Summary
צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן המכיל
Abstract
תרבית תאי יונקים היא הפלטפורמה הגדולה לייצור מסחרי של חיסונים לבני אדם וחלבונים טיפוליים. עם זאת, הוא לא יכול לענות על ביקוש העולמי הגובר לתרופות בשל יכולת הרחבה המוגבלת שלה ועלותו הגבוהה. צמחים הראו להיות אחת פלטפורמות ייצור התרופות החלופיות המבטיחות ביותר כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. ההתפתחות האחרונה של וקטורים מבוססי וירוס אפשרה ביטוי חולף ומהיר ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטיים בצמחים. כדי לייעל עוד יותר את השירות של מערכת הביטוי החולף, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, יעילה וניתן להרחבה להציג Agrobacterium המכיל יעד גן לתוך רקמות צמח במחקר זה. התוצאות שלנו מעידות agroinfiltration שעם שניהם ומזרק ואקום שיטות הביאו במבוא יעיל של Agrobacterium לעלים וייצור חזק של שני חלבוני ניאון; GFP וDsRed. יתר על כן,אנחנו מדגימים את היתרונות הייחודיים המוצעים על ידי שתי השיטות. חדירת המזרק היא פשוטה ואינה זקוק לציוד יקר. זה גם מאפשר את הגמישות או לחדור לכל החופשה עם גן המטרה אחת, או להציג את הגנים של מטרות מרובות בדף אחד. לפיכך, ניתן להשתמש בו לביטוי בקנה מידה מעבדה של חלבונים רקומביננטיים, כמו גם להשוואה בין חלבונים או וקטורים שונים לקינטיקה תשואה או הביטוי. הפשטות של חדירת המזרק גם מציעה השירות שלה בבית הספר תיכון ומכללה לחינוך לנושא של ביוטכנולוגיה. לעומת זאת, חדירת האבק היא חזקה יותר, וניתן לשנות כלפי מעלה לייצור מסחרי של חלבוני תרופות. הוא מציע גם את היתרון של להיות מסוגל agroinfiltrate מיני צמחים שאינם ניתן לחדירת המזרק כגון חסה וארבידופסיס. בסך הכל, שילוב של מזרק וagroinfiltration הוואקום מספק לחוקרים ומחנכים פשוטים, יעיל וחזקהמתודולוגיה לביטוי חולף חלבון. זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של חלבוני תרופות ולקדם את החינוך מדעי.
Introduction
מאז 1970, צמחים נחקרו כחלופות לתרביות של תאי יונקים, חרקים, חיידקים ולייצור המסחרי של חלבונים רקומביננטיים ותרופות 1 חלבון. מערכות המבוססות על הצמח לביטוי של תרופות ביולוגיות הראו הבטחה בשנים האחרונות כמספר טיפולים החדשניים למחלות, כמו מחלת גושה 2, ושפעת עופות H5N1 3, הראו הצלחה בניסויים קליניים. פיתוח מנגנונים מוסמכים לביטוי חלבון רקומביננטי בצמחים בעשורים שחלף מאז ניסויים הראשוניים יצר את הפוטנציאל למערכות המבוססות על הצמח לשנות את הפרדיגמה הנוכחית של ייצור חלבון משלוש סיבות עיקריות. ראשית, יש ירידה בולטת בעלות כbioreactors יונקים, חרקים, חיידקים ודורשים עלויות משמעותיות בהפעלה, תקשורת צמיחה היקרות, מסובכים ותהליכים לטיהור מורד הזרם 4. יצירת הצמח מהונדס יציבקווים גם מאפשר להם לעבור את יכולת ההרחבה של מערכות ביטוי אחרות ניתן לגדל צמחים לבטא חלבון ונקטפו בקנה מידה חקלאית 5. שנית, מערכות ביטוי על בסיס צמחי להפחית באופן משמעותי את הסיכון להעברת הפתוגן אדם או בעל חיים מהמארח החלבון להביע לבני אדם, הוכיחו עליונות בביטחון ציבור 6. לבסוף, צמחים לנצל את מערכת endomembrane אוקריוטים כי הוא דומה לתאי יונקים, דבר המאפשרים לשינוי לאחר translational הנכון של חלבונים, כולל glycosylation וההרכבה של חלבונים מרובים מקטע 7. יכולת זו מעמידה את מערכות על בסיס צמחי לפני אלה המבוססים על מערכות פרוקריוטים, כגון חיידקים, שכן מספר רחב יותר של חלבונים רקומביננטיים תרופות, כולל נוגדנים חד שבטיים (מבז), יש מבנה מסובך יותר ודורש שינויים נרחבים posttranslational או הרכבה 8.
ישנם שתי appro הגדולהכאבים כדי לבטא חלבונים רקומביננטיים בצמחים. הראשון הוא הפיתוח של קו מהונדס ביציבות, כאשר ה-DNA המקודד חלבון המטרה הוא משובט לתוך קלטת ביטוי והציג גם את הגנום הגרעיני או הכלורופלסט. בתוך כך, דנ"א הזר הופך להיות תורשתי באמצעות דורות הבאים ומאפשר ליכולת הרחבה השתפרה מאוד, הרבה מעבר לזה של מערכות ביטוי אחרות 1. מבוא של ה-DNA אקסוגני לגנום הגרעיני מושגת בדרך כלל על ידי זיהום Agrobacterium tumefaciens של רקמת צמח או, לעתים קרובות יותר, בהפצצות microprojectile של הרקמה 9. הורמונים צמחיים משמשים לאחר מכן כדי לגרום להתמיינות וגדילה של רקמות צמח מהונדס כמו שורשים ועלים. הפיכתו של הגנום הכלורופלסט לא ניתן להשיג עם א ' tumefaciens, אלא מסתמך אך ורק על חלקיקי זהב או טונגסטן מצופה דנ"א ירה בליסטי לתוך תאי צמח. השיטה השנייה של הבעת recombinaחלבון NT בצמחים הוא דרך ביטוי חולף 10. בתרחיש זה, וקטורי הנגזרות וירוס מחסה הגן של עניין מועברים דרך א tumefaciens לצמחים המפותחים באמצעות תהליך הנקרא agroinfiltration. במקום להשתלב בגנום הצמח, מבנה הגן נמסר אז יהיה להתחיל לכוון את הייצור החולף של החלבון הרצוי, שיכול להיות שנקטפו ומבודד לאחר תקופת דגירה קצרה. ביטוי חולף גן מציע את היתרון של הצטברות גדולה יותר הכוללת חלבון, כמו גם זמן משופר של ייצור חלבון, כמו צמחים יהיו מוכנים לקצור כ 1-2 שבועות לאחר agroinfiltration 11. זו מהירה יותר באופן משמעותי מתהליכי ייצור, בחירה ואישור של קווי צמחים מהונדסים יציבים, אשר יכול לקחת מספר חודשים עד שנה. זה לעומת זאת, הוא גם המגבלה של מערכת הביטוי החולף, כפי שהוא לא יניב יציב גנטי צמח Liנס שיכול לשמש ליצירת בנק זרע לייצור מסחרי בקנה מידה גדול. למרות זאת, גישות פותחו כדי לשפר את הביטוי חולף בקנה מידה גדול. כאן אנו מדגימים שיטה אחת של דור של צמחים חולפים חלבון המבטא-ניקוטיאנה benthamiana באמצעות וקטורים ויראליים מפורקים נמסרו על ידי א tumefaciens.
שתי שיטות עיקריות מפותחות עבור המשלוח של א ' tumefaciens לתוך רקמות צמח: היקף חדירת ספסל באמצעות מזרק והסתננות בקנה מידה גדולה באמצעות תא ואקום. שני הפרוטוקולים מתוארים כאן באמצעות נ benthamiana, אשר קשור באופן הדוק לצמח הטבק המשותף, כצמח הפונדקאי לביטוי זמני של שני חלבוני ניאון: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea ויקטוריה וחלבון פלואורסצנטי האדום מDiscosoma אלמוגים (DsRed) 12,13. נ benthamiana הוא הצמח הפונדקאי הנפוץ ביותר עבורחלבון רקומביננטי כי זה ניתן לשינוי גנטי, יכול להניב כמויות גבוהות של ביומסה במהירות, והוא מפיק זרעים פורה לייצור בהיקף של עד 14. יתרון נוסף של שימוש בנ benthamiana כמארחים לביטוי חלבון הוא הזמינות של מגוון רחב של וקטורי ביטוי 2,5. במחקר זה, שני וקטורים ויראליים מפורקים, אחד המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) רנ"א replicon מערכת (וקטורי MagnICON) והאחר שהופק ממערכת replicon DNA (וקטורי geminiviral) 4,11 וירוס הגמד הצהוב השעועית (BeYDV), 15-18, משמשים לביצוע ה-GFP וגן DsRed ולספק אותם לנ תאי benthamiana Via A. tumefaciens. שלוש בונה DNA תשמש לGFP או ביטוי DsRed עם וקטורי MagnICON. הם כוללים 'מודול (pICH15879) המכיל את האמרגן ואלמנטים גנטיים אחרים לנהיגת הביטוי של גן המטרה, 3' 5 מודול המכיל את הגן של עניין (Pich-GFP או Pich-DsRed), ומודול integrase (pICH14011) קידוד לאנזים המשלב 5 'ו 3' מודולים יחד על ביטוי 8,15. שלושה מבני DNA גם יש צורך לביטוי עם וקטורי geminiviral. בנוסף לוקטורים המכילים replicon של גן המטרה (pBYGFP או pBYDsRed), וקטור המקודד חלבון השכפול (pREP110) נדרש ההגברה של יעד replicon 11,14,16. יתר על כן, הכללתו של וקטור קידוד P19 מדכא השתקה מוירוס פעלולים סבוך עגבנייה היא רצויה לביטוי גן המטרה ברמה גבוה 11,16.
יש בדרך כלל שלושה שלבים עיקריים לכניסתה של הגנים של חלבונים רקומביננטיים לתוך תאי צמח על ידי agroinfiltration כולל גידול צמח, א tumefaciens תרבות הכנה, והסתננות. כמו בכל שלב הוא קריטי להצלחתו הסופית של הליך זה ולכן, תיאור מפורט, לכל אחד מהם סיפקעבור שניהם חדירת מזרק וחדירת ואקום בהמשך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול צמחים
- מקום 60 כדורי כבול לתוך מגש התפשטות. הוסף 4 ליטר של מים ברז ולתת כדורי הכבול לספוג את המים במשך שעה 2.
- הוסף 2 נ ' זרעי benthamiana לכל כבול גלולה בשימוש במזרעה, לכסות את המגש עם כיפת פלסטיק שקופה, ולאפשר להם לנבוט ב25 מעלות צלזיוס, סביבת לחות 84% עם מחזור יום / לילה שעות 16/8 (איור 1 א).
- הסר את כיפת שבועיים לאחר זריעה, לנקז מים מהמגש, ולהוסיף 2 ליטר של הדשן של ג'ק בריכוז של 1.48 גר '/ ל' (איור 1). תמשיך לגדל צמחים ב25 מעלות צלזיוס, בסביבת לחות של 50% ביום לשעה / לילה מחזור 16/8. אספקת 2 ליטר של הדשן של ג'ק כל 2 ימים במגש.
- בשבוע 4, להעביר את הצמחים עם כדורי כבול למגש חדש שמארח את שישה צמחים כדי לספק מרחב מספיק להמשך הצמיחה (איור 1 ג) עד שהם מוכנים להסתננו לאחר 6 שבועות של גיל (איור1D).
2. א תרבות הכנת tumefaciens
2.1 הכנה להסתננות מזרק
- א הפס זני tumefaciens GV3101 המכילים את וקטורי geminiviral P19, pREP110, pBYGFP וpBYDsRed על צלחות אגר LB המכילים kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל). פס זן אחד לכל צלחת ולגדול ב 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- באופן דומה, פס ולגדול GV3101 זני מחסה וקטורי MagnICON של 5 'מודול (pICH15879), 3' מודול המכיל את גן המטרה של ה-GFP או DsRed (Pich-GFP או Pich-DsRed), וintegrase (pCH14011) על אגר LB צלחות המכילות carbenicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל).
- ממושבה אחת על הצלחת אגר LB, לחסן GV3101 זני מחסה וקטורי geminiviral ל3 מ"ל של תקשורת YENB (0.75 תמצית שמרי Bacto%, 0.8% מרק מזין, כדי להתאים את pH 7.5 עם NaOH) + kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב צינור תרבות מסביב לתחתית 15 מ"ל, לגדול התרבות הנוזלית על 30 מעלות צלזיוס בשייקר לילה עם קצב סיבוב סל"ד 300.
- באופן דומה, לחסן ולגדול GV3101 זני מחסה וקטורי MagnICON בYENB תקשורת + carbenicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) בלילה בשעה שייקר 30 ° C.
- מדוד ורשום ערכי OD 600 לכל תרבות נוזלית עם ספקטרופוטומטר ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V משנה) להיות subcultured לתרבות חדשה עם 600 OD של 0.025 מתחיל ב 10 מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה .
V תת (מ"ל) = (10 מ"ל) x (0.025) / 600 OD - העברת V משנה (מ"ל) של תרבות הלילה ל( 10 - V משנה) מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה לכל זן. לגדול התרבות החדשה בין לילה על 30 מעלות צלזיוס בייקרה עם קצב סיבוב סל"ד 250 עד 600 OD הערך הוא בטווח של 1.7-2.0.
- מדוד ורשום OD 600 ערכים עבור כל תרבות נוזלית ולהשתמש בנוסחה הבאה לCalculate הנפח הדרוש (V INF) להיות מדולל ב 50 מ"ל של חיץ חדירה לתת OD 600 סופי של 0.12 לכל זן.
V inf (מ"ל) = (50 מ"ל) X (0.12) / 600 OD - העברת V inf (מ"ל) של כל תרבות ותרבות לצינור microcentrifuge ולסובב את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר supernatant resuspend התאים 10 מיליליטר חיץ הסתננות (10 מ"מ MES, pH 5.5, 10 מ"מ MgSO 4) על ידי vortexing לזמן קצר.
- מערבבים resuspended תאים של pBYGFP + + pREP110 P19, לסובב את התאים למטה XG ב 12,000 במשך 2 דקות, וresuspend בסכום כולל של 50 מ"ל של חיץ הסתננות. שילוב Agrobacteria זה לביטוי geminiviral של ה-GFP.
