Summary
Planter tilbyder en roman system til produktion af farmaceutiske proteiner i kommerciel målestok, der er mere skalerbar, omkostningseffektiv og sikker end de nuværende udtryk paradigmer. I denne undersøgelse rapporterer vi en enkel og bekvem, men skalerbar fremgangsmåde til at indføre mål-gen indeholdende
Abstract
Pattedyrcellekultur er den vigtigste platform til kommerciel produktion af humane vacciner og terapeutiske proteiner. Men det kan ikke imødekomme den stigende globale efterspørgsel efter lægemidler på grund af sin begrænsede skalerbarhed og høje omkostninger. Planter har vist sig at være en af de mest lovende alternative farmaceutiske produktionsanlæg platforme, der er robust, skalerbar billig og sikker. Den seneste udvikling af virus-baserede vektorer har tilladt hurtig og højt niveau forbigående ekspression af rekombinante proteiner i planter. For yderligere at optimere anvendeligheden af den forbigående ekspression system vi vise en enkel, effektiv og skalerbar metode til at indføre mål-gen indeholdende Agrobacterium i plantevævet i denne undersøgelse. Vores resultater viser, at agroinfiltration med både sprøjten og vakuum metoder har resulteret i en effektiv indførelse af Agrobacterium til blade og robust produktion af to fluorescerende proteiner, GFP og DsRed. Endviderevi demonstrere de unikke fordele ved begge metoder. Sprøjte infiltration er enkel og behøver ikke dyrt udstyr. Det giver også fleksibilitet til enten infiltrere hele ferie med et målgen, eller at indføre gener af flere mål på et blad. Således kan det anvendes til laboratorie skala ekspression af rekombinante proteiner samt for at sammenligne forskellige proteiner eller vektorer for udbytte eller ekspression kinetik. Enkeltheden i sprøjten infiltration også antyder dens anvendelighed i high school og college uddannelse for emnet bioteknologi. I modsætning hertil er vakuum infiltration mere robust og kan skaleres op til kommerciel fremstilling af farmaceutiske proteiner. Det giver også den fordel, at kunne agroinfiltrate plantearter, der ikke er modtagelig for injektionssprøjte infiltration såsom salat og Arabidopsis. Samlet set kombinationen af sprøjten og vakuum agroinfiltration giver forskere og undervisere en enkel, effektiv og robustmetode til forbigående proteinekspression. Det vil i høj grad fremme udviklingen af farmaceutiske proteiner og fremme videnskabelig uddannelse.
Introduction
Siden 1970'erne har planterne blevet udforsket som alternativer til pattedyr, insekter, og bakterielle cellekulturer til kommerciel produktion af rekombinante proteiner og protein terapi 1.. Plant-baserede systemer til ekspression af biofarmaceutiske har vist lovende i de seneste år, da flere nye behandlinger for sygdomme, ligesom Gauchers sygdom 2 og aviær H5N1 influenza 3, har haft succes i kliniske forsøg. Udviklingen af kompetente mekanismer for rekombinant protein ekspression i planter I årtier siden disse indledende eksperimenter har skabt potentiale for plante-baserede systemer til at ændre den nuværende paradigme af protein produktion i tre primære grunde. Det første er der en mærkbar nedgang i omkostningerne som pattedyr-, insekt-og bakterielle bioreaktorer kræver betydelige startomkostninger, dyre vækstmedier og komplicerede processer til nedstrøms oprensning 4.. Oprettelsen af en stabil transgen plantelinjer giver dem også mulighed for at overhale skalerbarheden i andre ekspressionssystemer som protein udtrykker planter kunne dyrkes og høstes på en landbrugs-skala 5.. Andet plante-ekspressionssystemer reducere risikoen for overførsel af et menneske eller dyr patogen fra protein-udtrykkende vært til mennesker, viser overlegenhed i offentlig sikkerhed 6.. Endelig anlæg anvende en eukaryot endomembrane system, der svarer til pattedyrceller, der giver mulighed for korrekt posttranslationel modifikation af proteiner, herunder glycosylering og montering af flere underenhedsproteiner 7. Denne evne sætter plante-baserede systemer forud for dem, der bygger på prokaryote systemer, såsom bakterier, eftersom en bredere række af farmaceutiske rekombinante proteiner, herunder monoklonale antistoffer (mAb'er), har en mere kompliceret struktur og kræver omfattende posttranslationelle modifikationer eller montage 8..
