Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Summary

Intercellulär Ca^{2 +}-Vågor drivs av kanaler gap junction och hemichannels. Här beskriver vi en metod för att mäta intercellulär Ca^{2 +}-Vågor i cellmonoskikten som svar på en lokal encelliga mekanisk stimulus och dess tillämpning för att undersöka egenskaperna och reglering av kanaler gap junction och hemichannels.

Abstract

Intercellulär kommunikation är avgörande för samordningen av fysiologiska processer mellan celler i olika organ och vävnader, inklusive hjärnan, lever, retina, cochlea och kärlsystemet. I experimentella inställningar, intercellulär Ca ^{2 +-vågor} kan framkallas genom att applicera en mekanisk stimulans till en enda cell. Detta leder till frisättning av de intracellulära signalmolekyler IP ₃ och Ca ^{2 +} att initiera propagering av Ca ^{2 +-våg} koncentriskt från den mekaniskt stimulerad cell till de angränsande cellerna. De huvudsakliga molekylära vägar som kontrollerar intercellular ^{Ca2 +-vågutbredning} tillhandahålls av kanaler gap junction genom direkt överföring av IP ₃ och hemichannels genom frisättning av ATP. Identifiering och karaktärisering av egenskaper och regleringen av olika connexin och pannexin isoformer såsom kanaler gap junction och hemichannels tillåts av quantification för spridning av den intercellulära Ca ^{2 +-våg,} siRNA, och användningen av inhibitorer av kanaler gap junction och hemichannels. Här beskriver vi en metod för att mäta intercellulär Ca ^{2 +-våg} i monoskikt av primära korneala endotelceller laddad med Fluo4-AM som svar på ett kontrollerat och lokaliserad mekanisk stimulering som framkallats av en akut, kortvarig deformation av cellen som en följd av att peka på cellmembranet med en mikromanipulator kontrollerad glasmikropipett med en spets diameter av mindre än 1 | im. Vi beskriver också isoleringen av primära nötkreatur hornhinnan endotelceller och dess användning som modell för att bedöma Cx43-hemichannel aktivitet som den drivna kraft för intercellular ^{Ca2 +-vågorna} genom frisättning av ATP. Slutligen diskuterar vi användning, fördelar, begränsningar och alternativ av denna metod inom ramen för gap junction-kanal och hemichannel forskning.

Introduction

Kommunikationen mellan och signalering är avgörande för samordningen av fysiologiska processer som svar på extracellulära agonister vid vävnaden och hela-orgel nivån ^1,2. Det mest direkta sättet att kommunikationen mellan skapas av förekomsten av kanalförbindelser. Kanalförbindelser är plack av kanaler gap junction, som är proteinhaltiga kanaler bildade av head-to-head dockning av två connexin (Cx) hemichannels av angränsande celler ^3,4 (Figur 1). Kanalförbindelser tillåta passage av små signalmolekyler med en molekylvikt av mindre än 1,5 kDa, inklusive Ca ^{2 +} eller IP ₃ ^5, vilket leder till och modulera ^{Ca2 +-frisättning} från intracellulära förråd av de angränsande cellerna ⁶ (figur 2). Gap junction kanaler hårt reglerad av intra-och intermolekylära proteininteraktioner och cellulär signalering processer, liksom redox modifiering ochfosforylering ^7. GJS underlätta ett samordnat svar på anslutna celler, och därmed utgöra en kemisk och elektrisk syncytium. Till exempel är spridningen av hjärtats aktionspotential över atriella och ventrikulära myocyter medieras av Cx-baserade GJ kanaler ^85. CXS inte bara ha en roll som kanaler gap junction, men också bilda oparade hemichannels, fungerar därmed som kanaler i membran på samma sätt som vanliga jonkanaler ^8-10 (Figur 1). Hemichannels deltar i parakrina signalering mellan angränsande celler genom att reglera utbytet av joner och signalmolekyler mellan intra-och extracellulära miljön.

I många celltyper (såsom epitelceller, osteoblastceller, astrocyter, endotelceller, etc.) och organ (som hjärna, lever, retina, cochlea och kärlsystemet), intercellulär ^{Ca2 +-vågorna} är grundläggande för samordningen av flercelliga svar <sup> 11. Ökningar i intracellulära ^{Ca2 +-nivåer} i en viss cell är inte begränsade till denna cell, men propagera till omgivande angränsande celler, varigenom det skapas en intercellulär Ca ^{2 +-våg 12,13.} Dessa intercellulär Ca ^{2 +-vågor} är viktiga för normal fysiologisk reglering av cellskikt som ett syncytium och deras dysreglering har associerats med patofysiologiska processer ^11. I hornhinneendotel och epitel, studerade olika grupperna ^14-24, inklusive vår egen ^25-33, mekanismer och roller kommunikationen mellan. I icke-retbara celler, liksom hornhinnan endotelceller, två distinkta former av kommunikationen mellan inträffar ^28,29, nämligen klyftan junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan. Gap junktional kommunikationen mellan innebär ett direkt utbyte av signalmolekyler via gap junctions ^7. Gap juncnella kommunikationen mellan är avgörande för att upprätthålla vävnad homeostas, kontrollerar celltillväxt, och inrättande av en synkroniserad svar på extracellulära stressen ^10,34,35. I ett antal sjukdomar, är gap junction koppling reducerad på grund av defekta CXS, och härmed påverka gap junktional kommunikationen mellan ^36. Detta understryker vikten och påverkan av gapet junktional intracellulär kommunikation i flercelliga organismer. I motsats till gap junktional kommunikationen mellan, är parakrin kommunikationen mellan inte beroende av cell-cell apposition, eftersom det involverar frisättning av diffunderbara extracellulära budbärare (Figur 2). Olika typer av signalerande molekyler frigörs i det extracellulära utrymmet genom att signalera celler. Molekylen transporteras sedan till målcellen där den detekteras av en specifik receptorprotein. Därefter receptor-signalen komplex inducerar ett cellulärt svar, somavslutas genom avlägsnande av signalen, inaktivering eller hyposensibilisering. Släppt lipofila extracellulära signalsystem budbärare penetrera membranet och agera på intracellulära receptorer. Däremot korsar hydrofila budbärare inte plasmamembranet hos den svarande cellen, men fungera som en ligand som binder till ytuttryckta receptorproteiner, som sedan vidarebefordrar signalen till intracellulära miljön. Tre stora familjer av cellyteproteiner proteiner deltar i denna process: jon-kanal-kopplad, enzym-linked, och G-protein-kopplade. Den släpptes Budbärarmolekylen kan agera på receptorer i samma cell (autokrin), på målceller i närheten (parakrint), eller på avlägsna målceller som kräver cirkulationssystemet (endokrin).

