Summary
Растения предложить новую систему для производства фармацевтических белков в промышленном масштабе, который является более масштабируемым, экономически эффективным и безопасным, чем текущий парадигмы выражения. В этом исследовании мы сообщаем простой и удобный, но масштабируемый подход ввести целевой ген, содержащий
Abstract
Культуре клеток млекопитающих является основной платформы для коммерческого производства вакцин для человека и терапевтических белков. Тем не менее, она не может удовлетворить растущий во всем мире спрос на лекарственные из-за его ограниченной масштабируемостью и высокой стоимостью. Растения показано, что одним из наиболее перспективных альтернативных платформ фармацевтического производства, которые являются надежной, масштабируемой, недорогой и безопасный. Недавнее развитие вируса векторы на основе позволило быстро и на высоком уровне временной экспрессии рекомбинантных белков в растениях. Для дальнейшей оптимизации полезности переходные системы экспрессии, мы демонстрируем простое, эффективное и масштабируемое методологии ввести целевой ген, содержащий Agrobacterium в ткань растений в данном исследовании. Наши результаты показывают, что агроинфильтрации как с шприц и вакуумные методы привели к эффективному введение в Agrobacterium листьев и надежный выпуск двух флуоресцентные белки, GFP и DsRed. Кроме того,мы демонстрируем уникальные достоинства обоих методов. Шприц инфильтрации прост и не требует дорогостоящего оборудования. Это также позволяет гибко либо проникать весь отпуск одного гена-мишени, или для введения генов из нескольких целей на одном листе. Таким образом, он может быть использован для лабораторного масштаба экспрессии рекомбинантных белков, а также для сравнения различных белков или векторы выход или выражение кинетики. Простота шприц инфильтрации также предполагает его полезность в средней школе и колледже образования для предмета биотехнологии. В отличие от вакуумной инфильтрации является более надежной и может быть расширены для коммерческого производства фармацевтических белков. Он также предлагает то преимущество, что в состоянии agroinfiltrate видов растений, которые не поддаются для шприца инфильтрации, такие как салат и Arabidopsis. В целом, сочетание и вакуумного шприца агроинфильтрации предоставляет исследователям и педагогам простой, эффективный и надежныйМетодология временной экспрессии белка. Это будет в значительной степени способствовать развитию фармацевтических белков и поощрения научного образования.
Introduction
С 1970-х растений были изучены в качестве альтернативы млекопитающих, насекомых и бактериальные культуры клеток для промышленного производства рекомбинантных белков и белковых терапевтических 1. Завод-систем для выражения биофармацевтических препаратов показали обещание в последние годы в несколько обработок романа для заболевания, как болезнь Гоше 2, и птичьего гриппа H5N1 3, показали успехи в клинических испытаниях. Развитие компетентного механизмы экспрессии рекомбинантных белков в растениях в течение десятилетий после тех первых экспериментов были созданы возможности для растительных систем для изменения существующей парадигмы производства белка по трем основным причинам. Во-первых, существует заметное снижение стоимости, как млекопитающих, насекомых, и бактериальные биореакторов потребует значительных стартовых затрат, дорогих питательных сред и сложных процессов для последующей очистки 4. Создание стабильных трансгенного растениялиний также позволяет им опережать масштабируемости в системах экспрессии белка как выражения растения могут быть выращены и собраны на сельскохозяйственных масштабе 5. Во-вторых, растительных системах экспрессии значительно снизить риск передачи человека или животного патогена из белка, экспрессирующих множество для человека, демонстрирующий превосходство в общественной безопасности 6. Наконец, растения используют эукариотической системе endomembrane, который похож на клетки млекопитающих, что позволяет должным пост-трансляционной модификации белков, включая гликозилирования и сборка нескольких субъединиц белки 7. Эта способность ставит растительных системах раньше тех, на основе прокариотических системах, таких как бактерии, так как более широкий круг фармацевтических рекомбинантных белков, в том числе моноклональных антител (МКА), имеют более сложную структуру и требуют больших посттрансляционных модификаций или сборки 8.