Der er to store hensigtssmerter at udtrykke rekombinante proteiner i planter. Den første er udviklingen af en stabilt transgen linie, hvor DNA, der koder for målproteinet klones ind i en ekspressionskassette og introduceret til enten de nukleare eller chloroplast genomer. Herved bliver det fremmede DNA arvelige gennem efterfølgende generationer og giver mulighed for voldsomt forbedret skalerbarhed, langt ud over, at andre ekspressionssystemer 1.. Introduktion af eksogent DNA til kernegenomet opnås sædvanligvis ved Agrobacterium tumefaciens infektion af plantevæv eller, sjældnere, ved mikroprojektilbombardement af vævet 9. Plantehormoner anvendes derefter til at inducere differentiering og vækst af transgene plantevæv såsom rødder og blade. Transformation af kloroplast-genomet ikke kan opnås med A. tumefaciens, men beror udelukkende på guld eller tungsten partikler belagt med DNA fyret ballistisk i planteceller. Den anden metode til at udtrykke recombinant-protein i planter er gennem forbigående ekspression 10.. I dette scenario er virus-afledte vektorer huser genet af interesse leveret via A. tumefaciens til fuldt udviklede planter gennem en proces, der kaldes agroinfiltration. Stedet for at integrere i plantegenomet, vil den leverede genkonstruktion derefter begynde at lede forbigående produktion af det ønskede protein, der kan høstes og isoleres efter en kort inkubationstid. Forbigående genekspression tilbyder fordelen ved større samlet protein akkumulering samt en forbedret cirka proteinproduktion, som planter vil være klar til høst ca 1-2 uger efter agroinfiltration 11. Det er betydeligt hurtigere end de processer af produktion, udvælgelse, og bekræftelse af stabile transgene plante linjer, som kan tage flere måneder til et år. Dette er imidlertid også den begrænsning af forbigående ekspression systemet, da det ikke vil give genetisk stabil plante liian, der kan bruges til at generere en frøbank for omfattende kommerciel produktion. Alligevel har fremgangsmåder blevet udviklet til at forbedre stor skala transient ekspression. Her viser vi en metode generation af forbigående protein-udtrykkende Nicotiana benthamiana planter ved hjælp af dekonstruerede virale vektorer leveret af A. tumefaciens.
To store metoder er blevet udviklet til levering af A. tumefaciens til plantevæv: bænk skala infiltrering via sprøjte og omfattende infiltration via vakuumkammeret. Begge protokoller er beskrevet her med N. benthamiana, som er nært beslægtet med den fælles tobaksplanten, som værtsplanten til transient ekspression af to fluorescerende proteiner: det grønne fluorescerende protein (GFP) fra goplen Aequorea victoria og rødt fluorescerende protein fra Discosoma koral (DsRed) 12,13. N. benthamiana er den mest almindelige værtsplante forrekombinant protein, fordi det er muligt at foretage en genetisk transformation, kan give store mængder af biomasse hurtigt, og er en produktiv frøproducent for opskalering produktion 14.. En anden fordel ved at bruge N. benthamiana som værter for protein-ekspression er tilgængeligheden af en række ekspressionsvektorer 2,5. I denne undersøgelse, to deconstructed virusvektorer ene bygger på en tobak (TMV) RNA replicon-systemet (MagnICON vektorer) og den anden stammer fra bønne gul dværg virus (BeYDV) DNA replicon-systemet (geminiviral vektorer) 4,11, 15-18, anvendes til at udøve GFP og DsRed gen og levere dem i N. benthamiana celler via A. tumefaciens. Tre DNA-konstruktioner vil blive anvendt til GFP eller DsRed udtryk med MagnICON vektorer. De omfatter 5'modulet (pICH15879) indeholdende promotoren og andre genetiske elementer til at drive ekspressionen af målgenet, 3'modul indeholdende genet af interesse (Pich-GFP eller Pich-DsRed), og integrase modul (pICH14011) koder for et enzym, der integrerer 5'-og 3'-modulerne sammen efter ekspression 8,15. Tre DNA-konstruktioner er også behov for ekspression med geminiviral vektorer. Ud over vektorer indeholdende replikon af målgenet (pBYGFP eller pBYDsRed), en vektor der koder for replikation proteinet (pREP110) kræves til opformering af målet replikon 11,14,16. Desuden er inddragelsen af en vektor der koder for tavshed suppressor p19 fra tomat busket stunt virus ønsket for højt niveau målgenekspression 11,16.