I många celltyper, innefattande hornhinneendotel ^28,29, är ATP en av de stora hydrofila, parakrina faktorer för förökning av intercellulär Ca ^{2 +-vågor 37-40.} DurIng mekanisk deformation, hypoxi, inflammation eller stimulering av olika agenter, kan ATP frigöras från friska celler ^41-44 som svar på skjuvspänning, stretch, eller osmotisk svullnad ^44,45. Olika ATP-frigöringsmekanismer har förutsatts, inklusive vesikulär exocytos ⁴⁴ och en uppsjö av transporttjänster mekanismer, såsom ATP-bindande kassett (ABC) transportörer, plasmalemmal spänningsberoende kanaler anjon ^46, P2X7-receptorns ^47,48, samt connexin hemichannels ^49-52 och pannexin hemichannels ^43,49,53. Extracellulär ATP kan vara snabbt hydrolyseras till ADP, AMP och adenosin ^54,55 genom ectonucleotidases som är närvarande i den extracellulära omgivningen. Den extracellulärt släppt ATP och dess metabolit ADP ⁵⁶ kommer att spridas genom diffusion. Den efterföljande interaktion av dessa nukleotider med purinerga receptorer i de angränsande cellerna har varit inblandad i propagation av intercellulär Ca ^{2 +-vågor 28,37,51.} Två olika klasser av purinerga receptorer finns: adenosin är den främsta naturliga liganden för P1-purinoceptorer, medan både purin (ATP, ADP) och pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider agera på de flesta P2-purinoceptorer ^57.

Kommunikationen mellan kan undersökas med olika metoder såsom skrapa lastning, fargöverföring, lokal uncaging av agonister som IP ₃ och Ca ^{2 +,} mekanisk stimulering, osv. Här beskriver vi studiet av Ca ^{2 +-vågutbredning} framkallade genom mekanisk stimulering av en enda cell. Fördelen med att studera ^{Ca2 +-vågutbredning} genom mekanisk stimulering är att det ger ett enkelt verktyg för att kvantifiera spridningen av ^{Ca2 +-våg} över tid och det gör att kvantitativt jämföra olika förbehandlingar av cellerna. I hornhinnans endotel, dessa intercellulära ^{Ca2 +-vågor} tillåta en coordinated svar från monolagret, härmed fungerar som en möjlig försvarsmekanism i icke-regenerativ hornhinneendotel hjälper endotelet att motstå extracellulära påkänningar under intraokulär kirurgi, eller vid exponering för inflammatoriska mediatorer under immunavstötning eller uveit ^58,59.

Protocol

Ett. Isolering av hornhinnan endotelceller Innan du börjar: Isolera celler från friska ögon, som erhållits från ett lokalt slakteri, så snart som möjligt efter enucleating ögat. Se till att ögat var enukleation från en ko med maximalt 18 månader gammal, fem minuter efter slakt och bevaras i Earles Balanced Salt Solution – 1% jodlösning vid 4 ° C under transporten till laboratoriet. Ta ögat ur Earles balanserade saltlösning – 1% jodlösning och placera den i en petri…

Representative Results

Alla experiment utförs i enlighet med alla relevanta riktlinjer, föreskrifter och tillsynsmyndigheter och protokoll som demonstreras utförs under ledning och godkännande av djurets skötsel och användning kommitté av KU Leuven. I nötkreatur hornhinnans endotelceller (BCEC), är funktionella kanalförbindelser uttrycks och både lucka junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan väsentligt bidra till kommunikationen mellan på ett interaktivt sätt, men det vi…

Discussion

I detta manuskript, beskriver vi en enkel metod för att mäta intercellulär Ca ^{2 +-vågutbredning} i monoskikt av primära bovina korneala endotelceller genom att tillhandahålla en lokaliserad och kontrollerad mekanisk stimulering med användning av en mikropipett. Mekaniskt stimulerade celler reagerar med en lokal ökning av intracellulär IP ₃ och Ca ^{2 +,} båda av vilket är väsentliga intracellulära signalerande molekylar som driver intercellulär Ca ^{2 +-vågutbredning 11,67….}

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller