Summary
Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene
Abstract
Cultivo de células de mamíferos es la plataforma importante para la producción comercial de vacunas humanas y proteínas terapéuticas. Sin embargo, no puede satisfacer la creciente demanda mundial de productos farmacéuticos, debido a su limitada capacidad de ampliación y alto costo. Las plantas han demostrado ser una de las plataformas de producción farmacéuticas alternativas más prometedoras que son robustas, escalable, de bajo coste y seguro. El reciente desarrollo de vectores basados en virus ha permitido la expresión transitoria rápida y de alto nivel de proteínas recombinantes en plantas. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, se demuestra una metodología simple, eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en tejido de la planta en este estudio. Nuestros resultados indican que tanto agroinfiltración con jeringa de vacío y métodos han dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas y de producción robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed. Por otra parte,demostramos las ventajas únicas que ofrece por ambos métodos. Infiltración de jeringa es simple y no necesita un equipo costoso. También permite la flexibilidad para infiltrarse ya sea toda la licencia con un solo gen diana, o para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. Por lo tanto, se puede utilizar para la expresión a escala de laboratorio de proteínas recombinantes, así como para la comparación de diferentes proteínas o vectores de rendimiento o expresión cinética. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también sugiere su utilidad en la escuela secundaria y la educación universitaria para el tema de la biotecnología. Por el contrario, la infiltración de vacío es más robusto y puede ser mayor escala para la fabricación comercial de proteínas farmacéuticas. También ofrece la ventaja de ser capaz de agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa como la lechuga y Arabidopsis. En general, la combinación de jeringa y agroinfiltración de vacío proporciona a los investigadores y educadores un simple, eficiente y robustometodología para la expresión de proteína transitoria. Además, facilitará en gran medida el desarrollo de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.
Introduction
Desde la década de 1970, las plantas han sido explorados como alternativas a los cultivos de células de mamíferos, insectos, y bacteriana para la producción comercial de proteínas recombinantes y proteínas terapéuticas 1. Sistemas a base de plantas para la expresión de los productos biofarmacéuticos han demostrado ser prometedores en los últimos años varios nuevos tratamientos para enfermedades, como la enfermedad de Gaucher 2, y la gripe aviar H5N1 3, han demostrado tener éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo de mecanismos competentes para la expresión de proteínas recombinantes en plantas en las décadas desde los primeros experimentos se ha creado el potencial para los sistemas basados en plantas para alterar el paradigma actual de la producción de proteínas por tres razones principales. En primer lugar, hay una disminución notable en coste como biorreactores de mamíferos, insectos, y bacteriana requieren considerables costos de inicio, medios de cultivo costosos, complicados y procesos para la purificación aguas abajo 4. La creación de plantas transgénicas estableslíneas también les permite superan la escalabilidad de otros sistemas de expresión como las plantas que expresan proteínas podrían ser cultivados y cosechados a escala agrícola 5. En segundo lugar, los sistemas de expresión basados en plantas reducen significativamente el riesgo de transmitir un patógeno humano o animal desde el host expresan la proteína a los seres humanos, lo que demuestra la superioridad en la seguridad pública 6. Por último, las plantas utilizan un sistema de endomembranas eucariota que es similar a las células de mamíferos, lo que permite apropiada modificación post-traduccional de proteínas, incluyendo glicosilación y el ensamblaje de las proteínas de la subunidad múltiple 7. Esta capacidad pone los sistemas a base de plantas por delante de los basados en sistemas procariotas, tales como bacterias, ya que un número más amplio de proteínas farmacéuticas recombinantes, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb), tienen una estructura más complicada y requerir extensas modificaciones posteriores a la traducción o de montaje 8.
Hay dos grandes aprodolores de la expresión de proteínas recombinantes en plantas. El primero es el desarrollo de una línea transgénica de manera estable, donde el ADN que codifica para la proteína diana se clona en un casete de expresión y se introduce a cualquiera de los genomas nucleares o de cloroplastos. De este modo, el ADN extraño se convierte en heredables a través de las generaciones sucesivas y permite enormemente mejorado escalabilidad, mucho más allá de la de otros sistemas de expresión 1. La introducción de ADN exógeno al genoma nuclear se logra por lo general por la infección de Agrobacterium tumefaciens del tejido de la planta o, con menos frecuencia, por bombardeo con microproyectiles de los tejidos 9. Las hormonas vegetales se utilizan entonces para inducir la diferenciación y el crecimiento de tejido de la planta transgénica, tales como raíces y hojas. La transformación del genoma del cloroplasto no se puede lograr con A. tumefaciens, pero depende enteramente de oro o tungsteno recubiertas con ADN dispararon balísticamente en las células vegetales. El segundo método de expresión de recombinaciónproteína nt de plantas es a través de la expresión transitoria 10. En este escenario, los vectores derivados de virus que albergan el gen de interés se entregan a través de A. tumefaciens a plantas completamente desarrolladas a través de un proceso llamado agroinfiltration. En lugar de integrarse en el genoma de la planta, la construcción del gen entregado entonces comenzará a dirigir la producción transitoria de la proteína deseada, que se puede recoger y aislado después de un corto período de incubación. Expresión transitoria de genes ofrece la ventaja de una mayor acumulación de proteínas en general, así como una mejora del tiempo de producción de proteínas, como las plantas estarán listas para la cosecha de aproximadamente 1-2 semanas después de la agroinfiltración 11. Esto es significativamente más rápido que los procesos de generación, selección, y la confirmación de líneas estables de plantas transgénicas, que pueden tardar varios meses a un año. Sin embargo, esta es también la limitación del sistema de expresión transitoria, ya que no dará lugar a la planta genéticamente estable lines que se pueden utilizar para generar un banco de semillas para la producción comercial a gran escala. A pesar de esto, se han desarrollado enfoques para mejorar la expresión transitoria a gran escala. Aquí se demuestra un método de generación de proteínas que expresan plantas de Nicotiana benthamiana transitorios usando vectores virales deconstruidos entregados por A. tumefaciens.
Dos métodos principales se están desarrollando para la entrega de A. tumefaciens en el tejido vegetal: Banco infiltración escala mediante una jeringa y la infiltración a gran escala a través de la cámara de vacío. Ambos protocolos se describen aquí usando N. benthamiana, que está estrechamente relacionado con la planta de tabaco común, ya que la planta huésped para la expresión transitoria de dos proteínas fluorescentes: la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria y la proteína fluorescente roja de Discosoma de coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana es la planta huésped más común paraproteína recombinante, ya que es susceptible de transformación genética, puede producir grandes cantidades de biomasa con rapidez, y es un prolífico productor de semillas para la producción de ampliación 14. Otra ventaja de la utilización de N. benthamiana como huéspedes para la expresión de la proteína es la disponibilidad de una variedad de vectores de expresión de 2,5. En este estudio, dos vectores virales deconstruido, uno basado en un virus del mosaico del tabaco (TMV) ARN replicón sistema (vectores magnICON) y la otra derivada del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) sistema de replicón de ADN (vectores geminiviral) 4,11, 15-18, se utilizan para llevar el gen GFP y DsRed y entregarlos en N. células benthamiana mediante A. tumefaciens. Tres construcciones de ADN serán utilizados para GFP o expresión DsRed con vectores magnICON. Ellos incluyen 'módulo (pICH15879) que contiene el promotor y otros elementos genéticos para la conducción de la expresión del gen diana, el 3' del módulo 5 que contiene el gen de interés (PICH-GFP o Pich-DsRed), y el módulo de la integrasa (pICH14011) que codifica para una enzima que integra el 5 'y 3' módulos juntos tras la expresión 8,15. También se necesitan tres construcciones de ADN para la expresión con vectores geminiviral. Además de los vectores que contienen el replicón del gen diana (pBYGFP o pBYDsRed), se requiere un vector que codifica para la proteína de replicación (pREP110) para la amplificación de la diana replicón 11,14,16. Por otra parte, se desea la inclusión de un vector que codifica la p19 supresor de silenciamiento del virus del enanismo ramificado del tomate para la expresión del gen diana de alto nivel de 11,16.
En general, existen tres pasos principales para la introducción de genes de proteínas recombinantes en células de plantas por agroinfiltration incluyendo el crecimiento de la planta, A. preparación de cultivo tumefaciens, y la infiltración. Se ofrece como cada paso es fundamental para el éxito final de este procedimiento, por lo tanto, una descripción detallada de cadatanto para la infiltración de jeringa y la infiltración al vacío a continuación.
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Protocol
1. Crecimiento de las Plantas
- Lugar 60 pastillas de turba en una bandeja de propagación. Añadir 4 L de agua del grifo y dejar que la turba pellets de absorber el agua durante 2 horas.
- Añadir 2 N. benthamiana semillas en cada una turba de pellets con una sembradora, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico transparente, y les permiten germinar en un C Humedad ambiente 25 °, el 84% con un ciclo día / noche de 16/8 horas (Figura 1).
- Retire el domo dos semanas después de la siembra, drenar el agua de la bandeja, y añadir 2 litros de fertilizante de Jack a una concentración de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar para cultivar plantas en un entorno C Humedad 25 °, el 50% con una hr día / noche ciclo de 16/8. Suministro 2 L de fertilizante de Jack cada 2 días a la bandeja.
- En la semana 4, transferir las plantas con pellets de turba a una nueva bandeja que aloja seis plantas para proporcionar un espacio adecuado para un mayor crecimiento (Figura 1C) hasta que estén listos para ser infiltrado a las 6 semanas de edad (figura1D).
2. A. tumefaciens Cultura Preparación
2.1 Preparación para la infiltración Jeringa
- Racha A. tumefaciens GV3101 cepas que contienen los vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP, y pBYDsRed en placas de agar LB que contenían kanamicina (100 mg / ml). Racha de una cepa por placa y crecer a 30 º C durante 48 horas.
- Del mismo modo, la raya y GV3101 crecer las cepas que albergan los vectores magnICON de la 5 'módulo (pICH15879), el 3' del módulo que contiene el gen diana de GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed), y la integrasa (pCH14011) en agar LB placas que contenían carbenicilina (100 mg / ml).
- A partir de una sola colonia en la placa de agar LB, inocular GV3101 las cepas que albergan vectores geminiviral en 3 ml de YENB los medios de comunicación (0,75% de extracto de levadura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar el pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 mg / ml) en un tubo de cultivo ml de fondo redondo de 15, crece el cultivo líquido a 30 ° C enun agitador durante la noche con una tasa de rotación de 300 rpm.
- Del mismo modo, inocular GV3101 y crecer las cepas que albergan vectores magnICON en YENB medios + carbenicilina (100 mg / ml) durante la noche en un agitador a 30 ° C.
- Los valores de medida y registro de DO 600 para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida 600 de 0.025 en 10 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados .
Sub V (ml) = (10 ml) x (0.025) / OD 600 - Transferencia sub V (ml) del cultivo de una noche a (10 - V sub) ml de los medios de comunicación YENB con los antibióticos apropiados para cada cepa. Crecer el nuevo cultivo durante la noche a 30 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm hasta que el valor de la DO 600 está en el intervalo de 1,7-2,0.
- Mida y registre OD 600 valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V inf) para ser diluido en 50 ml de tampón de infiltración para dar una DO600 final de 0,12 para cada cepa.
Inf V (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Transferencia inf V (ml) de cada cultivo a un tubo de microcentrífuga y girar hacia abajo las células por centrifugación a 12.000 xg durante 2 min, a continuación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de tampón de infiltración (MES 10 mM, pH 5,5; 10 mM MgSO 4) por agitación con vórtex brevemente.
- Mezclar resuspendieron las células de pBYGFP pREP110 + + p19, girar las células hacia abajo a 12.000 xg durante 2 min, y volver a suspender en total de 50 ml de tampón de infiltración. Esta combinación es agrobacterias para la expresión de GFP geminiviral.
- Del mismo modo, mezclar las siguientes combinaciones de células de Agrobacteria, girar hacia abajo y volver a suspender en 50 ml de tampón de infiltración. Estos incluyen (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para la expresión geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 para geminiviral co-expresión de GFP y DsRed, (3) pREp110 + p19 como control negativo de la expresión geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 magnICON para la expresión de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para la expresión magnICON de DsRed, y (6) pICH15879 + pCH14011 como control negativo para la expresión magnICON.
2.2 Preparación para la infiltración al vacío
- Inocular y la cultura cada cepa GV3101 que contiene vectores geminiviral o vectores magnICON en 15 ml de medio de YENB con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 ml y esterilizado en autoclave crecer durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa.
- Los valores de medida y registro de DO 600 para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida 600 de 0.025 en 250 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados .
V sub 600 - Transferencia sub V (ml) del cultivo de una noche a (250 - V sub) ml de los medios de comunicación YENB en un matraz de 1 L autoclavado con los antibióticos apropiados para cada cepa y crecer el nuevo cultivo durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa.
- Medir y registrar OD 600 valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V inf) para ser diluido en 3 L de tampón de infiltración para dar una DO600 final de 0,12 para cada cepa.
Inf V (ml) = (3.000 ml) x (0.12) / OD 600 - Precipitado y se resuspende V inf (ml) de cada cultivo en tampón de infiltración como se describe para la infiltración jeringa y mezclar las culturas resuspendidas de acuerdo con las combinaciones descritas para la infiltración jeringa. Repellet las células Agrobacteria mixtos y resuspender en 3 L de tampón de infiltración.
3.1 Jeringa infiltración
- Elija cuatro de 6 semanas de edad N. benthamiana plantas con 5 hojas cada uno. Las tres primeras hojas, contando desde la parte superior de cada planta se infiltraron en su totalidad con una de las combinaciones de A. tumefaciens cepas en tampón de infiltración. La cuarta hoja será spot-infiltrada con todas las combinaciones de cuatro cepas de expresión geminiviral o las tres combinaciones de expresión magnICON. La última hoja de cada planta se infiltró con combinaciones de controles negativos.
- Crear un pequeño corte con una aguja en la epidermis en el lado posterior de la hoja (Figura 2A). Atención: asegurarse de no rayar tan duro como para perforar la hoja a través de ambos lados, como las células de Agrobacteria en la mezcla de infiltración pasarán a través de la punción para el otro lado de la hoja.
- Tome un firme control de la parte frontal de la hoja y mientras se aplica suavela presión en contra de la nick con el pulgar de una mano, se inyectan las mezclas de Agrobacterium en tampón de infiltración en el nick con una jeringa sin aguja (Figura 2B). Nota: Como la mezcla de Agrobacterium que entra en el espacio intercelular de la hoja, el área infiltrada se volverá verde visiblemente más oscuro (Figura 2C).
- Continuar para inyectar las mezclas de Agrobacterium en el nick hasta que el círculo verde más oscuro deja de expandirse. Cree otro nick y repita los pasos 3.1.2-3.1.4 hasta que toda la hoja se infiltra y toda la hoja se vuelve verde más oscuro para las tres primeras hojas y la última hoja.
- Para la cuarta hoja de cada planta, todas las combinaciones de cuatro (vector geminiviral) o tres (magnICON vector) se infiltraron en ella. Haga un nick para cada combinación de cepas de Agrobacterium, y se infiltran cada nick con una combinación.
- Después de la infiltración, mover las plantas de nuevo a la sala de crecimiento y moniexpresión de la proteína mediador entre 2-15 días después de la infiltración (dpi).
3.2 Vacío infiltración
- Coloque una bañera en un desecador de vacío y la transferencia de 3 l de tampón de infiltración que contiene las cepas de Agrobacterium a la bañera. Conectar el desecador a una bomba de vacío de diafragma de Vacuubrand (Figura 3A).
- Coloque una planta boca abajo sobre la placa de desecador (Figura 3B) y bajar la placa con la planta hasta que todo el sistema de la hoja y tallo se sumergen en la memoria intermedia de la infiltración con la placa que descansa encima de la bañera. Coloque la junta tórica desecador a lo largo del borde y poner la tapa desecador de la cámara (Figura 3C).
- Encienda la bomba de vacío y empezar a cronometrar cuando el vacío llega a 100 mbar. Abrir lentamente la válvula de descarga en el desecador después de 1 min a 100 mbar para permitir la entrada de Agrobacteria en los espacios intersticiales del tejido de la planta sumergida. Repita este paso uno addititiempo onal para asegurar una buena infiltración.