Есть два основных соответствуюболи в экспрессирующих рекомбинантные белки в растениях. Первым является разработка стабильно трансгенной линии, где ДНК, кодирующей целевой белок, клонировали в экспрессирующую кассету и введены либо к ядерной или хлоропластов геномов. При этом чужеродной ДНК становится наследственной через грядущие поколения и позволяет значительной мере улучшилась масштабируемость, намного превосходящее другие системы выражения 1. Введение экзогенной ДНК в ядерном геноме обычно достигается путем Agrobacterium tumefaciens инфекции тканей растений или, реже, на бомбардировки микрочастицами ткани 9. Завод гормонов затем используются для индукции дифференцировки и роста тканей трансгенных растений, таких как корней и листьев. Трансформация геном хлоропласта не может быть достигнуто с А. tumefaciens, но полностью полагается на золотые или вольфрамовые частицы, покрытые ДНК уволен баллистическим в клетки растений. Второй способ выражения рекомбинацииNT белка в растениях через временной экспрессии 10. В этом случае вирус полученных векторов, содержащих ген доставляется через А. tumefaciens в полной мере разработаны растений посредством процесса, называемого агроинфильтрации. Вместо интеграции в геном растения, поставленного генная конструкция начнет направлять переходного производства желаемого белка, которые могут быть собраны и изолированы после короткого периода инкубации. Переходные экспрессии гена дает преимущество более высокой общей накопление белка, а также улучшенное время производства белка, как растения будут готовы для сбора примерно через 1-2 недели после агроинфильтрации 11. Это значительно быстрее, чем процессы генерации, выбора и подтверждения стабильного линии трансгенных растений, что может занять от нескольких месяцев до года. Это, однако, является также ограничение переходного системы экспрессии, так как она не даст генетически стабильными завода Лидругом месте, которые могут быть использованы для создания банка семян для крупномасштабного коммерческого производства. Несмотря на это, подходы были разработаны для улучшения больших масштабах временной экспрессии. Здесь мы показываем один метод генерации переходных белка-экспрессирующие растения Nicotiana benthamiana деконструкции использованием вирусных векторов выступил А. tumefaciens.
Две основные методы разрабатываются для доставки А. tumefaciens в ткань растений: стендовом инфильтрации через шприц и большие масштабы инфильтрации через вакуумную камеру. Оба протокола описаны здесь используя N. benthamiana, которая тесно связана с общим завода табака, а растения-хозяина для временной экспрессии двух флуоресцентных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea Виктории и красного флуоресцентного белка из Discosoma коралл (DsRed) 12,13. Н. benthamiana является наиболее распространенным растением-хозяиномрекомбинантного белка, потому что это поддается генетической трансформации, может дать большое количество биомассы быстро, и плодовитый производитель семян для расширения масштабов производства 14. Другое преимущество использования N. benthamiana качестве хозяев для экспрессии белка является наличие различных векторов экспрессии 2,5. В этом исследовании, вскрывают две вирусные векторы, основанный на вирус табачной мозаики (ВТМ) РНК репликона системы (MagnICON векторы) и другие, полученные из бобов вирус желтой карликовости (BeYDV) ДНК репликон системы (geminiviral векторы), 4,11, 15-18, которые используются для выполнения GFP и ген DsRed и доставить их в N. benthamiana клеток с помощью А. tumefaciens. Три конструкции ДНК будет использоваться для GFP или DsRed выражение с MagnICON векторов. Они включают в себя 5 'модуль (pICH15879), содержащий промотор и другие генетические элементы для запуска экспрессии гена-мишени, 3'-модуль, содержащий представляющий интерес ген (PICH-GFP или PICH-DsRed) и интегразы модуль (pICH14011), кодирующий фермент, который объединяет 5 'и 3' модулей вместе при экспрессии 8,15. Три конструкции ДНК также необходимы для выражения geminiviral векторов. В дополнение к векторы, содержащие репликон гена-мишени (pBYGFP или pBYDsRed), вектор кодирующий белок репликации (pREP110) требуется для амплификации целевой репликон 11,14,16. Кроме того, включение вектор, кодирующий p19 супрессоров глушителей из томатной густые вируса трюков желательно за высокий уровень Экспрессия гена-мишени 11,16.
Есть вообще три основных этапа для введения генов рекомбинантных белков в клетки растений путем агроинфильтрации в том числе рост растений, А. tumefaciens культуры подготовки и инфильтрации. Как и каждый шаг имеет решающее значение для конечного успеха этой процедуры, поэтому, подробное описание для каждого предусмотрендля инфильтрации шприц и вакуумной инфильтрации ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Роста растений
- Место 60 торфяных гранул в распространении лоток. Добавить 4 л водопроводной воды и дайте Торфяные гранулы поглощают воды в течение 2 часов.
- Добавить 2 N. benthamiana семена в торфяные каждый осадок в сеялку, накройте поднос с прозрачным пластиковым куполом, и дать им возможность прорасти в 25 ° С, 84% влажности с 16/8 часов день / ночь цикла (рис. 1А).
- Удалить купола через две недели после посева, слива воды из поддона, а также добавить 2 л удобрения Джека при концентрации 1,48 г / л (фиг. 1В). Продолжают расти растения в 25 ° С, 50% влажности с 16/8 часов день / ночь цикла. Питание 2 л удобрения Джека каждые 2 дня в лоток.
- На 4 неделе, передавать растениям топливные гранулы, торф в новый лоток на котором размещены шесть заводов, чтобы обеспечить достаточное пространство для дальнейшего роста (рис. 1в), пока они не будут готовы к проникли в возрасте 6 недель (рис.1D).
2. А. Подготовка tumefaciens культуры
2.1 Подготовка к Шприц инфильтрация
- А. подряд tumefaciens GV3101 штаммов, содержащих geminiviral векторов p19, pREP110, pBYGFP и pBYDsRed на LB-агаром, содержащим канамицин (100 мкг / мл). Подряд один штамм на чашке и расти при температуре 30 ° С в течение 48 часов.
- Кроме того, полоса и расти GV3101 Штаммы MagnICON векторов 5 'модуль (pICH15879), 3'-модуля, содержащего целевой ген GFP или DsRed (PICH-GFP или PICH-DsRed) и интегразы (pCH14011) на LB-агар чашки, содержащие карбенициллин (100 мкг / мл).
- С одной колонии на агаром LB, прививку GV3101 Штаммы geminiviral векторов в 3 мл YENB носитель (0,75% Bacto дрожжевой экстракт, 0,8% питательный бульон, довести рН до 7,5 с помощью NaOH) + канамицин (100 мкг / мл) в 15 мл с круглым дном пробирку, расти жидкой культуры при 30 ° С вшейкере в течение ночи при скорости вращения 300 оборотов в минуту.
- Кроме того, прививку и расти GV3101 Штаммы MagnICON векторов в YENB медиа + карбенициллин (100 мкг / мл) в шейкере в течение ночи при 30 ° С.
- Измерение и запись OD 600 значений для каждой культуральной жидкости с помощью спектрофотометра и использовать приведенную ниже формулу для расчета необходимого объема (V суб) для пересевали на новую культуру с начальной OD 600 0,025 в 10 мл среды YENB с соответствующими антибиотиками .
В суб (мл) = (10 мл) х (0,025) / OD 600 - Передача суб V (мл) в течение ночи культуру (10 - V суб) мл среды YENB с соответствующими антибиотиками для каждого штамма. Вырастить новую культуру в течение ночи при 30 ° C в шейкере со скоростью вращения 250 оборотов в минуту, пока OD 600 значение не находится в диапазоне 1,7-2,0.
- Измерьте и запишите OD 600 значений для каждой культуральной жидкости и использовать следующую формулу известковоУлате необходимый объем (V инф) в разбавлении в 50 мл инфильтрации буфере до конечной OD 600 0,12 для каждого штамма.
V инф (мл) = (50 мл) х (0.12) / OD 600 - Передача инф V (мл) каждой культуры в микроцентрифужных трубки и спином вниз клетки центрифугированием при 12000 х г в течение 2 мин, удалить супернатант и затем клетки вновь суспендируют в 10 мл буфера инфильтрация (10 мМ MES, рН 5,5, 10 мМ MgSO 4) путем встряхивания кратко.
- Смешать ресуспендировали клетки pBYGFP pREP110 + + p19, спина клетки вниз при 12000 х г в течение 2 мин и ресуспендируют в общей сложности 50 мл инфильтрации буфера. Это Agrobacteria комбинация для geminiviral выражения GFP.
- Аналогично, смешайте следующие комбинации Agrobacteria клетки, спин вниз и ресуспендируйте их в 50 мл буфера инфильтрации. Они включают в себя (1) + pBYDsRed pREP110 + P19 для geminiviral выражение DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 для geminiviral совместной экспрессии GFP и DsRed, (3) pREp110 + p19 как отрицательный контроль geminiviral выражения, (4) Пич-GFP + + pICH15879 pCH14011 MagnICON для выражения GFP, (5) Пич-DsRed + + pICH15879 pCH14011 для MagnICON выражение DsRed, и (6) + pICH15879 pCH14011 в качестве отрицательного контроля для MagnICON выражения.
2.2 Подготовка к вакуумной инфильтрации
- Inoculate и культуры каждого штамма GV3101 содержащий geminiviral векторы или MagnICON векторов в 15 мл среды YENB с соответствующими антибиотиками в 50-мл автоклаве колбу и расти в течение ночи, как описано в шприц инфильтрации выше.
- Измерение и запись OD 600 значений для каждой культуральной жидкости с помощью спектрофотометра и использовать приведенную ниже формулу для расчета необходимого объема (V суб) для пересевали на новую культуру с начальной OD 600 0,025 в 250 мл среды YENB с соответствующими антибиотиками .
В суб 600 - Передача суб V (мл) в течение ночи культуру (250 - V суб) мл среды YENB в 1 л автоклаве колбе с соответствующими антибиотиками для каждого штамма и расти новую культуру быстро, как описано в шприц инфильтрации выше.
- Измерение и запись OD 600 значений для каждой культуральной жидкости и использовать приведенную ниже формулу для расчета необходимого объема (V инф), чтобы развести в 3 л инфильтрации буфере до конечной OD 600 0,12 для каждого штамма.
Инф V (мл) = (3000 мл) х (0.12) / OD 600 - Гранулы и ресуспендируют V инф (мл) каждой культуры в инфильтрация буфера, как описано в шприц инфильтрации и смешивать ресуспендировали культур в соответствии с описанной комбинации для шприца инфильтрации. Repellet смешанный агробактерий клетки и ресуспендируют их в 3 л инфильтрации буфера.
Шприц 3,1 инфильтрация
- Выбор четырех 6-недельных N. benthamiana растения с 5 листьев каждая. В первых трех листьев считая сверху каждого растения будут проникли полностью с одной из комбинаций А. tumefaciens штаммов инфильтрации в буфер. Четвертый лист будет спот-проникли со всеми четырьмя комбинациями деформации для geminiviral выражения или все три комбинации для MagnICON выражения. Последний лист на каждое растение будет проникли с комбинациями отрицательных контролей.
- Создание уменьшенной ник с иглой в эпидермисе на обратной стороне листа (фиг. 2А). Внимание: убедитесь, чтобы не поцарапать сильно, чтобы не проколоть листать обеих сторон, а Agrobacteria клеток в инфильтрации смесь пройдет через прокол на другой стороне листа.
- Возьмем твердую провести на передней стороне листа и при применении нежныйСчетчик давление на Ника с большим пальцем одной руки, вводят в Agrobacterium смесей инфильтрации буфера в ник с помощью шприца без иглы (рис. 2В). Примечание: Так как смесь Agrobacterium входит в межклеточное пространство листа, проникли Область станет заметно темнее зеленый (рис. 2С).
- Продолжают вводить Agrobacterium смесей в ник, пока темно-зеленый круг не перестает расширяться. Создайте другой ник и повторите шаги 3.1.2-3.1.4, пока весь лист не проникли и весь лист станет темно-зеленым в течение первых трех листьев и последний лист.
- За четвертый лист каждого растения, все четыре (geminiviral вектор) или три (MagnICON вектор) комбинаций будет проникли в нее. Сделайте один ник для каждой комбинации штаммов Agrobacterium, и проникновения в каждом нике с одной комбинации.
- После инфильтрации, переместите растения обратно в комнату роста и мониторингаTor экспрессии белка между 2-15 дней после инфильтрации (точек на дюйм).
3,2 вакуумной инфильтрации
- Положите в ванну вакуум эксикаторе и передачи 3 л инфильтрации буфер, содержащий штаммы Agrobacterium к ванне. Подключите эксикаторе Vacuubrand вакуумный насос диафрагмы (рис. 3А).
- Поместите растение вверх дном на эксикаторе пластины (рис. 3В) и опустите пластину с заводом, пока весь листьев и стеблей система не будет погружена в инфильтрации буфера с пластиной отдыхал на вершине из ванны. Установите кольцо O эксикаторе по кругу и положить эксикаторе крышку на камеру (рис. 3в).
- Включите вакуумный насос и начать отсчет, когда вакуум достигает 100 мбар. Медленно откройте выпускной клапан на эксикаторе после 1 мин при 100 мбар, чтобы вход Agrobacteria в промежуточные места подводных растительных тканей. Повторите этот шаг одним дополнительнальных время, чтобы обеспечить хорошее проникновение.
- После инфильтрации, возьмите растение из эксикаторе и положил его обратно в вертикальное положение. Переместить растения обратно в комнату рост и выражение белка между монитором 2-15 точек на дюйм.
4. Флуоресцентной детекции белков и фотография
- Начиная с 2 точек на дюйм, перемещение растений в темной комнате и блеск ультрафиолетового света на задней стороне пропитанных листов с ручным УФ-лампы.
- Обратите внимание на зеленую флуоресценцию GFP или красной флуоресценции DsRed. GFP испускает сильный сигнал с длиной волны ультрафиолетового света, в то время DsRed сильнее под короткие световые волны УФ.
- Сфотографировать люминесцентные листья с обычной цифровой камерой без вспышки.
- Переместить растения обратно в комнату после роста наблюдения или фотографии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Выражение флуоресцентных белков с помощью шприца инфильтрация
Чтобы продемонстрировать эффективность шприца инфильтрации Agrobacterium в ткань растений, мы протестировали экспрессии двух флуоресцентных белков - GFP и DsRed - двумя разными деконструкции завода вирусных векторов - geminiviral и MagnICON - в N. benthamiana. Для Н. benthamiana листья, которые были полностью проникли с Agrobacteria содержащие geminiviral векторы, GFP выражении наблюдался по всей площади листа в УФ-свете, начиная от самого раннего до 2 точек на дюйм и достигла пика накопления на 4 точек на дюйм (рис. 4в). Это раннее выражение GFP по geminiviral вектор согласуется с предыдущими результатами других рекомбинантных белков 14,16,18,19. В отличие, листья проникли с MagnICON содержащие вектор Agrobacterium комбинации показал флуоресценции GFP только после 5 точек на дюйм и достиг своего максимального accumulatiна в 7 точек на дюйм (рис. 4D). Нет зеленая флуоресценция не наблюдалась из листьев проникли с отрицательным контролем смеси Agrobacterium из pREP110 + p19 (фиг. 4В) или pICH15879 + pCH14011 (данные не приведены), что свидетельствует о том, что флуоресценция конкретно с геном GFP, и не было результатом фоновой флуоресценции от листьев. На своем пике накопления, флуоресценция MagnICON выраженных вектора GFP более интенсивно, чем у geminiviral вектора (рис. 4С и 4D), аналогичные результаты получены ранее для других рекомбинантных белков 8,18. Временной паттерн экспрессии и относительной интенсивности флуоресценции DsRed подобны тем, что из GFP (данные не показаны). Никаких серьезных некроза не наблюдается на листьях проникли с конструкциями GFP (рис. 4а). Аналогичные результаты наблюдались также для DsRed экспрессирующих растений, о том, что ни флуоресцентный белок высоко токсичен для растений CELLS. Тем не менее, местный некроз на месте Ника наблюдалось, и они появились как "дыры" в фотографии (рис. 4). Когда оба флуоресцентные белки экспрессируются на тот же лист через geminiviral векторов со шприцем спот-инфильтрация, они были обнаружены с их ожидаемым флуоресцентные цвета в том месте, где они были внедрены (рис. 5). Интересно, что совместное инфильтрации GFP и DsRed в результате желтовато флуоресценции (рис. 5). Интенсивность флуоресценции DsRed оказалось слабее, чем у GFP на том же листе. Однако это может не отражать слабые выражения DsRed, а скорее из-за менее чем оптимального возбуждения DsRed УФ-светом. В целом, наши результаты показывают, что шприц инфильтрации эффективно вводит рекомбинантный ген несущих Agrobacteria в листьях растений и в результате надежные выражение нашей белки-мишени. Кроме того, мы показали, что этот метод позволяет Flexibilности либо проникнуть цельными листьями для максимального накопления одного белка-мишени или обнаружить-проникнуть несколько целей белка с несколькими векторами для сравнения их выражения и паттерна экспрессии.
2. Выражение флуоресцентных белков путем пропитывания под вакуумом
Вакуумной инфильтрации исследовали также разработать способ масштабируемого агроинфильтрации которые могут быть использованы для крупномасштабного производства рекомбинантных белков растений переходных системах экспрессии. Наши результаты показывают, что временной паттерн экспрессии GFP или DsRed по geminiviral и MagnICON векторов не было изменено путем изменения инфильтрации метод и оставался похож на шприц инфильтрации. Поскольку весь побегов растений погружена в смесь инфильтрации при вакуумной инфильтрации флуоресценции наблюдалась GFP (рис. 6) для всех листьев проникли растений. По сравнению с инфильтрацией шприц, она является более надежной и может AChieve инфильтрации каждое растение с гораздо более короткие сроки. Например, он принимает квалифицированный студент 15 мин до шприца проникать один весь 6-недельных N. benthamiana завода. В отличие от того же растения могут проникнуть в 3 мин вакуум от начала до конца и несколько растений могут проникнуть в то же время.
Рисунок 1. N. benthamiana роста растений гранулы торфа и рост лотков. растений дикого типа при 0 (A), 2 (Б), 4 (C) и 6 (D) недель после посева.
Рисунок 2. Шприц инфильтрации Н. benthamiana оставляетс Agrobacterium tumefaciens. Процедить GV3101 А. tumefaciens несущие GFP-экспрессирующих векторов MagnICON ресуспендировали в буфере инфильтрации и загружали в шприц без иглы. Ник был создан с помощью иглы на задней стороне в возрасте 6 недель листьев растения (А). Отверстие шприца была расположена по отношению к ник (B) и агробактерий в инфильтрация буфера вводили в межклеточном пространстве листа через ник (С).
Рисунок 3. Вакуумной инфильтрации Н. benthamiana листья с Agrobacterium tumefaciens. штамм GV3101 А. tumefaciens содержащего белка-мишени, экспрессирующие векторы ресуспендировали в infiltratioн буфера и помещают в 3 л ванне. Ванна затем помещают в вакуум-эксикаторе, который был соединен с вакуумным насосом (A). В возрасте 6 недель завод был перевернут на эксикаторе пластины (B). Весь листьев и стеблей система была погружена в ванну как планшет помещали поверх камеры (C). Агроинфильтрация было достигнуто путем применения и выпуская вакууме при 100 мбар в два раза в течение 1 мин. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Экспрессия GFP в шприце агроинфильтрации листьев. Целые Н. benthamiana листья проникли с штамм GV3101 А. tumefaciens, несущий ген GFP в geminiviral (А и С) или MagnICON Вектили (D). Отрицательный контроль листьев были внедрены с агробактерий штаммов, не содержащих что ген GFP (B). Листья были сфотографированы при дневном свете (A) или ультрафиолетового света (BD) при 4 точек на дюйм (AC) или 7 точек на дюйм (D).
Рисунок 5. Экспрессия GFP и DsRed в шприце спот-агроинфильтрации листьев. Н. benthamiana листья были спот-проникли с GV3101 укрывательстве GFP, DsRed, или оба GFP и DsRed генов в geminiviral векторов. Отрицательное месте контроль проникли с pREP110 + P19. Листья были сфотографированы в УФ-свете при 4 точек на дюйм.
