,51. Dos clases diferentes de receptores purinérgicos están presentes: la adenosina es el principal ligando natural para P1-purinoceptores, mientras tanto purina (ATP, ADP) y la pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actúan en la mayoría de P2-purinoceptores ^57.

La comunicación intercelular puede ser investigado por diferentes métodos, tales como la carga de raspadura, la transferencia de tintes, uncaging local de los agonistas como IP ₃ y Ca ^{2 +,} la estimulación mecánica, etc. A continuación se describe el estudio de Ca ² de propagación de la onda ⁺ provocada por la estimulación mecánica de una sola célula. La ventaja de estudiar Ca ² de propagación de la onda ⁺ por estimulación mecánica es que proporciona una herramienta fácil de cuantificar la propagación de la Ca ² de la onda ⁺ en el tiempo y que permite comparar cuantitativamente diferentes pretratamientos de las células. En el endotelio corneal, estos intercelular Ca ^{2 +} olas permiten una corespuesta coordinada de la monocapa, por este medio que actúa como un posible mecanismo de defensa del endotelio corneal no regenerativa ayudar al endotelio para soportar tensiones extracelulares durante la cirugía intraocular, o tras la exposición a mediadores de la inflamación durante el rechazo inmunológico o uveítis ^58,59.

Protocol

1. Aislamiento de células endoteliales de la córnea Antes de empezar: Aislar las células de los ojos frescos, obtenidos de un matadero local, tan pronto como sea posible después de la enucleación del ojo. Asegúrese de que el ojo fue enucleado de una vaca de máximos de 18 meses, cinco minutos después de la autopsia y conservados en solución salina equilibrada de Earle – solución de yodo al 1% a 4 ° C para su transporte al laboratorio. Tome el ojo de solución salina equi…

Representative Results

Todos los experimentos se realizan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras y el protocolo que se está demostrado se lleva a cabo bajo la dirección y aprobación del cuidado de los animales y el empleo de la Universidad Católica de Lovaina. En las células endoteliales corneales bovinas (BCEC), uniones funcionales se expresan y ambos brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina contribuyen de manera signif…

Discussion

En este manuscrito, se describe un método simple para medir intercelular Ca ^{2 +} de propagación de la onda en monocapas de células endoteliales corneales bovinas primarias, proporcionando una estimulación mecánica localizada y controlada utilizando una micropipeta. Mecánicamente células estimuladas responden con un aumento local de IP intracelular ₃ y Ca ^{2 +,} ambos de los cuales son moléculas de señalización intracelulares esenciales que impulsan intercelular Ca ^{2 + en</sup…}

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller