Summary
Växter har ett nytt system för produktion av farmaceutiska proteiner i kommersiell skala som är mer skalbar, kostnadseffektiv och säker än nuvarande uttryck paradigm. I denna studie, rapporterar vi ett enkelt och bekvämt, men ändå skalbar metod för att införa mål-genen innehåller
Abstract
Däggdjurscellkultur är den viktigaste plattformen för kommersiell produktion av humana vacciner och terapeutiska proteiner. Däremot kan inte möta den ökande globala efterfrågan på läkemedel på grund av sin begränsade skalbarhet och höga kostnader. Växter har visat sig vara en av de mest lovande alternativa läkemedel produktionsplattformar som är robusta, skalbara, billig och säker. Den senaste utvecklingen av virus-baserade vektorer har möjliggjort snabb och hög nivå transient expression av rekombinanta proteiner i växter. För att ytterligare optimera användbarheten av transienta expressionssystem, visar vi en enkel, effektiv och skalbar metod för att införa mål-gen som innehåller Agrobacterium i växtvävnad i denna studie. Våra resultat tyder på att agroinfiltration med både spruta och vakuum metoder har resulterat i en effektiv introduktion av Agrobacterium i blad och robust produktion av två fluorescerande proteiner, GFP och DsRed. Vidarevi visar de unika fördelar som erbjuds av båda metoderna. Spruta infiltration är enkel och behöver inte dyr utrustning. Det ger också möjlighet att antingen infiltrera hela ledigheten med ett mål gen, eller att införa gener i flera mål på ett blad. Således, kan den användas för laboratorieskala uttryck av rekombinanta proteiner samt för att jämföra olika proteiner eller vektorer för avkastning eller uttryck kinetik. Enkelheten i sprutan infiltration antyder också dess användbarhet i high school och college utbildning för ämnet bioteknik. I motsats härtill är vakuuminfiltrering mer robust och kan skalas upp för kommersiell framställning av farmaceutiska proteiner. Det ger också fördelen av att kunna agroinfiltrate växtarter som inte är mottaglig för spruta infiltration såsom sallat och Arabidopsis. Sammantaget ger kombinationen av sprutan och vakuum agroinfiltration forskare och lärare en enkel, effektiv och robustmetodik för övergående proteinuttryck. Det kommer att underlätta utvecklingen av farmaceutiska proteiner och främja naturvetenskaplig utbildning.
Introduction
Sedan 1970-talet har växter undersökts som alternativ till däggdjurs-, insekt, och bakteriella cellkulturer för kommersiell produktion av rekombinanta proteiner och terapi protein 1. Växt-baserade system för uttryck av biologiska läkemedel har visat lovande resultat i de senaste åren som flera nya behandlingar för sjukdomar, som Gauchers sjukdom 2, och aviär H5N1 influensa 3, har visat framgång i kliniska prövningar. Utvecklingen av behöriga mekanismer för rekombinant proteinuttryck i växter i årtionden eftersom dessa initiala experiment har skapat förutsättningar för växt-baserade system för att förändra den nuvarande paradigm av protein produktion av tre huvudsakliga skäl. För det första finns det en märkbar minskning av kostnaderna som däggdjur, insekter och bakterier bioreaktorer kräva betydande startkostnader, dyra odlingssubstrat, och komplicerade processer för nedströms rening 4. Skapandet av en stabil transgen växtlinjer ger också dem att växa snabbare än skalbarhet av andra expressionssystem som protein uttryckande växter kan odlas och skördas på en jordbruks-skala 5. Andra växt-baserade expressionssystem avsevärt minska risken för överföring av en människa eller ett djur patogen från protein-uttryckande värden till människor, visar överlägsenhet i allmän säkerhet 6. Slutligen kraftverk utnyttja en eukaryot endomembrane system som liknar däggdjursceller, vilket möjliggör riktig post-translationell modifiering av proteiner inkluderande glykosylering och sammansättning av multipel-subenhetsproteinema 7. Denna förmåga sätter växt-baserade system framåt av de baserade på prokaryota system, såsom bakterier, eftersom ett större antal av farmaceutiska rekombinanta proteiner, inklusive monoklonala antikroppar (mAb), har en mer komplicerad struktur och kräver omfattande posttranslationella modifieringar eller montering 8.
Det finns två stora lämpligavärk till att uttrycka rekombinanta proteiner i växter. Det första är utvecklingen av en stabilt transgen linje, där DNA som kodar för målproteinet klonas in i en expressionskassett och introducerade till antingen nukleära eller kloroplast genom. På så sätt blir det främmande DNA ärftliga genom efterföljande generationer och möjliggör enormt förbättrad skalbarhet, långt bortom den av andra expressionssystem 1. Införande av exogent DNA till det nukleära genomet uppnås vanligen genom Agrobacterium tumefaciens infektion i växtvävnad eller, mindre ofta, genom mikroprojektilbombardemang av vävnaden 9. Växthormoner används sedan för att inducera differentiering och tillväxt av transgen växtvävnad såsom rötter och blad. Transformation av kloroplasten genomet kan inte uppnås med A. tumefaciens, utan förlitar sig helt på guld eller volfram partiklar belagda med DNA sköt ballistiskt i växtceller. Den andra metoden att uttrycka rekombinationnt protein i växter är genom övergående uttryck 10. I detta scenario, är virus-härledda vektorer härbärgerar genen av intresse levereras via A. tumefaciens till fullt utvecklade växter genom en process som kallas agroinfiltration. I stället för att integrera i växtgenomet, kommer den levererade genkonstruktionen börjar sedan att styra transitorisk produktion av det önskade proteinet, som kan skördas och isoleras efter en kort inkubationstid. Transient genuttryck erbjuder fördelen med större övergripande proteinackumulering liksom en förbättrad tid för proteinproduktion, som växter kommer att vara redo att skörda cirka 1-2 veckor efter agroinfiltration 11. Detta är betydligt snabbare än de processer av produktion, urval och bekräftelse av stabila transgena växter linjer, vilket kan ta flera månader till ett år. Detta är dock också en begränsning av övergående uttryck systemet, eftersom det inte kommer att ge genetiskt stabil växt liian som kan användas för att generera en fröbank för storskalig kommersiell produktion. Trots detta, har metoder utvecklats för att förbättra storskalig transient uttryck. Här visar vi en metod för generering av övergående protein-uttryckande Nicotiana benthamiana anläggningar som använder deconstructed virala vektorer levereras av A. tumefaciens.
Två stora metoder utvecklas för leverans av A. tumefaciens i växtvävnad: bänkskala infiltration via spruta och storskalig infiltration via vakuumkammare. Båda protokollen beskrivs här med N. benthamiana, som är nära besläktad med den gemensamma tobaksplantan, som värdväxt för övergående uttryck av två fluorescerande proteiner: det grönt fluorescerande protein (GFP) från maneten Aequorea victoria och röda fluorescerande proteinet från Discosoma korall (DsRed) 12,13. N. benthamiana är den vanligaste värdväxt förrekombinant protein eftersom det är mottaglig för genetisk transformation, kan ge stora mängder biomassa snabbt, och är en flitig frötillverkaren för skala upp produktionen 14. En annan fördel med att använda N. benthamiana som värdar för proteinuttryck är att det finns en mängd expressionsvektorer 2,5. I denna studie två deconstructed virala vektorer, en baserad på en tobakmosaikvirus (TMV)-RNA-replikon-systemet (MagnICON vektorerna) och det andra härrör från böna gul dvärg virus (BeYDV) DNA replikon-systemet (geminiviral vektorer) 4,11, 15-18, används för att bära GFP och DsRed genen och giva dem i N. benthamiana celler via A. tumefaciens. tre DNA-konstruktioner kommer att användas för GFP eller DsRed uttryck med MagnICON vektorer. De inkluderar 5'modulen (pICH15879) innehållande promotorn och andra genetiska element för att driva uttrycket av målgenen, 3'-modul som innehåller genen av intresse (PICH-GFP eller PICH-DsRed) och integras modulen (pICH14011) som kodar för ett enzym som integrerar 5 'och 3' moduler tillsammans vid uttryck 8,15. Tre DNA-konstruktioner behövs också för uttryck med geminiviral vektorer. Förutom vektorer innehållande replikonet av målgenen (pBYGFP eller pBYDsRed), en vektor som kodar för replikering protein (pREP110) som krävs för amplifiering av mål replikon 11,14,16. Dessutom är införandet av en vektor som kodar för den tysta suppressor p19 från tomat buskig stunt virus önskas för hög nivå målgenuttryck 11,16.
Det finns i allmänhet tre viktiga steg för införandet av gener av rekombinanta proteiner i växtceller genom agroinfiltration inklusive växttillväxt, A. tumefaciens kultur förberedelse, och infiltration. Eftersom varje steg är avgörande för den slutliga framgången av detta förfarande, alltså, en detaljerad beskrivning för varje tillhandahållsför både spruta infiltration och vakuuminfiltrering nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Plant Growth
- Placera 60 torv pellets i en förökning fack. Lägg 4 L av kranvatten och låt torvpellets absorbera vatten under 2 timmar.
- Tillsätt 2 N. benthamiana frön i varje torv pellets med en seeder, täcka brickan med en transparent plast kupol, och låta dem gro i ett 25 ° C, 84% luftfuktighet med en 16/8 tim dag / natt cykel (Figur 1A).
- Ta kupolen två veckor efter sådd, dränera vatten från magasinet, och tillsätt 2 liter Jack gödselmedel vid en koncentration av 1,48 g / L (Figur 1B). Fortsätt att odla växter i en 25 ° C, 50% luftfuktighet miljö med en 16/8 h dag / natt cykel. Supply 2 L av Jacks gödsel varje 2 dagar per bricka.
- Vid vecka 4, överföra växter med torv pellets till ett nytt magasin som är värd sex fabriker för att ge tillräckligt utrymme för ytterligare tillväxt (Figur 1C) tills de är redo att infiltreras vid 6 veckors ålder (Figur1D).
2. A. tumefaciens Kultur Förberedelse
2.1 Förberedelse för spruta Infiltration
- Streak A. tumefaciens GV3101-stammar innehållande de geminiviral vektorerna P19, pREP110, pBYGFP och pBYDsRed på LB-agarplattor innehållande kanamycin (100 pg / ml). Streak en stam per platta och växa vid 30 ° C under 48 timmar.
- Likaså strimma och växa GV3101 stammar som bär de MagnICON vektorerna enligt 5 'modulen (pICH15879), 3'-modul som innehåller målgenen av GFP eller DsRed (PICH-GFP eller PICH-DsRed) och Integrashämmare (pCH14011) på LB Agar plattor innehållande karbenicillin (100 | ig / ml).
- Från en enda koloni på LB-agarplatta, inokulera GV3101 stammar som bär geminiviral vektorer in i 3 ml YENB medium (0,75% Bacto jästextrakt, 0,8% näringsbuljong, justera pH till 7,5 med NaOH) + kanamycin (100 | ig / ml) i en 15 ml rundbottnad odlingsrör, växa den flytande kulturen vid 30 ° C ien shaker över natten med en 300 rpm rotationshastighet.
- Likaså ympa och växa GV3101 stammar som bär MagnICON vektorer i YENB media + karbenicillin (100 mikrogram / ml) i en shaker natten vid 30 ° C.
- Mät och notera OD 600 värden för varje flytande kultur med en spektrofotometer och använd formeln nedan för att beräkna den nödvändiga volymen (V sub) att renodlas till en ny kultur med en start OD 600 av 0,025 i 10 ml YENB medium med lämpliga antibiotika .
V-sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Transfer V sub (ml) av den över natten odlade kulturen till (10 - V-sub) ml YENB medium med lämpliga antibiotika för varje stam. Odla den nya kulturen över natten vid 30 ° C i en skakapparat med 250 rpm rotationshastighet tills OD 600 värdet ligger inom intervallet 1,7 till 2,0.
- Mäta och registrera OD 600 värden för varje flytande kultur och använd formeln nedan för att calcUlate den nödvändiga volymen (V inf) som ska spädas i 50 ml infiltration buffert för att ge ett slutligt OD 600 av 0,12 för varje stam.
V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Transfer V inf (ml) av varje kultur till ett mikrocentrifugrör och centrifugera ner cellerna genom centrifugering vid 12.000 x g under 2 min, avlägsna supernatanten och sedan återsuspendera cellerna i 10 ml infiltration buffert (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO 4) genom att vortexa kort stund.
- Blanda suspenderades celler av pBYGFP + pREP110 + P19, snurra celler nedåt vid 12.000 xg under 2 minuter, och återsuspendera i totalt 50 ml av infiltration buffert. Denna Agrobacteria kombination är för geminiviral uttryck av GFP.