Рисунок 6. Экспрессия GFP в вакууме agroinfilрованной листьев. Н. benthamiana листья проникли с GV3101, несущие ген GFP в MagnICON векторов. Листья были сфотографированы под УФ-светом в 7 точек на дюйм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растущие требования к основе белка во всем мире фармацевтическая требуют новых добывающих платформ, которые являются надежной, масштабируемой, недорогой и безопасный. Растения показано, что одним из наиболее перспективных альтернативных производственных систем для фармацевтического производства белка. В последние годы, развитие вскрывают вирус векторы на основе позволило временной экспрессии белков в растениях, который значительно повышает скорость и выход из системы экспрессии в растении 2,10. Для дальнейшей оптимизации полезности переходные системы экспрессии, мы показываем, простой, но эффективный и масштабируемый подход к внедрению гена-мишени содержащей Agrobacterium в ткань растений. Наши результаты показывают, что агроинфильтрации либо шприц или вакуумным способом привело к эффективному введению Agrobacterium в листьях растений и надежный выпуск двух флуоресцентные белки, GFP и DsRed.
Для обеспечения efficieнт агроинфильтрации и белка, следующие критические параметры необходимо тщательно контролировать. Отклонения от этих параметров может привести к низкой эффективности агроинфильтрации и, в свою очередь, низкий уровень экспрессии белка-мишени.
1. Завод стадии развития и здоровья. Наиболее вероятным переменная в этом методе между лабораториями является растительный материал для инфильтрации. В то время как растения могут появиться фенотипически подобных, их стадии развития и физиологического состояния влияют на их компетентность в экспрессирующих рекомбинантные белки значительно. Конкретные параметры, которые оказывают воздействие на рост растений и уровни экспрессии белка включают температуру, влажность, интенсивность света, поставки удобрений, возраста растений инокуляции, и время, необходимое для максимального накопления целевого белка после того, как лист инфильтрации. Растения должны последовательно получать равное количество воды и удобрений ежедневно. Незначительные изменения в условиях роста растений может кардинально изменить окончательные СИЗэлектронной растений и их способность к экспрессии рекомбинантных белков. Наши предыдущие исследования показали, что растения, выращенные в условиях естественного освещения привели к более лиственной биомассы, но выход белка гораздо меньше, чем выращенные в искусственном свете 4. Поэтому, используя искусственный свет является методом выбора для роста растений. Наши результаты также показывают, что 16 часов света / 8 ч темноты при температуре 25 ± 0,5 ° С является оптимальной состоянии расти Н. benthamiana растений в таких искусственных 4 освещения. Мы показали, что при таких условиях 6-недельных растений оптимальный возраст для GFP и DsRed выражение, поскольку они производят высокого уровня флуоресцентные белки, в то время как выход биомассы является адекватным. Растения старше 6-недель производить больше биомассы, но слишком высоки, чтобы вписаться в инфильтрации камере 4. Кроме того, цветы начинают развиваться после 6 недель роста, негативно влияющие рекомбинантной экспрессии белка 4. Следовательно, 6-недельных растений содержат оптимальные лп. ф материал, который уравновешивает комбинированного необходимости выхода биомассы, накопление белка, и легкость агроинфильтрации.
2. Рост и концентрацию инфильтрации Agrobacterium. Еще одним ключевым моментом в данной методике является контроль за ростом и инфильтрацией концентрации А. tumefaciens, измеряемый OD 600. На каждом шаге культуры и субкультуры, штаммы A. tumefaciens должна быть выращена, но не более назначенного OD 600. Мы рассмотрели несколько концентраций А. tumefaciens для окончательного инфильтрации N. benthamiana оставляет 4. Низкая концентрация Agrobacterium приведет к недостаточной доставки генов-мишеней в растения, что приводит к низкой экспрессией белка. С другой стороны, если концентрация инфильтрации Agrobacterium слишком высока, это вызовет реакции гиперчувствительности в пропитанных тканей и привести к некрозу 20. Наша Results показали, что OD 600 = 0,12 штамм Agrobacterium уравновешивает необходимость максимальной доставки генной конструкции, не вызывая некроз ткани и гибели клеток. Желаемый OD 600 Плотность Agrobacterium может быть получено с использованием последовательной культуральной среды, температуры и времени культивирования.