Der er generelt tre vigtige skridt for indførelse af gener af rekombinante proteiner i planteceller ved agroinfiltration herunder plantevækst A. tumefaciens kultur forberedelse, og infiltration. Da hvert skridt er afgørende for den ultimative succes af denne procedure derfor en detaljeret beskrivelse for hver givesbåde sprøjten infiltration og vakuum infiltration nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Plant Growth
- Place 60 tørv pellets i en formering bakke. Tilføj 4 l ledningsvand og lad tørv pellets absorbere vand i 2 timer.
- Tilsæt 2 N. benthamiana frø i hvert tørv pellet ved hjælp af en såmaskine, dække bakken med en gennemsigtig plastik kuppel, og give dem mulighed for at spire i en 25 ° C, 84% luftfugtighed miljø med en 16/8 hr dag / nat cyklus (figur 1A).
- Fjern kuplen to uger efter såning, drænvand fra bakken, og tilsæt 2 liter Jacks gødning i en koncentration på 1,48 g / L (figur 1B). Fortsæt med at dyrke planter i et 25 ° C, 50% fugtighed med en 16/8 timers dag / nat cyklus. Levere 2 L af Jacks gødning hver 2 dage pr magasin.
- Ved uge 4, overfører planterne med tørv pellets til en ny bakke, der er vært seks anlæg for at give tilstrækkelig plads til yderligere vækst (figur 1C), indtil de er klar til at blive infiltreret i 6 ugers alderen (figur1D).
2.. A. tumefaciens Culture Forberedelse
2.1 Forberedelse til Syringe Infiltration
- Streak A. tumefaciens GV3101 stammer indeholdende de geminiviral vektorer p19, pREP110, pBYGFP og pBYDsRed på LB-agarplader indeholdende kanamycin (100 ug / ml). Streak én stamme pr plade og vokse ved 30 ° C i 48 timer.
- Tilsvarende streak og vokse GV3101 stammer huser MagnICON vektorer af 5'modulet (pICH15879), 3'modul indeholder målgenet af GFP eller DsRed (Pich-GFP eller Pich-DsRed) og integrase (pCH14011) på LB-agar plader indeholdende carbenicillin (100 ug / ml).
- Fra en enkelt koloni på LB agarplade, pode GV3101 stammer der indeholder geminiviral vektorer i 3 ml YENB medier (0,75% Bacto gærekstrakt, 0,8% næringsmedium, justere pH til 7,5 med NaOH) + kanamycin (100 ug / ml) i en 15 ml rundbundet kultur rør, vokser den flydende kultur ved 30 ° C ien shaker natten over med en 300 o rotationshastighed.
- Tilsvarende pode og dyrke GV3101 stammer der indeholder MagnICON vektorer i YENB medier + carbenicillin (100 ug / ml) i et rysteapparat natten over ved 30 ° C.
- Mål og optage OD600 værdier for hver flydende kultur med et spektrofotometer og bruge nedenstående formular til at beregne den nødvendige volumen (V sub) skal subkultiveres for en ny kultur med en start OD600 på 0,025 i 10 ml YENB medier med passende antibiotika .
V sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD600 - Overførsel V sub (ml) af den natten over kultur til (10 - V sub) ml YENB medier med passende antibiotika til hver stamme. Grow den nye kultur natten over ved 30 ° C i en shaker med en 250 rpm rotationshastighed indtil OD600 værdi er i intervallet 1,7-2,0.
- Måle og registrere OD 600 værdier for hver flydende kultur og bruge nedenstående formular til at calcUlate den nødvendige volumen (V inf) fortyndes i 50 ml infiltration puffer til opnåelse af en endelig OD600 på 0,12 for hver stamme.
V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD600 - Overførsel V inf (ml) af hver kultur til et mikrocentrifugerør og spin ned cellerne ved centrifugering ved 12.000 x g i 2 min, fjerne supernatanten og derefter resuspenderes cellerne i 10 ml infiltration buffer (10 mM MES, pH 5,5; 10 mM magnesiumsulfat 4) ved hvirvelbehandling kortvarigt.
- Bland resuspenderet celler af pBYGFP + pREP110 + p19, spinde cellerne ned ved 12.000 xg i 2 min, og resuspender i alt 50 ml infiltration buffer. Denne Agrobacteria kombination er geminiviral ekspression af GFP.
- Tilsvarende bland følgende kombinationer af agrobakterier celler, spin ned og resuspender dem i 50 ml infiltration buffer. De omfatter (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 til geminiviral ekspression af DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 til geminiviral co-ekspression af GFP og DsRed, (3) pREp110 + p19 som negativ kontrol af geminiviral udtryk, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 til MagnICON ekspression af GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 for MagnICON udtryk for DsRed og (6) pICH15879 + pCH14011 som negativ kontrol for MagnICON udtryk.
2.2 Forberedelse til Vacuum Infiltration
- Indpodes og kultur hver GV3101 stamme indeholdende geminiviral vektorer eller MagnICON vektorer i 15 ml YENB medier med passende antibiotika i en 50 ml autoklaveret kolbe og vokse natten over som beskrevet for sprøjte infiltration ovenfor.
- Mål og optage OD600 værdier for hver flydende kultur med et spektrofotometer og bruge nedenstående formular til at beregne den nødvendige volumen (V sub) skal subkultiveres for en ny kultur med en start OD600 på 0,025 i 250 ml YENB medier med passende antibiotika .
V sub OD600 - Overførsel V sub (ml) af den natten over kultur til (250 - V sub) ml YENB medier i en 1 L autoklaveret kolbe med passende antibiotika til hver stamme og dyrke den nye kultur natten over som beskrevet for sprøjte infiltration ovenfor.
- Måle og registrere OD600 værdier for hver flydende kultur og bruge formlen nedenfor for at beregne den nødvendige volumen (V inf) skal fortyndes i 3 l infiltration puffer til opnåelse af en endelig OD600 på 0,12 for hver stamme.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD600 - Pellet og resuspenderes V inf (ml) af hver kultur i infiltration buffer som beskrevet for sprøjte infiltration og bland resuspenderede kulturer henhold til kombinationerne beskrevet for sprøjte infiltration. Repellet de blandede Agrobakterier celler og resuspender dem i 3 L for infiltration buffer.
3.1 Sprøjte Infiltration
- Vælg fire 6-uger gamle N. benthamiana planter med 5 blade hver. De første tre blade regnet fra toppen af hvert enkelt anlæg vil blive infiltreret helt med en af de kombinationer af A. tumefaciens stammer i infiltration buffer. Den fjerde blad vil være spot-infiltreret med alle fire strain kombinationer for geminiviral udtryk eller alle tre kombinationer for MagnICON udtryk. Det sidste blad på hvert enkelt anlæg vil blive infiltreret med kombinationer af negative kontroller.
- Skabe et lille hak med en nål i overhuden på bagsiden af bladet (figur 2A). OBS: Sørg for ikke at ridse så hårdt som at gennembore bladet gennem begge sider, da Agrobacteria celler i infiltration blandingen vil passere gennem punkteringen til den anden side af bladet.
- Tag et fast greb af forsiden af bladet, og mens anvendelse blidmodtryk til den hak med tommelfingeren på den ene hånd, injicere Agrobacterium blandinger i infiltration buffer i nick med en sprøjte uden nål (figur 2B). Bemærk: Som Agrobacterium blandingen ind i intercellulære rum af bladet, vil det infiltrerede område vende synligt mørkere grøn (figur 2C).
- Fortsæt med at injicere Agrobacterium blandingsprodukter nick indtil mørkere grønne cirkel stopper for at ekspandere. Opret en anden nick og gentag trin 3.1.2-3.1.4 indtil hele bladet er infiltreret og hele bladet bliver mørkere grøn for de tre første blade og det sidste blad.
- For fjerde blad af hver plante vil alle fire (geminiviral vektor) eller tre (MagnICON vektor) kombinationer infiltreret i det. Lav en nick for hver kombination af Agrobacterium stammer og infiltrere hver nick med én kombination.
- Efter infiltration, flytte planter tilbage til væksten værelse og overvågtor proteinekspression mellem 2-15 dage efter infiltration (dpi).