- Después de la infiltración, tomar la planta del desecador y se puso de nuevo a su posición vertical. Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento y expresión de proteínas de monitoreo entre 2-15 dpi.
4. Detección de la proteína fluorescente y fotografía
- A partir de 2 dpi, las plantas se mueven en el cuarto oscuro y brillar la luz UV en el envés de las hojas infiltradas con una lámpara UV de mano.
- Observar la fluorescencia verde de GFP o la fluorescencia roja DsRed. GFP emite una señal más fuerte con la luz ultravioleta de onda larga, mientras DsRed es más fuerte a la luz ultravioleta de onda corta.
- Tome fotografías de hojas fluorescentes con una cámara digital normal sin flash.
- Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento después de la observación o la fotografía.
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Representative Results
1. Expresión de proteínas fluorescentes por infiltración Jeringa
Para demostrar la eficacia de la jeringa de la infiltración de Agrobacterium en el tejido de la planta, se probó la expresión de dos proteínas fluorescentes - GFP y DsRed - por dos vectores diferentes deconstruido de plantas virales - geminiviral y magnICON - en N. benthamiana. Por N. benthamiana hojas que fueron totalmente infiltrados con vectores que contienen geminiviral Agrobacteria, se observó expresión de GFP en toda el área foliar bajo luz UV a partir de ya en 2 dpi y llegaron a la acumulación de pico a 4 dpi (Figura 4C). Esta expresión GFP temprano por vector geminiviral es consistente con los resultados previos de otras proteínas recombinantes 14,16,18,19. Por el contrario, las hojas infiltradas con magnICON vector que contiene combinaciones de Agrobacterium mostró fluorescencia de GFP sólo después dpi 5 y alcanzó su máximo accumulatia las 7 dpi (Figura 4D). No se observó fluorescencia verde de las hojas infiltradas con control negativo Agrobacterium mezclas de pREP110 + p19 (Figura 4B) o pICH15879 pCH14011 + (datos no presentados), lo que indica que la fluorescencia era específica para el gen de GFP y no era el resultado de fluorescencia de fondo desde las hojas. En su acumulación de pico, la fluorescencia de magnICON vector expresado de GFP es más intensa que la del vector de geminiviral (Figura 4C y 4D), de forma similar a los resultados obtenidos previamente para otras proteínas recombinantes 8,18. El patrón de expresión temporal y la intensidad de fluorescencia relativa de DsRed son similares a la de GFP (datos no mostrados). No se observó una importante necrosis en las hojas infiltradas con las construcciones de GFP (Figura 4A). También se observaron resultados similares para DsRed-expresión de las plantas, lo que indica que ni la proteína fluorescente es altamente tóxico para las plantas cells. Sin embargo, se observó necrosis local en el sitio de nick y apareció como "agujeros" en las fotografías (Figura 4). Cuando se expresan ambas proteínas fluorescentes en la misma hoja a través de vectores geminiviral con jeringa punto-infiltración, que se detectaron con su color fluorescente esperado en el punto donde se infiltraron (Figura 5). Curiosamente, la co-infiltración de GFP y DsRed resultaron en fluorescencia amarillenta (Figura 5). La intensidad de fluorescencia de DsRed parecía ser más débil que la de GFP en la misma hoja. Sin embargo, no siempre son representativas de la expresión más débil de DsRed, sino más bien debido a la excitación menos que óptimo de DsRed por la luz UV. En general, nuestros resultados demuestran que la infiltración jeringa introduce de manera eficiente gen recombinante portadora de agrobacterias en hojas de las plantas y como resultado la expresión robusta de nuestras proteínas diana. Además, hemos demostrado que este método permite la flexibilidaddad ya sea infiltrado hojas enteras de acumulación máxima de una proteína diana o de detectar-se infiltran objetivos múltiples proteínas con múltiples vectores para la comparación de su expresión y patrón de expresión.
2. Expresión de proteínas fluorescentes por infiltración al vacío
Infiltración al vacío se examinó también para desarrollar un método agroinfiltration escalable que puede ser utilizado para la producción a gran escala de proteínas recombinantes mediante sistemas de expresión transitoria de las plantas. Nuestros resultados indican que el patrón de expresión temporal de GFP o DsRed por vectores geminiviral y magnICON no fue alterada por el cambio del método de infiltración y se mantuvo similar a la de la infiltración de jeringa. Como todo el rodaje de una planta se sumerge en la mezcla de infiltración al vacío durante la infiltración, se observó fluorescencia de la GFP (Figura 6) para todas las hojas de las plantas infiltradas. En comparación con la infiltración de jeringa, es más robusto y puede acinfiltración hieve de cada planta con un marco de tiempo mucho más corto. Por ejemplo, se tarda un estudiante experto 15 min a la jeringa-infiltrarse en uno toda 6 semanas de edad N. planta benthamiana. Por el contrario, la misma planta puede ser infiltrado en 3 min por vacío de principio a fin y múltiples plantas pueden ser infiltrado al mismo tiempo.
Figura 1. N. crecimiento de las plantas benthamiana con pastillas de turba y bandejas de crecimiento. plantas de tipo salvaje a 0 (A), 2 (B), 4 (C) y 6 (D) semanas después de la siembra.
Figura 2. Jeringa infiltración de N. deja benthamianacon Agrobacterium tumefaciens. cepa GV3101 de A. tumefaciens que albergaba magnICON vectores que expresan GFP-se resuspendieron en tampón de infiltración y se cargan en una jeringa sin aguja. Un nick fue creado con una aguja en la parte trasera de una vieja hoja de 6 semanas (A). La apertura de la jeringa se coloca en contra de la mella (B) y agrobacterias en tampón de infiltración se inyectaron en el espacio intercelular de la hoja a través de la mella (C).
Figura 3. Vacío infiltración de N. benthamiana deja con Agrobacterium tumefaciens. cepa GV3101 de A. tumefaciens que contienen vectores que expresan proteínas diana se resuspendieron en infiltration tampón y se carga en un 3 L bañera. La bañera se colocó después en un desecador de vacío que estaba conectado a una bomba de vacío (A). Una planta de 6 semanas de edad se colocó boca abajo sobre la placa de desecador (B). La hoja entera y el sistema de tallo se sumergieron en la bañera como la placa se coloca encima de la cámara (C). Agroinfiltration se logró mediante la aplicación y la liberación de un vacío de 100 mbar dos veces durante 1 min. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
La Figura 4. La expresión de GFP en jeringa agroinfiltradas hojas. Todo el N. hojas benthamiana fueron infiltradas con la cepa GV3101 de A. tumefaciens que albergaba el gen de GFP en un geminiviral (A y C) o magnICON vecto (D). Hojas de control negativo fueron infiltradas con las cepas de Agrobacteria que no contienen ese gen GFP (B). Las hojas se fotografiaron bajo luz blanca (A) o la luz UV (BD) a 4 dpi (AC) o 7 dpi (D).
Figura 5. La expresión de GFP y DsRed en jeringa hojas spot-agroinfiltrated. N. benthamiana hojas estaban en el lugar se infiltraron con GV3101 que alberga la GFP, DsRed, o ambos GFP y DsRed genes en vectores geminiviral. Un punto de control negativo se infiltra con pREP110 + p19. Las hojas fueron fotografiados bajo luz UV a 4 dpi.
La Figura 6. La expresión de GFP en el vacío agroinfilhojas castrados. N. hojas benthamiana fueron infiltradas con GV3101 que alberga el gen GFP en vectores magnICON. Las hojas fueron fotografiados bajo luz UV a los 7 dpi.
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Discussion
La creciente demanda de productos farmacéuticos basados en proteínas en todo el mundo requieren de nuevas plataformas de producción que son robustas, escalables y de bajo costo y seguro. Las plantas han demostrado ser uno de los sistemas de producción alternativas más prometedoras para la producción de la proteína farmacéutica. En los últimos años, el desarrollo de vectores basados en virus deconstruido ha permitido la expresión transitoria de proteínas en plantas, lo que mejora en gran medida la velocidad y el rendimiento de los sistemas de expresión de plantas 2,10. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, que demuestran un enfoque simple pero eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en el tejido de la planta. Nuestros resultados indican que agroinfiltration, ya sea con la jeringa de vacío o método ha dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas de las plantas de producción y robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed.