- בדומה לכך, לערבב את השילובים הבאים של תאי Agrobacteria, ספין למטה וresuspend אותם 50 מ"ל של חיץ הסתננות. הם כוללים (1) pBYDsRed + + pREP110 P19 לביטוי geminiviral של DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 לשיתוף ביטוי של ה-GFP וDsRed, (3) pREp110 + P19 כבקרה שלילית של ביטוי geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 לביטוי MagnICON של ה-GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 geminiviral pCH14011 לביטוי MagnICON של DsRed, ו( 6) pICH15879 + pCH14011 כביקורת שלילית לביטוי MagnICON.
2.2 הכנה להסתננות אבק
- לחסן ותרבות כל זן GV3101 המכיל וקטורי geminiviral או וקטורי MagnICON לתוך 15 מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה בבקבוק 50 מ"ל autoclaved ולגדול בין לילה כמתואר לחדירת מזרק לעיל.
- מדוד ורשום ערכי OD 600 לכל תרבות נוזלית עם ספקטרופוטומטר ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V משנה) להיות subcultured לתרבות חדשה עם 600 OD של 0.025 מתחיל ב250 מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה .
V תת > (מ"ל) = (250 מ"ל) x (0.025) / 600 OD - העברת V משנה (מ"ל) של תרבות הלילה ל( 250 - V משנה) מ"ל של תקשורת YENB בבקבוק 1 ליטר autoclaved עם אנטיביוטיקה מתאימה לכל זן ולגדול התרבות החדשה בין לילה, כמתואר לחדירת מזרק לעיל.
- מדוד ורשום OD 600 ערכים עבור כל תרבות נוזלית ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V INF) להיות מדולל ב3 ליטר של חיץ חדירה לתת OD 600 סופי של 0.12 לכל זן.
V inf (מ"ל) = (3000 מ"ל) X (0.12) / 600 OD - גלולה וresuspend V inf (מ"ל) של כל תרבות ותרבות במאגר החדירה כמתואר לחדירת מזרק ומערבבים תרבויות resuspended בהתאם לשילובים שתוארו לחדירת המזרק. Repellet תאי Agrobacteria המעורבים resuspend אותם 3 ליטר של חיץ הסתננות.
S = "jove_title"> 3. הסתננות
הסתננות מזרק 3.1
- בחר ארבע הזקן נ 6 שבועות צמחי benthamiana עם 5 משאיר כל אחד. שלושת הדפים הראשונים לספור מהחלק העליון של כל צמח יהיה הסתנן לחלוטין עם אחד מהשילובים של א ' tumefaciens זנים בחיץ הסתננות. העלה הרביעי יהיה ספוט שחדר עם כל צירופי זן ארבעת לביטוי geminiviral או כל שלושת שילובים לביטוי MagnICON. הדף האחרון בכל מפעל יהיה הסתנן עם שילובים של ביקורת שלילית.
- צור ניק קטן עם מחט בעור בצד האחורי של העלה (איור 2 א). שים לב: הקפד לא לשרוט כל כך קשה כמו לחדור דרך העלה משני הצדדים, כמו תאי Agrobacteria בתערובת ההסתננות יעברו דרך לנקב לצד השני של העלה.
- קח את אחיזה איתנה של הצד הקדמי של העלה ותוך יישום עדיןלחץ נגדי לניק עם האגודל של יד אחת, להזריק את תערובות Agrobacterium בחיץ חדירה לניק עם מזרק בלי מחט (איור 2). הערה: כתערובת Agrobacterium נכנסה למרחב אינטר של העלה, באזור שהחדר יהפוך ירוקה בעליל כהה (איור 2 ג).
- המשך להזריק את תערובות Agrobacterium לניק עד העיגול הירוק הכהה מפסיק להתרחב. ליצור עוד ניק וחזור על שלבי 3.1.2-3.1.4 עד שכל העלים הוא שחדר ועלו כולו הופך ירוקה כהה יותר בשלושת הדפים הראשונים ובדף האחרון.
- לעלה הרביעי של כל צמח, ארבעה (וקטור geminiviral) או שלוש (MagnICON וקטור) כל השילובים יהיו חדרו לתוכו. לעשות אחד ניק עבור כל שילוב של זני Agrobacterium, ולחדור לכל ניק עם שילוב אחד.
- לאחר חדירה, לחזור צמחים לחדר הצמיחה ומוניביטוי חלבון טור בין חדירת פוסט 2-15 ימים (dpi).
הסתננות אבק 3.2
- הנח אמבטיה לייבוש ואקום וחיץ חדירת L 3 העברה המכיל את זני Agrobacterium לאמבטיה. חברו לתא ייבוש משאבת ואקום סרעפת VACUUBRAND (איור 3 א).