- Likaså, blanda följande kombinationer av Agrobacteria celler, spinn ner och återsuspendera dem i 50 ml av infiltration buffert. De innefattar (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 för geminiviral uttryck av DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 för geminiviral samuttryck av GFP och DsRed, (3) pREp110 + p19 som negativ kontroll av geminiviral uttryck, (4) PICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 för MagnICON uttryck av GFP, (5) PICH-DsRed + pICH15879 + pCH14011 för MagnICON uttryck av DsRed, och (6) pICH15879 + pCH14011 som negativ kontroll för MagnICON uttryck.
2.2 Förberedelse för vakuuminfiltrering
- Inokulera och kultur varje GV3101 stam innehållande geminiviral vektorer eller vektorer MagnICON i 15 ml YENB medium med lämpliga antibiotika i en 50 ml autoklaverad kolv och växa över natten såsom beskrivits för spruta infiltration ovan.
- Mät och notera OD 600 värden för varje flytande kultur med en spektrofotometer och använd formeln nedan för att beräkna den nödvändiga volymen (V sub) att renodlas till en ny kultur med en start OD 600 av 0,025 i 250 ml YENB medium med lämpliga antibiotika .
V-sub 600 - Transfer V sub (ml) av natten kultur (250 - V sub) ml YENB media i en 1 L autoklaveras kolv med lämpliga antibiotika för varje stam och växer den nya kulturen natten som beskrivs för spruta infiltration ovan.
- Mät och registrera OD 600 värden för varje flytande kultur och använder formeln nedan för att beräkna den nödvändiga volymen (V inf) för att spädas ut i 3 L av infiltration buffert för att ge ett slutligt OD 600 av 0,12 för varje stam.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 - Pellet och återsuspendera V inf (ml) av varje odling i infiltration buffert såsom beskrivits för spruta infiltration och blanda de återsuspenderade kulturerna enligt de kombinationer som beskrivs för spruta infiltration. Repellet de blandade Agrobacteria cellerna och återsuspendera dem i 3 L av infiltration buffert.
3,1 Spruta Infiltration
- Välj fyra 6-veckor gamla N. benthamiana växter med 5 blad vardera. De första tre blad räknat från toppen av varje anläggning kommer att infiltreras helt med en av kombinationerna av A. tumefaciens stammar i infiltration buffert. Den fjärde bladet blir spot-infiltrerade med alla fyra stam kombinationer för geminiviral uttryck eller alla tre kombinationer för MagnICON uttryck. Den sista bladet på varje anläggning kommer att infiltreras med kombinationer av negativa kontroller.
- Skapa en liten nick med en nål i epidermis på baksidan av bladet (Figur 2A). OBS: se till att inte repa så hårt som att genomborra bläddra båda sidor, som Agrobacteria celler i infiltration blandningen passerar genom punktionen till andra sidan av bladet.
- Ta ett fast tag i den främre sidan av bladet och samtidigt tillämpa skonsammottryck till nick med tummen av en hand, injicera de Agrobacterium blandningar i infiltration buffert in i nick med en spruta utan nål (Figur 2B). Obs: När Agrobacterium blandningen kommer in i intercellulära utrymmet av bladet, kommer den infiltrerade området vänder synbart mörkare grönt (figur 2C).
- Fortsätt att injicera Agrobacterium blandningarna i nick tills mörkare gröna cirkeln slutar att expandera. Skapa ett annat nick och upprepa steg 3.1.2-3.1.4 tills hela bladet infiltreras och hela bladet vänder mörkare grön för de första tre blad och sista blad.
- För det fjärde bladet på varje planta, kommer alla fyra (geminiviral vektor) eller tre (MagnICON vector) kombinationer infiltreras i det. Gör en nick för varje kombination av Agrobacterium-stammar, och infiltrera varje nick med en kombination.
- Efter infiltration, flytta växter tillbaka till tillväxt rummet och övervakningTor proteinuttryck mellan 2-15 dagar efter infiltration (dpi).
3.2 vakuuminfiltrering
- Placera ett badkar i en vakuum-exsickator och överföring 3 L infiltration buffert innehållande Agrobacterium stammarna till badkaret. Anslut exsickator till en Vacuubrand membran vakuumpump (Figur 3A).
- Placera en växt upp och ned på exsickatorn plattan (figur 3B) och sänka plattan med växten tills hela blad och stam systemet är nedsänkt i infiltration buffert med plattan vilar ovanpå av badkaret. Placera exsickatorn O-ringen längs kanten och sätta exsickatorn locket på kammaren (fig 3C).
- Slå på vakuumpumpen och starta tidtagningen när vakuumet når 100 mbar. Öppna långsamt utlösningsventil på exsickator efter 1 min vid 100 mbar att tillåta ingången Agrobacteria in mellanrumsutrymmena för nedsänkt växtvävnad. Upprepa detta steg ett additiOnal tid för att säkerställa god infiltration.
- Efter infiltration, ta anläggningen ur exsickator och lägg tillbaka till upprätt läge. Flytta växter tillbaka till tillväxt rummet och övervaka proteinuttryck mellan 2-15 dpi.
4. Fluorescent Protein Detection och fotografier
- Utgående från 2 dpi, flytta växter i mörkt rum och lysa UV-ljus på baksidan av infiltrerade blad med en handhållen UV-lampa.
- Följ den gröna fluorescens av GFP eller röd fluorescens av DsRed. GFP avger en starkare signal med långvågigt UV-ljus, medan DsRed är starkare i kortvåg UV-ljus.
- Ta fotografier av fluorescerande blad med en vanlig digitalkamera utan blixt.
- Flytta växter tillbaka till tillväxt rummet efter observation eller fotografering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett. Uttryck av fluorescerande proteiner med spruta Infiltration
För att visa effektiviteten hos sprutans infiltration av Agrobacterium i växtvävnad, testade vi uttrycket av två fluorescerande proteiner - GFP och DsRed - av två olika deconstructed växt virala vektorer - geminiviral och MagnICON - in N. benthamiana. För N. benthamiana blad som var helt infiltrerats med Agrobacteria innehållande geminiviral vektorer, var GFP uttryck observerades över hela bladet ytan under UV-ljus från så tidigt som 2 dpi och nådde toppen ackumulering vid 4 dpi (Figur 4C). Denna tidiga GFP expression genom geminiviral vektor är överensstämmande med tidigare resultat av andra rekombinanta proteiner 14,16,18,19. Däremot lämnar infiltreras med MagnICON vektor-innehållande Agrobacterium kombinationer visade GFP fluorescens endast efter 5 dpi och nådde sin högsta accumulatipå vid 7 dpi (Figur 4D). Inget grönt fluorescens observerades från blad infiltrerade med en negativ kontrollgrupp Agrobacterium blandningar av pREP110 + p19 (Figur 4B) eller pICH15879 + pCH14011 (data ej visade), vilket indikerar att fluorescensen var specifik för GFP-genen och inte var resultatet av bakgrundsfluorescens från bladen. Vid sin höjdpunkt ackumulation, är fluorescens MagnICON vector-uttryckt GFP intensivare än geminiviral vektor (figur 4C och 4D), liknande resultat som tidigare erhållits för andra rekombinanta proteiner 8,18. Den temporala expressionsmönster och den relativa fluorescensintensiteten hos DsRed är liknande den i GFP (data ej visade). Ingen större nekros observerades på bladen infiltreras med GFP-konstruktioner (figur 4A). Liknande resultat observerades även för DsRed-uttryckande växter, vilket indikerar att varken fluorescerande protein är mycket giftiga för växter ceLLS. Dock var lokal nekros vid hacket platsen observeras och de verkade som "hål" i fotografierna (Figur 4). När båda fluorescerande proteiner uttrycktes på samma blad via geminiviral vektorer med spruta spot-infiltration, de upptäcktes med den förväntade fluorescerande färg på den plats där de infiltrerade (Figur 5). Intressant nog co-infiltration av GFP och DsRed resulterade i gulaktig fluorescens (figur 5). Intensiteten av DsRed fluorescens tycktes vara svagare än GFP på samma blad. Emellertid kan detta återspeglar inte den svagare uttrycket av DsRed, utan snarare på grund av den mindre än optimala excitation av DsRed av UV-ljus. Sammantaget visar våra resultat att spruta infiltration effektivt introducerar rekombinant gen-bär Agrobacteria i växtblad och resulterade i robust uttryck för våra målproteiner. Dessutom visade vi att denna metod medger flexibilitethet att antingen infiltrera hela blad för maximal ansamling av ett målprotein eller att spot-infiltrera flera proteinmål med flera vektorer för att jämföra deras uttryck och uttryck mönster.