Para garantizar la efficient agroinfiltration y la producción de proteínas, los siguientes parámetros críticos deben ser controlados cuidadosamente. Las desviaciones de estos parámetros pueden resultar en una baja eficiencia agroinfiltration ya su vez, la expresión de proteínas de bajo de destino.
1. Planta etapa del desarrollo y la salud. La variable más probable en este método entre laboratorios es el material vegetal para la infiltración. Mientras que las plantas pueden aparecer fenotípicamente similares, su etapa de desarrollo y el estado fisiológico afectan a su competencia en la expresión de proteínas recombinantes de manera significativa. Los parámetros específicos que tienen efectos sobre el crecimiento de las plantas y los niveles de expresión de proteínas incluyen la temperatura, la humedad, la intensidad de la luz, el suministro de fertilizantes, la edad de la inoculación de la planta, y el tiempo requerido para la acumulación máxima de proteína diana después de la infiltración hoja. Las plantas deben recibir constantemente la misma cantidad de agua y fertilizantes a diario. Pequeños cambios en las condiciones de crecimiento de las plantas pueden cambiar drásticamente el siz definitivae de las plantas y su capacidad para expresar proteínas recombinantes. Nuestros estudios previos indican que las plantas cultivadas bajo luz natural produjeron más biomasa de hojas, mientras que la producción de proteínas es mucho menor que el cultivo bajo luz artificial 4. Por lo tanto, el uso de la luz artificial es el método de elección para el crecimiento de las plantas. Nuestros resultados también muestran que una hora 16 horas de oscuridad la luz / 8 a 25 ± 0,5 ° C es la condición óptima para crecer N. benthamiana plantas bajo tal tipo de iluminación artificial 4. Hemos demostrado que en estas condiciones, las plantas de 6 semanas son la edad óptima para la expresión de GFP y DsRed, ya que producen altos niveles de proteínas fluorescentes, mientras que el rendimiento de biomasa es adecuada. Las plantas mayores de 6-semanas producen más biomasa, pero son demasiado alto para caber en la cámara de infiltración 4. Además, las flores comienzan a desarrollarse después de 6 semanas de crecimiento, afectando negativamente la expresión de proteína recombinante 4. En consecuencia, las plantas de 6-semanas contienen la L óptimamaterial de EAF que equilibra la necesidad combinada de rendimiento de la biomasa, la acumulación de la proteína, y la facilidad de agroinfiltración.
2. Crecimiento y concentración de la infiltración de Agrobacterium. Otro punto clave en esta metodología es el control del crecimiento y la concentración de la infiltración de A. tumefaciens, según lo medido por el OD 600. En cada paso de la cultura y la subcultura, las cepas de A. tumefaciens que deben ser cultivados a, pero no sobre la OD designado 600. Hemos examinado varias concentraciones de A. tumefaciens para la infiltración final del N. benthamiana hojas 4. Una baja concentración de Agrobacterium dará lugar a la liberación insuficiente de los genes diana en las plantas, lo que lleva a la expresión baja en proteínas. Por otro lado, si la concentración de la infiltración de Agrobacterium es demasiado alto, que dará lugar a una respuesta de hipersensibilidad en el tejido infiltrado y conducir a la necrosis 20. Nuestro resultados demostraron que la OD 600 = 0,12 cepa de Agrobacterium equilibra la necesidad de entrega máximo de construcción de gen sin causar necrosis de los tejidos y la muerte celular. La densidad de OD 600 de Agrobacterium deseado puede obtenerse mediante el uso de medios de cultivo consistentes, temperatura y tiempo de cultivo.
3. Para la infiltración al vacío, es importante seguir la presión de vacío designado y la duración de infiltración. Nuestros resultados indican que una bañera de 3 L de mezcla de infiltración de Agrobacterium se puede utilizar para infiltrarse en aproximadamente 30 plantas. Si más de 30 plantas necesitan ser infiltrado, un nuevo lote de mezcla de infiltración de Agrobacterium necesita ser suministrado.