3. Для вакуумной инфильтрации, важно следовать назначенному вакуума и инфильтрации продолжительности. Наши результаты показывают, что 3 л ванне смесь инфильтрации Agrobacterium, могут быть использованы для проникновения около 30 растений. Если более 30 заводов должны быть проникли, новая партия Agrobacterium смесь инфильтрации должно быть поставлено.
4. Конкретные параметры, представленные в настоящем документе, оптимизированные для экспрессии белков использованием N. benthamiana растений, выращенных при определенных условиях, описанных выше, с вскрывают вирус на основе векторов. Как уже говорилось ранее, тон самый сложный параметр для управления в этой методологии является растительного материала. Мы выразили целый ряд вакцин и терапевтических белков с использованием растений и инфильтрации процедуры мы описали здесь и получили отличные результаты во всех случаях 4,8,14,18,21-23. Эти результаты показали, что условия, мы разработали оптимальные для экспрессии белка. Однако, если другой хост видов растений, векторы экспрессии, или различные N. Benthamiana условия роста были использованы для проникновения, каждый параметр в этой методологии должны быть повторно оптимизированы путем экспериментов.
В целом, мы продемонстрировали, что агроинфильтрации с шприц и вакуум представляет собой простую, но эффективную методику внедрения ген-мишень проведения Agrobacterium в растения для временной экспрессии рекомбинантных белков. Оба метода имеют свои уникальные преимущества в зависимости от целей исследований и производства. Шприц инфильтрации прост, Requirы только небольшие объемы культуры Agrobacterium и не требует дорогих насосов и вакуумных камер. Как показано в настоящем докладе, он имеет возможность либо проникнуть в весь лист с одним геном-мишенью или использовать место инфильтрации ввести гены нескольких целей на одном листе. Весь способ инфильтрации лист может быть использован для малых выражение лабораторных рекомбинантного белка для их биохимические характеристики, очистки и доклинические функциональные исследования 1. В противоположность этому, место инфильтрации может быть использован, чтобы выразить несколько целей белка на один лист сравнить их урожайность, выражение кинетики и токсичность для растений. Она также может быть использована для сравнения экспрессии одного репортерного белка, такие как GFP или DsRed лежат различные векторы экспрессии на том же листе. Как следствие, способность различных вектора в продвижении накопление белков и их кинетики выражение может быть охарактеризован. Простота шприц инфильтрации также позволяет емувозможным инструментом для обучения и подготовки средней школы и студентов в теме биотехнологий и генной инженерии.
По сравнению с шприцем инфильтрация, вакуумной инфильтрации требует инвестиций вакуумных насосов и камер и больших объемов Agrobacterium культур. Таким образом, это не метод выбора, когда всего несколько растений, должны иметь проникли. Однако, это обеспечивает масштабируемость, которые не могут быть сопоставлены с помощью шприца инфильтрации. Это более надежными и могут проникнуть большое количество растений в течение короткого периода времени. Со шкалой представленные в данном отчете, мы в состоянии производить грамм очищенного уровне фармацевтических белков достаточно для фазы I клинических 4 человека суд. Кроме того, этот процесс может быть еще более увеличенном масштабе для коммерческого производства фармацевтических белков из растений. Например, процессы в настоящее время разрабатываются в вакууме проникнуть три тонны Н. benthamiana растений в часв расширение масштабов операции 24. Другим преимуществом вакуумной инфильтрации, что он может быть использован для agroinfiltrate видов растений, которые не поддаются для шприца инфильтрации.
Таким образом, сочетание шприц и вакуумной инфильтрации предоставляет исследователям, биотехнологов и педагогам простой, эффективный, надежный и масштабируемый методологии временной экспрессии рекомбинантных белков в растениях. Это значительно облегчит разработку и производство фармацевтических белков и поощрения научного образования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Не авторы не конкурирующие между собой финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим Р. ВС и другими студентами Лаборатории Чэня за их вклад в растительный материал поколения. Мы также благодарим доктора Д. Грин за поддержку исследований студентов в колледже технологии и инноваций (CTI). Это исследование было частично поддержана грантами NIH U01 AI075549 и 1R21AI101329 к Q. Chen, и SSE грант от CTI из Университета штата Аризона в Q. Chen. Leuzinger К., М. Дент, J. Уртадо, Дж. Stahnke являются студенты поддерживают SSE гранта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