3.2 Vacuum Infiltration
- Placer en balje i et vakuum og overførsel 3 L infiltration buffer indeholdende Agrobacterium stammer til karret. Slut ekssikkatoren til en Vacuubrand membran vakuumpumpe (figur 3A).
- Placer en plante hovedet på ekssikkatoren pladen (figur 3B) og sænke pladen med planten indtil hele blade og stængel systemet er neddykket i infiltration buffer med pladen hviler på toppen af karret. Placer ekssikkatoren O ring langs randen og sætte ekssikkatoren låg på kammeret (figur 3C).
- Tænd vakuumpumpen, og start timing, når vakuum når 100 mbar. Åbn langsomt release ventil på ekssikkatoren efter 1 min ved 100 mbar til at tillade indgangen Agrobacteria ind i de interstitielle rum af neddykket plantevæv. Gentag dette trin et additiOnal tid til at sikre god infiltration.
- Efter infiltration, tage planten ud af ekssikkatoren og sætte den tilbage til sin opretstående stilling. Flyt planterne tilbage til væksten værelse og overvåge protein udtryk mellem 2-15 dpi.
4.. Fluorescent Protein Detection og Fotografi
- Startende fra 2. dpi, flytte planter ind mørkt rum og glans UV-lys på bagsiden af infiltrerede blade med en håndholdt UV-lampe.
- Observere grøn fluorescens af GFP eller den røde fluorescens af DsRed. GFP giver off en stærkere signal med langbølget UV-lys, mens DsRed er stærkere under kortbølget UV-lys.
- Tag fotografier af fluorescerende blade med en regelmæssig digitalt kamera uden flash.
- Flyt planterne tilbage til væksten rum efter observation eller fotografering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Ekspression af fluorescerende proteiner ved sprøjte Infiltration
For at demonstrere effektiviteten af sprøjten infiltration af Agrobacterium i plantevæv, testede vi udtryk for to fluorescerende proteiner - GFP og DsRed - af to forskellige dekonstruerede plante virale vektorer - geminiviral og MagnICON - i N. benthamiana. For N. benthamiana blade, der var fuldstændig infiltreret med Agrobakterier holdige geminiviral vektorer blev GFP udtryk observeret over hele bladareal i UV-lys startende fra så tidligt som 2 dpi og toppede ophobning ved 4 dpi (figur 4C). Denne tidlige GFP udtryk ved geminiviral vektor er i overensstemmelse med tidligere resultater af andre rekombinante proteiner 14,16,18,19. I modsætning infiltreret blade med MagnICON vektor indeholdende Agrobacterium kombinationer viste GFP-fluorescens efter 5. dpi og nåede sit maksimum accumulatipå ved 7 dpi (figur 4D). Ingen grøn fluorescens blev observeret fra blade infiltreret med negativ kontrol Agrobacterium blandinger af pREP110 + p19 (figur 4B) eller pICH15879 + pCH14011 (data ikke vist), hvilket indikerer, at fluorescens var specifik for GFP-genet og ikke var et resultat af baggrundsfluorescens fra bladene. På sit højdepunkt akkumulation, er fluorescensen af MagnICON vector-udtrykte GFP mere intens end geminiviral vektor (figur 4C og 4D), svarende til tidligere resultater fra forsøg for andre rekombinante proteiner 8,18. Den tidsmæssige ekspressionsmønster og den relative fluorescensintensitet af DsRed ligner dem af GFP (data ikke vist). Ingen større nekrose observeredes på blade infiltreret med GFP konstruktioner (figur 4A). Lignende resultater blev også observeret for DsRed-udtrykkende planter, hvilket indikerer at hverken fluorescerende protein er meget giftigt for plante ceLLS. Blev imidlertid lokal nekrose på nick stedet observeret, og de optrådte som "huller" i fotografierne (figur 4). Når begge fluorescerende proteiner blev udtrykt på samme blad via geminiviral vektorer med sprøjte spot-infiltration, blev de påvist med deres forventede fluorescerende farve på det sted hvor de blev infiltreret (figur 5). Interessant, co-infiltration af GFP og DsRed resulterede i gullig fluorescens (figur 5). Intensiteten af DsRed fluorescens syntes at være svagere end GFP på samme blad. Dette kan dog ikke afspejle den svagere ekspression af DsRed, men snarere skyldtes den mindre end optimal excitation af DsRed med UV-lys. Samlet set vores resultater viser, at sprøjte infiltration effektivt introducerer rekombinant gen-bærende Agrobakterier i planteblade og resulterede i robust ekspression af vores målproteiner. Derudover demonstrerede vi, at denne metode giver fleksibilitettet til enten infiltrere hele blade for maksimal akkumulering af et mål protein eller at spotte-infiltrere flere protein-targets med flere vektorer til at sammenligne deres udtryk og udtryk mønster.
2.. Ekspression af fluorescerende proteiner ved vakuum Infiltration
Vakuum infiltration blev også undersøgt for at udvikle en skalerbar agroinfiltration metode, der kan anvendes til storskala produktion af rekombinante proteiner af plantesygdomme transiente ekspressionssystemer. Vores resultater indikerer, at den temporale ekspressionsmønster af GFP eller DsRed af geminiviral og MagnICON vektorer ikke er ændret ved ændring af infiltration metode og forblev ligner sprøjte infiltration. Som hele skyde af en plante er neddykket i infiltrationen blandingen under vakuum infiltration blev fluorescens observeret for GFP (figur 6) for alle bladene af infiltrerede planter. Sammenlignet med sprøjte infiltration, er det mere robust og kan achieve infiltration af hver plante med en meget kortere tidsramme. For eksempel tager det en dygtig elev 15 min til sprøjten-infiltrere en hel 6-uger gamle N. benthamiana plante. I modsætning hertil kan den samme plante infiltreres i 3 min ved vakuum fra start til slut og flere planter kan infiltreret på samme tid.
Figur 1. N. benthamiana plantevækst med tørv pellets og vækst bakker. Wild-type planter på 0 (A), 2 (B), 4 (C) og 6 (D) uger efter såning.
Figur 2. Sprøjte infiltration af N. benthamiana blademed Agrobacterium tumefaciens. Stamme GV3101 A. tumefaciens huser GFP-udtrykkende MagnICON vektorer blev resuspenderet i infiltration puffer og anbragt i en sprøjte uden nål. En nick blev skabt med en nål på bagsiden af en 6-uger gamle planter blad (A). Åbningen af sprøjten var anbragt mod nick (B) og Agrobakterier i infiltration buffer blev injiceret i intercellulære rum af bladet via nick (C).
Figur 3. Vakuum infiltration af N. benthamiana blade med Agrobacterium tumefaciens. Stamme GV3101 A. tumefaciens indeholdende target-protein-udtrykkende vektorer blev resuspenderet i infiltration puffer og fyldt i en 3 L badekar. Karret blev derefter anbragt i et vakuum, der var forbundet til en vakuumpumpe (A). En 6-uger gamle fabrik blev anbragt med oversiden nedad på ekssikkatoren pladen (B). Hele blade og stængel system blev derefter neddykket i karret som pladen blev anbragt oven på kammeret (C). Agroinfiltration blev opnået ved at anvende og frigive et vakuum ved 100 mbar to gange i 1 min. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Ekspression af GFP i sprøjten agroinfiltrated blade. Hele N. benthamiana blade blev infiltreret med stamme GV3101 A. tumefaciens huser GFP-genet i en geminiviral (A og C) eller MagnICON vecteller (D). Negativ kontrol blade blev infiltreret med Agrobakterier stammer, der ikke indeholder, at GFP-genet (B). Blade blev fotograferet under hvidt lys (A) eller UV-lys (BD) ved 4 dpi (AC) eller 7 dpi (D).
Figur 5. Ekspression af GFP og DsRed i sprøjten spot-agroinfiltrated blade. N. benthamiana bladene var spot-infiltreret med GV3101 huser GFP, DsRed eller begge GFP og DsRed gener i geminiviral vektorer. En negativ kontrol spot blev infiltreret med pREP110 + p19. Blade blev fotograferet under UV-lys ved 4 dpi.