4. Los parámetros específicos que se presentan en este documento han sido optimizados para la expresión de proteínas utilizando N. benthamiana plantas que crecen bajo condiciones específicas descritas anteriormente con vectores basados en virus deconstruido. Como se discutió anteriormente, tque más difícil parámetro para controlar en esta metodología es el material de la planta. Hemos expresado una variedad de vacunas y proteínas terapéuticas que utilizan las plantas y el procedimiento de infiltración que describimos aquí y obtuvimos excelentes resultados en todos los casos 4,8,14,18,21-23. Estos resultados demostraron que las condiciones que hemos desarrollado son óptimos para la expresión de la proteína. Sin embargo, si las diferentes especies de plantas huésped, vectores de expresión, o diferente N. Se utilizaron benthamiana condiciones de cultivo para la infiltración, tendría que volver a optimizar los experimentos cada parámetro en esta metodología.
En general, hemos demostrado que la agroinfiltración con la jeringuilla y de vacío es una metodología simple pero eficiente para introducir gen diana que lleva por Agrobacterium en plantas para la expresión transitoria de las proteínas recombinantes. Ambos métodos tienen sus ventajas únicas en función del objetivo de la investigación y la producción. Infiltración de jeringa es simple, requiriendoes sólo pequeños volúmenes de cultivo de Agrobacterium y no necesita costosas bombas y cámaras de vacío. Como se demuestra en este informe, que tiene la flexibilidad para ya sea infiltrarse en toda la hoja con un gen diana o utilizar la infiltración lugar para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. El método de infiltración hoja entera puede ser utilizado para la expresión de pequeña escala de laboratorio de proteína recombinante para su caracterización bioquímica, purificación, y los estudios funcionales preclínicos 1. Por el contrario, la infiltración lugar se puede utilizar para expresar múltiples objetivos de la proteína en una hoja para comparar su rendimiento, la cinética de expresión y la toxicidad para las plantas. También se puede utilizar para comparar la expresión de una proteína indicadora tal como GFP o DsRed impulsado por diferentes vectores de expresión en la misma hoja. Como resultado, la capacidad diferente de vector en la conducción de acumulación de la proteína y su cinética de expresión puede ser caracterizado. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también permite que unherramienta viable para enseñar y entrenar a estudiantes de secundaria y universitarios en el tema de la biotecnología y la ingeniería genética.
En comparación con la infiltración de jeringa, infiltración al vacío requiere la inversión de las bombas de vacío y las cámaras y los volúmenes más grandes de cultivos de Agrobacterium. Por lo tanto, no es el método de elección cuando sólo unas pocas plantas necesitan ser infiltrado. Sin embargo, proporciona la escalabilidad que no puede ser igualada por la infiltración de jeringa. Es más robusto y puede infiltrarse en un gran número de plantas en un corto período de tiempo. Con la escala presentada en este informe, que son capaces de producir niveles gramo de proteínas farmacéuticas purificada suficiente para un estudio de fase I de ensayos clínicos humanos 4. Además, este proceso puede ser más mayor escala para la fabricación comercial de las proteínas farmacéuticas a partir de plantas. Por ejemplo, los procesos están diseñados para aspirar infiltrado tres toneladas métricas de N. benthamiana plantas por horaen una operación de ampliación 24. Otra ventaja de infiltración al vacío es que se puede utilizar para agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa.
En resumen, la combinación de la jeringa y la infiltración al vacío proporciona los investigadores, los biotecnólogos y educadores una metodología simple, eficiente, robusto y escalable para la expresión transitoria de proteínas recombinantes en plantas. Además, facilitará en gran medida el desarrollo y la producción de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a R. Sun y otros estudiantes de laboratorio de Chen por su contribución a la generación de plantar material. También agradecemos al Dr. D. Green por su apoyo a la investigación universitaria en la Facultad de Tecnología e Innovación (CTI). Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones del NIH U01 AI075549 y 1R21AI101329 al P. Chen, y una donación de SSE de CTI, de la Universidad del Estado de Arizona a Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado y J. Stahnke son estudiantes universitarios apoyados por la concesión SSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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