2. Uttryck av fluorescerande proteiner genom vakuuminfiltrering
Vakuum infiltration undersöktes också för att utveckla en skalbar agroinfiltration metod som kan användas för storskalig produktion av rekombinanta proteiner av växt transienta expressionssystem. Våra resultat indikerar att den temporala uttrycksmönstret för GFP eller DsRed av geminiviral och MagnICON vektorer inte förändrades genom bytet av infiltration metod och förblev liknande den i sprutan infiltration. Eftersom hela skjuta av en anläggning är nedsänkt i infiltration blandningen under vakuuminfiltrering, var fluorescens observerades för GFP (figur 6) för alla bladen av infiltrerade växter. Jämfört med spruta infiltration, är det mer robust och kan achieve infiltration av varje planta med en mycket kortare tid. Till exempel tar det en skicklig elev 15 min till sprutan-infiltrera en hel 6-veckor gamla N. benthamiana växt. Däremot kan samma planta skall infiltreras i 3 min med vakuum från början till slut och flera växter kan infiltreras samtidigt.
Figur 1. N. benthamiana växt tillväxt med torv pellets och brickor tillväxt. vildtypsväxter vid 0 (A), 2 (B), 4 (C) och 6 (D) veckor efter sådd.
Figur 2. Spruta infiltration av N. benthamiana leavesmed Agrobacterium tumefaciens. Sila GV3101 av A. tumefaciens inhysande GFP-uttryckande MagnICON vektorer återsuspenderades i infiltration buffert och laddades i en spruta utan nål. En nick skapades med en nål på baksidan av en 6-veckor gamla växters blad (A). Öppnandet av sprutan placerad mot nick (B) och Agrobacteria i infiltration buffert injicerades i intercellulära utrymmet av bladet via nick (C).
Figur 3. Vakuum infiltration av N. benthamiana lämnar med Agrobacterium tumefaciens. Stam GV3101 av A. tumefaciens innehållande mål-protein-uttryckande vektorer återsuspenderades i infiltrationbuffert och laddas in i en 3 L badkar. Badkaret placerades därefter i en vakuumexsickator som var ansluten till en vakuumpump (A). En 6-veckors gamla anläggningen placerades upp och ned på exsickatorn plattan (B). Hela blad och stam systemet därefter nedsänkt i karet som plattan placerades ovanpå kammaren (C). Agroinfiltration uppnåddes genom ansätts och lossas ett vakuum vid 100 mbar två gånger under 1 minut. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Uttryck av GFP i sprutan agroinfiltrated löv. Hela N. benthamiana bladen infiltreras med stam GV3101 av A. tumefaciens härbärgerande GFP-genen i en geminiviral (A och C) eller MagnICON vecteller (D). Negativa kontroller Bladen infiltrerade med Agrobacteria stammar som inte innehåller det GFP-genen (B). Löv fotograferades under vitt ljus (A) eller UV-ljus (BD) vid 4 dpi (AC) eller 7 dpi (D).
Figur 5. Uttryck av GFP och DsRed i sprutan spot-agroinfiltrated blad. N. benthamiana bladen var spot-infiltrerade med GV3101 hyser GFP, DsRed, eller både GFP och DsRed gener i geminiviral vektorer. En negativ kontroll fläck var infiltrerad med pREP110 + p19. Löv fotograferades under UV-ljus vid 4 dpi.
Figur 6. Expression av GFP i vakuum agroinfiltrerade blad. N. benthamiana blad infiltrerades med GV3101 härbärgerande GFP-genen i MagnICON vektorer. Bladen fotograferades under UV-ljus vid 7 dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ökande kraven på proteinläkemedel kräver världsomfattande nya produktionsplattformar som är robusta, skalbara, billig och säker. Växter har visat sig vara en av de mest lovande system alternativa produktionsmetoder för farmaceutisk protein produktion. Under senare år har utvecklingen av deconstructed virus-baserade vektorer aktiverat transient expression av proteiner i växter, vilket kraftigt ökar hastigheten och utbytet av system växtexpressionsvektorer 2,10. För att ytterligare optimera nyttan av övergående uttryck systemet, visar vi en enkel men effektiv och skalbar metod för att införa mål-genen innehåller Agrobacterium i växtvävnad. Våra resultat indikerar att agroinfiltration med antingen sprutan eller vakuum metod har resulterat i effektivt införande av Agrobacterium in i växtblad och robust produktion av två fluorescerande proteiner, GFP och DsRed.
För att säkerställa att efficient agroinfiltration och protein produktion, måste följande kritiska parametrar vara omsorgsfullt kontrolleras. Avvikelser från dessa parametrar kan resultera i låg agroinfiltration effektivitet och i sin tur, låg målprotein expression.