Figur 6.. Ekspression af GFP i vakuum agroinfiltreret blade. N. benthamiana blade blev infiltreret med GV3101 huser GFP-genet i MagnICON vektorer. Blade blev fotograferet under UV-lys ved 7 dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De stigende krav til proteinbaserede lægemidler på verdensplan kræver nye produktionsplatforme, der er robuste, skalerbar, billige og sikker. Planter har vist sig at være en af de mest lovende alternative produktionssystemer til farmaceutisk proteinproduktion. I de senere år har udviklingen af deconstructed virus-baserede vektorer aktiveret forbigående ekspression af proteiner i planter, hvilket i høj grad øger hastigheden og udbyttet af plante ekspressionssystemer 2,10. For yderligere at optimere anvendeligheden af den forbigående ekspression system vi vise en enkel men effektiv og skalerbar fremgangsmåde til at indføre mål-gen indeholdende Agrobacterium i plantevæv. Vores resultater viser, at agroinfiltration med hverken sprøjte eller vakuum metode har resulteret i en effektiv indførelse af Agrobacterium ind i blade og robust produktion af to fluorescerende proteiner, GFP og DsRed.
At sikre efficient agroinfiltration og protein produktion, skal følgende kritiske parametre kontrolleres omhyggeligt. Afvigelser fra disse parametre kan resultere i lav agroinfiltration effektivitet og til gengæld lav målprotein ekspression.
1.. Plant udviklingsstadiet og sundhed. Den mest sandsynlige variabel i denne metode mellem laboratorier er plantematerialet for infiltration. Mens planter kan forekomme fænotypisk ens, deres udviklingsstadium og fysiologiske tilstand påvirke deres kompetence i at udtrykke rekombinante proteiner betydeligt. Specifikke parametre, som har indvirkning på plantevækst og protein udtryk niveauer omfatter temperatur, luftfugtighed, lysintensitet, levering af gødning, plante-podning alder og tid, der kræves for den maksimale akkumulering af target protein efter blad infiltration. Anlæg skal konsekvent have lige store mængder af vand og gødning dagligt. Mindre ændringer i anlægget vækstbetingelser kan drastisk ændre det sidste size af planter og deres evne til at udtrykke rekombinante proteiner. Vores tidligere undersøgelser viser, at planter dyrket under naturlige lys gav mere blad biomasse, men proteinudbytte er langt mindre end det, dyrket under kunstigt lys 4.. Derfor bruger kunstigt lys er den foretrukne metode for planternes vækst. Vores resultater viser også, at en 16 timers lys / 8 timers mørke-cyklus ved 25 ± 0,5 ° C er den optimale betingelse at vokse N. benthamiana anlæg under sådanne kunstig belysning 4.. Vi viste, at under disse betingelser, 6-ugers planter er den optimale alder for GFP og DsRed udtryk som de producerer høj niveauer af fluorescerende proteiner, mens biomasseudbyttet er tilstrækkelig. Planter ældre end 6 uger producere mere biomasse, men er for høje til at passe ind i infiltration kammeret 4.. Desuden begynder blomsterne at udvikle sig efter 6 ugers vækst, negativt påvirker rekombinant protein udtryk 4.. Følgelig 6-ugers planter indeholder den optimale leaf materiale, der balancerer den kombinerede behov for biomasseudbytte, protein ophobning, og den nemme agroinfiltration.
2.. Vækst og infiltration koncentration af Agrobacterium. Et andet centralt punkt i denne metode er kontrol af vækst og infiltration koncentrationen af A. tumefaciens, som målt ved OD600. I hver kultur og subkultur skridt, stammer af A. tumefaciens skal dyrkes til, men ikke over den tilhørende OD600. Vi har undersøgt flere koncentrationer af A. tumefaciens til den endelige infiltration af N. benthamiana blade 4.. Lav Agrobacterium koncentration vil resultere i utilstrækkelig levering af målgener i planter, hvilket fører til lav proteinekspression. På den anden side, hvis infiltrationen koncentrationen af Agrobacterium er for høj, vil det udløse en allergisk reaktion i de infiltrerede væv og føre til nekrose 20. Vores rESULTATER viste, at OD 600 = 0,12 Agrobacterium-stamme afbalancerer behovet for maksimal levering af genkonstruktionen uden at forårsage vævsnekrose og celledød. Den ønskede OD600 tæthed af Agrobacterium kan opnås ved anvendelse af ensartede dyrkningsmedier, temperatur og kultur tid.