- הנח צמח במהופך על צלחת ייבוש (איור 3) ולהוריד את הצלחת עם הצמח עד שמערכת כולה גבעול העלה והוא שקוע לתוך מאגר החדירה עם הצלחת מונחת על של האמבטיה. מניחים את טבעת O ייבוש לאורך השפה ולשים את מכסה תא ייבוש על החדר (איור 3 ג).
- הפעל את משאבת הוואקום ולהתחיל עיתוי שבו מגיע ל -100 mbar הוואקום. לאט לאט לפתוח את שסתום השחרור בייבוש לאחר דקות 1 ב 100 mbar, כדי לאפשר כניסה של Agrobacteria לתוך חללי ביניים של רקמת צמח מתחת למים. חזור על פעולה זו אחת additiזמן onal כדי להבטיח חדירה טובה.
- לאחר חדירה, לקחת את הצמח מחוץ לייבוש והחזיר אותו למצב הזקוף שלו. להעביר צמחים לחדר הצמיחה וביטוי חלבון לפקח בין 2-15 dpi.
4. איתור חלבון פלואורסצנטי וצילום
- החל מ 2 dpi, צמחים לעבור לחדר חשוך ולהאיר אור UV בצד האחורי של עלים שחדר עם מנורת UV מוחזקת ביד.
- שים לב פלואורסצנטי הירוקה של GFP או הקרינה האדומה של DsRed. GFP נותן את אות חזקה עם אור UV גל ארוך, בעוד DsRed הוא חזק יותר תחת אור UV גל קצר.
- קח את התמונות של עלים ניאון עם מצלמה דיגיטלית רגילה ללא פלאש.
- להעביר צמחים לחדר הצמיחה לאחר תצפית או צילום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. ביטוי של חלבונים ניאון על ידי חדירת המזרק
כדי להדגים את היעילות של חדירת המזרק של Agrobacterium לתוך רקמות צמח, בדקנו את הביטוי של שני חלבוני ניאון - GFP וDsRed - ידי שני וקטורים שונים מפורקים צמחים ויראלי - geminiviral וMagnICON - בנ benthamiana. לנ העלים benthamiana שהסתננו לחלוטין עם וקטורים המכילים geminiviral Agrobacteria, הביטוי של GFP נצפה מעל האזור כל העלה תחת אור UV החל ממוקדם ככל dpi 2 והגיעו לשיא בצבירה 4 dpi (איור 4C). הביטוי של GFP מוקדם זה על ידי וקטור geminiviral עולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות של חלבונים רקומביננטיים 14,16,18,19 אחרים. בניגוד לכך, עלי שחדר עם MagnICON הווקטור המכיל שילובי Agrobacterium הראה GFP הקרינה רק לאחר 5 dpi והגיע accumulati המרבי שלובשעת 7 בdpi (איור 4D). לא פלואורסצנטי ירוק נצפה מעלים שחדר עם תערובות Agrobacterium בקרה שליליות של pREP110 + P19 (איור 4) או pICH15879 + pCH14011 (מידע לא מוצג), מצביע על כך שהקרינה הייתה ספציפית לגן GFP ולא הייתה התוצאה של הקרינה רקע מ את העלים. בהצטברות שיאו, הקרינה של MagnICON וקטור, הביע GFP היא אינטנסיבי יותר מזה של וקטור geminiviral (איור 4C ו 4D), בדומה לתוצאות שהתקבלו בעבר עבור חלבונים רקומביננטיים 8,18 אחרים. דפוס הביטוי של הזמן ועוצמת הניאון היחסי של DsRed דומה לאלו של ה-GFP (מידע לא מוצג). נמק גדול לא נצפה על עלים חדרו עם בונה GFP (איור 4 א). תוצאות דומות נצפו גם לצמחים-להביע DsRed, המציין כי גם חלבון פלואורסצנטי הוא רעיל מאוד למפעל לספירהlls. עם זאת, נמק מקומי באתר ניק נצפה והם הופיעו כ" חורים "בתצלומים (איור 4). כאשר שני חלבוני הניאון באו לידי ביטוי באותו העלה באמצעות וקטורי geminiviral עם מזרק ספוט הסתננות, הם התגלו עם צבע הניאון הצפוי שלהם במקום שבו הם חדרו (איור 5). מעניין לציין, כי שיתוף החדירה של ה-GFP וDsRed הביאה הקרינה צהבהבה (איור 5). עוצמת הקרינה DsRed נראית חלש יותר מזה של ה-GFP באותו העלה. עם זאת, זה עשוי שלא לשקף את הביטוי חלש יותר של DsRed, אלא בשל העירור פחות מהאופטימלי של DsRed על ידי אור UV. בסך הכל, התוצאות שלנו מראות כי חדירת מזרק יעילות מציגה גן נושא Agrobacteria לעלי צמח רקומביננטי והביאה לביטוי חזק של חלבוני היעד שלנו. בנוסף, הראינו כי בשיטה זו מאפשרת flexibility לאו לחדור עלים שלמים לצבירה מקסימלי של חלבון המטרה אחת או לזהות-לחדור מטרות חלבון מרובות עם וקטורים מרובים עבור השוואת הביטוי שלהם ודפוס ביטוי.
