Agroinfiltration efficace des plantes pour l'expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes
Summary
Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible contenant<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Dans les plantes pour l'expression transitoire de protéines.
Abstract
Culture de cellules de mammifères est la plate-forme importante pour la production commerciale de vaccins humains et protéines thérapeutiques. Toutefois, il ne peut pas répondre à la demande mondiale croissante pour les produits pharmaceutiques en raison de son évolutivité limitée et coût élevé. Les plantes ont montré pour être l'une des plateformes les plus prometteuses alternatives de production pharmaceutiques qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Le développement récent de vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire rapide et à haut niveau de protéines recombinantes dans les plantes. Pour optimiser davantage l'utilité du système d'expression transitoire, nous démontrons une méthode simple, efficace et évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium dans un tissu végétal dans cette étude. Nos résultats indiquent que agroinfiltration à la fois avec une seringue vide et méthodes ont abouti à la mise en place efficace d'Agrobacterium dans des feuilles et de la production robuste de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed. Par ailleurs,nous démontrons les avantages uniques offerts par les deux méthodes. infiltration de la seringue est simple et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il permet également la souplesse voulue pour infiltrer la durée du congé avec un gène cible, ou d'introduire des gènes cibles multiples sur une feuille. Ainsi, il peut être utilisé pour l'expression de l'échelle du laboratoire de protéines recombinantes ainsi que pour comparer différentes protéines ou des vecteurs de rendement ou d'expression cinétique. La simplicité de l'infiltration de la seringue suggère également son utilité dans l'enseignement secondaire et collégial pour le sujet de la biotechnologie. En revanche, l'infiltration sous vide est plus robuste et peut être adapté en place pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Il offre également l'avantage d'être en mesure de agroinfiltrate espèces végétales qui ne se prêtent pas à l'infiltration de la seringue comme la laitue et Arabidopsis. Dans l'ensemble, la combinaison de la seringue et agroinfiltration à vide offre aux chercheurs et éducateurs un moyen simple, efficace et robusteméthodologie pour l'expression transitoire de protéines. Il va grandement faciliter le développement de protéines pharmaceutiques et de promouvoir l'enseignement des sciences.
Introduction
Depuis les années 1970, les plantes ont été étudiées comme des alternatives aux cultures de cellules de mammifères, d'insectes et des bactéries pour la production commerciale de protéines recombinantes et des protéines thérapeutiques 1. Les systèmes à base de plantes pour l'expression de produits biopharmaceutiques ont montré des résultats prometteurs au cours des dernières années, plusieurs nouveaux traitements pour les maladies, comme la maladie de Gaucher 2, et la grippe aviaire H5N1 3, ont connu le succès dans les essais cliniques. Le développement des mécanismes compétents pour l'expression de protéines recombinantes dans les plantes dans les décennies qui ont suivi ces premières expériences a créé le potentiel pour les systèmes à base de plantes pour modifier le paradigme actuel de la production de protéines pour trois raisons principales. Tout d'abord, il ya une diminution notable des coûts de bioréacteurs de mammifères, d'insectes et bactéries nécessitent des dépenses considérables de démarrage, les médias de croissance coûteux, et les processus complexes de purification en aval 4. La création de plante transgénique stablelignes leur permet aussi de dépasser l'évolutivité d'autres systèmes d'expression que les plantes exprimant des protéines pourraient être cultivées et récoltées à l'échelle agricole 5. Deuxièmement, les systèmes d'expression à base de plantes réduisent considérablement le risque de transmission d'un agent pathogène humain ou d'un animal à partir de l'hôte protéines exprimant à l'homme, ce qui démontre la supériorité de la sécurité publique 6. Enfin, les plantes utilisent un système endomembranaire eucaryote qui est semblable à des cellules de mammifères, ce qui permet à la bonne modification post-traductionnelle de protéines comprenant la glycosylation et l'assemblage des protéines à sous-unités multiples 7. Cette capacité met systèmes à base de plantes en avance sur ceux basés sur des systèmes procaryotes, comme les bactéries, car un plus grand nombre de protéines recombinantes pharmaceutiques, y compris les anticorps monoclonaux (Acm), ont une structure plus complexe et nécessiterait d'importantes modifications post-traductionnelles ou assemblage 8.