3.. Til vakuum infiltration, er det vigtigt at følge den udpegede vakuumtrykket og infiltration varighed. Vores resultater viser, at et 3 L balje med Agrobacterium infiltration blanding kan anvendes til at infiltrere cirka 30 planter. Hvis mere end 30 planter har brug for at blive infiltreret, et nyt parti af Agrobacterium infiltration blanding skal leveres.
4.. De specifikke parametre præsenteres i dette papir er optimeret til ekspression af proteiner ved hjælp af N. benthamiana planter dyrket under særlige forhold er beskrevet ovenfor med dekonstruerede virus-baserede vektorer. Som diskuteret tidligere, than sværeste parameter at styre i denne metode er plantematerialet. Vi har udtrykt en række vacciner og terapeutiske proteiner ved hjælp planter og infiltration procedure, vi beskrevet her, og opnåede fremragende resultater i alle tilfælde 4,8,14,18,21-23. Disse resultater viste, at de betingelser, vi har udviklet, er optimale for proteinekspression. Men hvis de forskellige vært plantearter, ekspressionsvektorer eller anderledes N. Benthamiana vækstbetingelser blev brugt til infiltration, ville hver parameter i denne metode skal være re-optimeres ved eksperimenter.
Generelt har vi vist, at agroinfiltration med sprøjte og vakuum er en enkel, men effektiv metode til at indføre målgen transporterer Agrobacterium i planter til transient ekspression af rekombinante proteiner. Begge metoder har deres unikke fordele afhængigt mål for forskning og produktion. Sprøjte infiltration er enkel, der kræveres kun små mængder af Agrobacterium kultur og behøver ikke dyre pumper og vakuumkamre. Som påvist i denne rapport, har den fleksibilitet til enten infiltrere hele blade med ét mål gen eller bruge spot infiltration at indføre gener af flere mål på én blad. Hele blade infiltration metode kan bruges til små laboratorieskala ekspression af rekombinant protein til deres biokemiske karakterisering, oprensning og prækliniske funktionelle undersøgelser 1.. I modsætning hertil kan spot infiltration bruges til at udtrykke flere protein-targets på et blad til at sammenligne deres udbytte, udtryk kinetik og toksicitet planter. Det kan også anvendes til at sammenligne ekspressionen af et reporter protein, såsom GFP eller DsRed drevet af forskellige ekspressionsvektorer på samme blad. Som et resultat, kan forskellige vektor evne i kørsel protein ophobning og deres ekspression kinetik skal karakteriseres. Enkeltheden i sprøjten infiltration gør det også muligt engennemførlig værktøj til at undervise og træne high school og bachelor studerende i emnet bioteknologi og genteknologi.
I sammenligning med sprøjte infiltration kræver vakuum infiltration investering af vakuumpumper og kamre og større mængder af Agrobacterium kulturer. Det er derfor ikke den foretrukne metode, når blot et par planter skal infiltreres. Men det giver skalerbarhed, der ikke kan matches af sprøjte infiltration. Det er mere robust og kan infiltrere et stort antal planter i en kort periode. Med skalaen præsenteres i denne rapport, er vi i stand til at producere gram niveau af renset farmaceutiske proteiner tilstrækkeligt til en fase I humane kliniske forsøg 4.. Endvidere kan denne proces yderligere opskaleres til kommerciel fremstilling af farmaceutiske proteiner fra planter. For eksempel er processerne bliver designet til at støvsuge infiltrere tre tons N. benthamiana planter timeni en opskalering operation 24.. En anden fordel ved vakuum infiltration er, at det kan bruges til at agroinfiltrate plantearter, der ikke er modtagelig for injektionssprøjte infiltration.
Sammenfattet indeholder kombinationen af sprøjten og vakuum infiltration forskere, bioteknologer og pædagoger en enkel, effektiv, robust og skalerbar metode til transient ekspression af rekombinante proteiner i planter. Det vil i høj grad lette udvikling og produktion af farmaceutiske proteiner og fremme videnskabelig uddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker R. Solen og andre studerende i Chens Laboratorium for deres bidrag til plantemateriale generation. Vi takker også Dr. D. Green for hans støtte til bachelor forskning i kollegiet for Teknologi og Innovation (CTI). Denne forskning blev støttet delvist af NIH tilskud U01 AI075549 og 1R21AI101329 til Q. Chen og en SSE bevilling fra CTI of Arizona State University til Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado og J. Stahnke er studerende understøttes af SSE tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