2. ביטוי של חלבונים ניאון על ידי חדירת אבק
גם חדירת אבק נבדקה לפתח שיטת agroinfiltration מדרגי שיכולים לשמש לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות ביטוי חולפות צמח. התוצאות שלנו מצביעות על כך שדפוס הביטוי הזמני של GFP או DsRed ידי וקטורי geminiviral וMagnICON לא שונתה על ידי השינוי של שיטת חדירה ונשאר דומה לזה של חדירת המזרק. ככולו הצילומים של צמח הוא שקועים בתערובת החדירה במהלך חדירת ואקום, הקרינה נצפתה עבור ה-GFP (איור 6) לכל העלים של הצמחים שהחדר. בהשוואה לחדירת מזרק, זה חזק יותר ויכול ACחדירת hieve של כל מפעל במסגרת זמן הרבה יותר קצרה. לדוגמה, זה לוקח דקות מיומנת סטודנט 15 למזרק לחדור כולו הישן נ 6 שבוע אחד צמח benthamiana. לעומת זאת, יכול להיות שחדר אותו הצמח ב3 דקות על ידי ואקום מההתחלה ועד הסוף, ויכולים להיות שחדר צמחים מרובים באותו הזמן.
איור 1. נ צמחי גידול צמחי benthamiana עם כדורי כבול ומגשי צמיחה. פרוע מסוג ב 0 (א), 2 (ב), 4 (ג) ו -6 (ד ') שבועות לאחר זריעה.
איור 2. חדירת המזרק של נ ' benthamiana עוזבעם tumefaciens Agrobacterium. מסננים GV3101 של א ' tumefaciens מחסה וקטורי MagnICON GFP-לבטא היו resuspended במאגר החדירה והעמיס לתוך מזרק ללא מחט. ניק נוצר עם מחט בצד האחורי של עלה מפעל ישן 6 שבועות (א '). הפתיחה של המזרק הוצבה נגד ניק (ב ') וAgrobacteria במאגר החדירה הוזרקו לתוך החלל בין התאית של העלה דרך ניק (ג).
איור 3. חדירת אבק של נ ' benthamiana עוזב עם tumefaciens Agrobacterium. זנים GV3101 של א ' tumefaciens המכיל חלבון וקטורים המבטאים-היעד היה resuspended בinfiltratioחיץ n ונטען לתוך אמבטיה L 3. האמבטיה הייתה אז הניח לייבוש ואקום שהיה מחובר למשאבת ואקום (). מפעל 6 שבועות ישנים הונח במהופך על צלחת ייבוש (ב '). מערכת גבעול העלה וכולו היה שקוע אז באמבטיה כמו הצלחת הונחה על גבי התא (C). Agroinfiltration הושג על ידי יישום ושחרור ואקום ב 100 mbar פעמיים דקות 1. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. ביטוי של ה-GFP במזרק agroinfiltrated עלים. נ 'השלם העלים benthamiana הסתננו עם זן GV3101 של א ' tumefaciens מחסה גן GFP בvect geminiviral (A ו-C) או MagnICONאו (ד '). עלים ביקורת שליליים שהסתננו עם זני Agrobacteria שאינו מכילים גני שGFP (ב '). עלים צולמו תחת אור לבן () או אור UV (BD) בשעה 4 dpi (AC) או 7 dpi (ד ').
איור 5. ביטוי של GFP וDsRed במזרק עלים ספוט agroinfiltrated. N. עלים benthamiana היו ספוט הסתנן עם GV3101 מחסה GFP, DsRed, או שניהם GFP וגנים DsRed בוקטורי geminiviral. נקודת ביקורת שלילית שהסתננה עם pREP110 + P19. עלים צולמו תחת אור UV ב4 dpi.
איור 6. ביטוי של ה-GFP בואקום agroinfilהעלים trated. N. העלים benthamiana היו הסתננו עם GV3101 מחסה גן GFP בוקטורי MagnICON. עלים צולמו תחת אור UV ב7 dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדרישה הגוברת לתרופות המבוססות על חלבונים ברחבי העולם דורשת פלטפורמות ייצור חדשות כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. צמחים הראו להיות אחת ממערכות הייצור החלופיות המבטיחות ביותר לייצור חלבון תרופות. בשנים האחרונות, ההתפתחות של וקטורים מבוססי וירוס מפורקים אפשרה ביטוי חולף של חלבונים בצמחים, אשר משפר באופן משמעותי את המהירות ואת התשואה של מערכות ביטוי צמח 2,10. כדי לייעל עוד יותר את השירות של מערכת הביטוי החולף, אנחנו מדגימים את הגישה פשוטה אך יעילה וניתן להרחבה להציג Agrobacterium המכיל יעד גן לתוך רקמות צמח. התוצאות שלנו מעידות agroinfiltration שגם עם המזרק או שיטת הוואקום הביאה במבוא יעיל של Agrobacterium לעלי הצמח והייצור חזק של שני חלבוני ניאון, GFP וDsRed.