Il existe deux grands appromaux à l'expression de protéines recombinantes dans les plantes. Le premier est le développement d'une lignée transgénique stable, où l'ADN codant pour la protéine cible est clonée dans une cassette d'expression et introduit soit à des génomes nucléaires ou chloroplastiques. Pour ce faire, l'ADN étranger devient héréditaire à travers les générations et permet de considérablement amélioré l'évolutivité, bien au-delà que d'autres systèmes d'expression 1. Introduction d'ADN exogène dans le génome nucléaire est habituellement obtenue par Agrobacterium tumefaciens infection des tissus de la plante ou, plus rarement, par bombardement de microprojectiles du tissu 9. Les hormones végétales sont ensuite utilisés pour induire la différenciation et de la croissance du tissu de plante transgénique tel que les racines et les feuilles. La transformation du génome chloroplastique ne peut pas être obtenue avec A. tumefaciens, mais repose entièrement sur des particules d'or ou de tungstène recouvertes d'ADN tiré balistique dans des cellules végétales. La seconde méthode d'exprimer recombinaisonnt protéines dans les plantes est à travers l'expression transitoire 10. Dans ce scénario, les vecteurs dérivés de virus hébergeant le gène d'intérêt sont livrés via A. tumefaciens aux plantes entièrement développées par un processus appelé agroinfiltration. Au lieu d'intégrer dans le génome de la plante, la construction du gène livré va alors commencer à diriger la production transitoire de la protéine désirée, qui peut être récoltée et isolé après une courte période d'incubation. Expression transitoire de gènes offre l'avantage d'une plus grande accumulation de la protéine globale ainsi qu'une amélioration du temps de production de protéines, comme les plantes seront prêts à récolter environ 1-2 semaines après agroinfiltration 11. Ce chiffre est nettement plus rapide que les procédés de production, la sélection et la confirmation de lignées de plantes transgéniques stables, ce qui peut prendre plusieurs mois à un an. Cependant, c'est aussi la limitation du système d'expression transitoire, car il ne cédera pas génétiquement stable plante lines qui peuvent être utilisés pour générer une banque de semences pour la production commerciale à grande échelle. Malgré cela, des approches ont été développées pour améliorer l'expression transitoire à grande échelle. Ici, nous démontrons une méthode de génération de protéines exprimant transitoires Nicotiana benthamiana utilisant des vecteurs viraux déconstruits livrés par A. tumefaciens.
Deux grandes méthodes sont en cours d'élaboration pour la livraison de A. tumefaciens dans les tissus de la plante: l'infiltration de l'échelle du laboratoire via une seringue et d'infiltration à grande échelle via la chambre à vide. Les deux protocoles sont décrits ici en utilisant N. benthamiana, qui est étroitement liée à la plante de tabac commun, comme la plante hôte pour l'expression transitoire de deux protéines fluorescentes: la protéine fluorescente verte (GFP) de méduse Aequorea victoria et la protéine fluorescente rouge de Discosoma corail (DsRed) 12,13. N. benthamiana est la plante hôte la plus courante pourprotéine recombinante, car il se prête à la transformation génétique, peut produire de grandes quantités de biomasse rapidement, et est un producteur prolifique de semences pour la production à grande échelle jusqu'à 14. Un autre avantage de l'utilisation de N. benthamiana comme hôtes pour l'expression des protéines est la disponibilité d'une variété de vecteurs d'expression 2,5. Dans cette étude, deux vecteurs viraux déconstruits, l'un basé sur un ARN système réplicon (vecteurs MagnICON) et l'autre dérivé du système réplicon ADN (vecteurs geminiviral) 4,11 virus du nanisme jaune de haricot (BeYDV), le virus de la mosaïque du tabac (TMV) 15-18, sont utilisés pour transporter le gène GFP et DsRed et de les livrer dans N. cellules benthamiana Via A. tumefaciens Trois constructions d'ADN. seront utilisés pour la GFP ou expression DsRed avec des vecteurs d'MagnICON. Ils comprennent en 5 'module (pICH15879) contenant le promoteur et d'autres éléments génétiques pour entraîner l'expression du gène cible, l'extrémité 3' module contenant le gène d'intérêt (PICH-GFP-PICH ou DsRed), et le module de l'intégrase (pICH14011) codant pour une enzyme qui intègre les extrémités 5 'et 3' modules ensemble lors de l'expression 8,15. Trois constructions d'ADN sont également nécessaires pour l'expression des vecteurs geminiviral. En plus de vecteurs contenant le réplicon du gène cible (pBYGFP ou pBYDsRed), un vecteur codant pour la protéine de réplication (pREP110) est requise pour l'amplification de la cible réplicon 11,14,16. En outre, l'inclusion d'un vecteur codant pour la p19 suppresseur de silence à partir de virus de rabougrissement de la tomate est souhaitée pour l'expression d'un gène cible de haut niveau 11,16.
Il ya généralement trois grandes étapes pour l'introduction de gènes de protéines recombinantes dans des cellules végétales par agroinfiltration y compris la croissance des plantes, A. préparation culture tumefaciens, et l'infiltration. Comme chaque étape est cruciale pour le succès final de cette procédure, par conséquent, une description détaillée de chaque est fournià la fois pour l'infiltration de la seringue et l'infiltration sous vide en dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
La demande croissante de produits pharmaceutiques à base de protéines dans le monde entier exigent de nouvelles plates-formes de production qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Les plantes ont montré pour être l'un des systèmes de production alternatifs les plus prometteurs pour la production de protéines pharmaceutiques. Au cours des dernières années, le développement de déconstruits vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire de protéines dans les…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions R. Sun et d'autres étudiants du Laboratoire de Chen pour leur contribution à planter génération de matériel. Nous remercions également le Dr D. Green pour son soutien à la recherche de premier cycle au Collège de technologie et l'innovation (CTI). Cette recherche a été financée en partie par des subventions du NIH U01 AI075549 et 1R21AI101329 à Q. Chen, et une subvention SSE de CTI de l'Arizona State University à Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, et J. Stahnke sont des étudiants pris en charge par la subvention SSE.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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