על מנת להבטיח efficieagroinfiltration NT וייצור חלבון, הפרמטרים הקריטיים הבאים חייבים להיות מבוקרים בקפידה. סטיות מפרמטרים אלה עלולות לגרום ליעילות נמוכה וagroinfiltration בתורו, ביטוי חלבון המטרה נמוך.
1. שלב התפתחות צמח ובריאות. משתנה הסבירה ביותר בשיטה זו היא בין מעבדות החומר הצמחי להסתננות. בעוד הצמחים עשויים להופיע phenotypically דומים, השלב ההתפתחותי שלהם והמצב פיסיולוגי משפיעים על כשירות בביטוי חלבונים רקומביננטיים באופן משמעותי. פרמטרים ספציפיים שיש להם השפעות על גידול צמחים ורמות ביטוי חלבון כוללים טמפרטורה, לחות, עוצמת אור, היצע של דשן, גיל חיסון צמח, וזמן הנדרש להצטברות המרבית של חלבון המטרה, לאחר חדירת העלה. צמחים חייבים באופן עקבי לקבל כמויות שווה של מים ודשנים מדי יום. שינויים קלים בתנאי גידול הצמחים עשויים לשנות באופן דרסטי siz הסופידואר של צמחים וביכולתם להביע את החלבונים רקומביננטיים. המחקרים הקודמים שלנו מצביעים על כך שהצמחים גדלים באור הטבעי הניבו יותר עלה ביומסה, אבל תשואת חלבון היא הרבה פחות מזה גדל תחת אור מלאכותי 4. לכן, שימוש באור מלאכותי הוא שיטת בחירה של גידול צמחים. התוצאות שלנו מראות גם כי מחזור 16 שעות אור / 8 שעות חשוך במהירות של 25 ± 0.5 מעלות צלזיוס היא המצב האופטימלי לגדול נ צמחי benthamiana מתחת לגיל 4 תאורה מלאכותית כזה. אנחנו הראינו כי בתנאים אלה, צמחי 6 שבועות הם גיל האופטימלי עבור ה-GFP וביטוי DsRed כפי שהם מייצרים רמות גבוהות של חלבוני ניאון אילו תשואת ביומסה היא נאותה. צמחים מעל גיל 6 שבועות-לייצר יותר ביומסה, אבל הם גבוהים מדי כדי שיתאימו לתא החדירה 4. בנוסף, פרחים מתחילים להתפתח לאחר 6 שבועות של צמיחה, משפיעים לרעה על 4 ביטוי חלבון רקומביננטי. כתוצאה מכך, צמחי 6 שבועות מכילים L אופטימליחומר EAF שמאזן את הצורך בשילוב של התשואה ביומסה, הצטברות חלבון, ואת הקלות של agroinfiltration.
2. צמיחה וריכוז חדירת Agrobacterium. נקודה מרכזית נוספת במתודולוגיה זו היא השליטה של צמיחה וריכוז חדירה של א ' tumefaciens, כפי שנמדד על ידי OD 600. בכל שלב ותת תרבות, זנים של א ' tumefaciens חייב להיות מבוגר, אבל לא על קוטר חיצוני הייעודי 600. אנחנו בדקנו ריכוזים שונים של א ' tumefaciens לחדירה הסופית של נ benthamiana משאיר 4. ריכוז Agrobacterium נמוך יגרום למסירה מספיקה של גני המטרה לצמחים, מה שמוביל לביטוי נמוך חלבון. מצד השני, אם את ריכוז חדירת Agrobacterium הוא גבוה מדי, זה יהיה לעורר תגובת רגישות יתר ברקמות הסתננו ולהוביל לנימק 20. r שלנוesults הוכיח כי OD 600 = זן Agrobacterium 0.12 מאזן את הצורך במשלוח מרבי של מבנה גן מבלי לגרום לנימק רקמה ומוות של תאים. צפיפות 600 OD הרצוי של Agrobacterium ניתן להשיג על ידי שימוש במדיית עקבי תרבות, טמפרטורה וזמן התרבות.
3. לחדירת אבק, חשוב לעקוב אחרי לחץ הוואקום הייעודי ומשך חדירה. התוצאות שלנו מצביעות על כך שאמבטיה אחת 3 ליטר של תערובת חדירת Agrobacterium יכולה לשמש לחדור כ -30 צמחים. אם יותר מ -30 צמחים צריכים להיות שחדר, קבוצה חדשה של תערובת חדירת Agrobacterium צריך להיות מסופקת.
4. הפרמטרים הספציפיים שהוצגו במאמר זה מותאמים לביטוי של חלבונים באמצעות נ צמחי benthamiana גדלו בתנאים ספציפיים שתוארו לעיל עם וקטורים מבוססי וירוס דקונסטרוקציה. כפי שנאמר קודם לכן, לאהוא קשה ביותר פרמטר לשלוט במתודולוגיה זו הוא החומר צמחי. אנחנו הבענו מגוון של חיסונים וחלבונים טיפוליים באמצעות צמחים ואת הליך החדירה שתארנו כאן וקיבל תוצאות מצוינות בכל המקרים 4,8,14,18,21-23. תוצאות אלה הראו, כי התנאים שפיתחנו הם אופטימליים לביטוי חלבון. עם זאת, אם מינים שונים מארחים צמחים, וקטורי ביטוי, או N. שונה תנאי גידול benthamiana שמשו לחדירה, כל אחד מפרמטרים במתודולוגיה זו היו צריכים להיות מחדש מותאמים על ידי ניסויים.
בסך הכל, יש לנו הראינו כי agroinfiltration עם מזרק וואקום הוא מתודולוגיה פשוטה אך יעילה להציג את גן מטרת ביצוע Agrobacterium לצמחים לביטוי חולף של חלבונים רקומביננטיים. שתי השיטות יש יתרונות הייחודיים משלהם, בהתאם למטרתו של מחקר וייצור. חדירת המזרק היא פשוטה, requires רק בנפחים קטנים של התרבות וAgrobacterium לא צריכים משאבות יקרות ותאי ואקום. כפי שהודגם בדו"ח זה, יש לו את הגמישות או לחדור לכל העלה עם גן היעד אחד או להשתמש בהסתננות מקום להציג את הגנים של מטרות מרובות בדף אחד. שיטת החדירה עלה כולו יכולה לשמש לביטוי בקנה מידה הקטן של מעבדה רקומביננטי חלבון לאפיון ביוכימי שלהם, טיהור, ומחקרי 1 פרה פונקציונליים. בניגוד לכך, ניתן להשתמש בנקודת חדירה להביע את מטרות חלבון מרובות על עלה אחד כדי להשוות את התשואה שלהם, קינטיקה ביטוי והרעילה לצמחים. זה גם יכול לשמש כדי להשוות את הביטוי של חלבון אחד כתבים כגון GFP או DsRed מונע על ידי וקטורי ביטוי שונים באותו הדף. כתוצאה מכך, ניתן לאפיין את יכולתו של הווקטור שונה בנהיגת הצטברות חלבון וקינטיקה הביטוי שלהם. הפשטות של חדירת המזרק גם מאפשרת להכלי אפשרי כדי ללמד ולאמן בתיכון וסטודנטים לתואר ראשון בנושא של ביוטכנולוגיה והנדסה גנטית.
בהשוואה לחדירת מזרק, חדירת האבק דורשת השקעה של משאבות ואקום ותאים ונפחים גדולים יותר של תרבויות Agrobacterium. לכן, זה לא את שיטת הבחירה, כאשר רק כמה צמחים צריכים להיות שחדר. עם זאת, הוא מספק את יכולת ההרחבה, כי לא ניתן להתאים על ידי חדירת המזרק. זה חזק יותר ויכול לחדור למספר רב של צמחים בתקופה קצרה של זמן. עם קנה המידה שהוצגה בדוח זה, אנו מסוגלים לייצר רמת גרם של חלבונים מטוהרים תרופות מספיקות לשלב I 4 ניסוי קליני אנושיים. יתר על כן, תהליך זה יכול להיות עוד יותר מוקטן עד לייצור מסחרי של חלבוני תרופות מצמחים. לדוגמה, תהליכים שתוכננו לואקום לחדור שלוש טונות של נ צמחי benthamiana לשעהבפעולה בהיקף של עד 24. יתרון נוסף של חדירת הוואקום הוא שניתן להשתמש בו לagroinfiltrate מיני צמחים שאינם ניתן לחדירת המזרק.
לסיכום, שילוב של מזרק וחדירת הוואקום מספק חוקרים, biotechnologists ומחנכים המתודולוגיה פשוטה, יעילה, חזקה וניתן להרחבה לביטוי חולף של חלבונים רקומביננטי בצמחים. זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח וייצור של חלבוני תרופות ולקדם את החינוך מדעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מתחרים אינטרסים כספיים.
Acknowledgments
אנו מודים לר 'סאן ותלמידים אחרים של המעבדה של חן על תרומתם לדור לשתול חומר. כמו כן, אנו מודים לד"ר ד 'גרין לתמיכה במחקר לתואר הראשון שלו במכללה לטכנולוגיה וחדשנות (CTI). מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH U01 AI075549 ו1R21AI101329 לשאלת חן, ומענק SSE מCTI של אוניברסיטת אריזונה לחן ש. ק Leuzinger, דנט מ ', ג'הורטדו, וג' Stahnke הם סטודנטים לתואר ראשון הנתמכים על ידי מענק מז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