Ett. Plantera utvecklingstoxicitet skede och hälsa. Den mest troliga variabel i denna metod mellan laboratorier är anläggningen material för infiltration. Medan växter kanske synas fenotypiskt likartad, deras utvecklingsstadiet och fysiologiska tillstånd påverka deras kompetens i att uttrycka rekombinanta proteiner avsevärt. Specifika parametrar vilka har påverkan på växt tillväxt-och proteinnivåer expressionssystem inkluderar temperatur, luftfuktighet, ljusintensitet, tillhandahållande av gödselmedel, växt inympning ålder, och tid som krävs för den maximala ackumulering av målprotein efter leaf infiltration. Växter måste konsekvent erhålla lika stora mängder vatten-och gödningsmedel dagligen. Mindre förändringar i de villkor växters tillväxt får drastiskt förändra den slutliga size av växter och deras förmåga att uttrycka rekombinanta proteiner. Våra tidigare studier indikerar att växter odlade under naturligt ljus gav mer leaf biomassa, men protein avkastningen är mycket mindre än den som odlats under artificiellt ljus 4. Därför, med hjälp artificiellt ljus är den metod av valet för växters tillväxt. Våra resultat visar också att en 16 hr ljus / 8 hr mörker-cykel vid 25 ± 0.5 ° C är den optimalt skick att växa N. benthamiana växter under sådan artificiell belysning 4. Vi visas att det under dessa betingelser, 6-veckors växter är den optimala åldern för GFP och DsRed expression såsom de producerar höga-nivåer av fluorescerande proteiner medan den biomassa utbytet är tillräcklig. Växter äldre än 6-veckor producera mer biomassa men är alltför högväxt att passa in i den infiltration kammaren 4. I Dessutom, blommor börjar att utvecklas efter 6 veckor av tillväxt, negativt drabbar rekombinant 4 protein expression. Följaktligen, 6-veckors växter innehåller den optimala leaf material som balanserar den kombinerade behovet av biomassa avkastning, proteinackumulering, och hur lätt agroinfiltration.
2. Tillväxt och infiltration koncentration av Agrobacterium. En annan nyckeln punkt i denna metodologi är kontroll av tillväxten och infiltration koncentration av A. tumefaciens, såsom mätta genom OD 600. I varje kultur-och subkultur steg, stammar av A. tumefaciens måste odlas till, men inte över den utsedda OD 600. Vi har granskat multipla koncentrationer av A. tumefaciens för den slutliga infiltration av N. benthamiana leaves 4. Låg Agrobacterium koncentration kommer att resultera i den otillräckliga leveransen av målgener in i växter det leder till lågt proteinuttryck. Å andra sidan, om infiltrationen koncentrationen av Agrobacterium är för hög, kommer det att utlösa en överkänslig respons i den infiltrerade vävnaden och leda till nekros 20. Vårt rESULTAT demonstrerade att OD 600 = 0,12 Agrobacterium-stam balanserar behovet för maximal leverans av genkonstruktion utan att orsaka vävnadsnekros-och celldöd. Den önskade OD 600 densitet av Agrobacterium kan erhållas genom användning av konsekventa odlingsmedier, temperatur och kultur tid.
Tre. För vakuum infiltration, är det viktigt att följa den utsedda vakuum-trycket-och infiltration varaktighet. Våra resultat indikerar att ett 3 L balja med Agrobacterium infiltration blandning kan användas för att infiltrera cirka 30 växter. Om mer än 30 växter behöver för att skall infiltreras, behöver en ny sats av Agrobacterium infiltration blandningen som skall levereras.
4. De specifika parametrar som som presenteras i detta pappers är optimerade för expression av proteiner med användning N. benthamiana växter som odlas under specifika betingelser beskrivits ovan med deconstructed virus-baserade vektorer. Såsom diskuterats tidigare, than mest besvärligt parametern att styra i denna metodologi är det växtmaterialet. Vi har uttryckt ett variation av vacciner och terapeutiska proteiner med användande av växter och den infiltration förfarandet vi beskrivs här och erhållits utmärkta resultat i samtliga fall 4,8,14,18,21-23. Dessa resultat visade att de villkor som vi har utvecklat är optimala för proteinuttryck. Men, Om olika mottagande växtarter, expressionsvektorer, eller annorlunda N. Benthamiana växande betingelser användes för infiltration, skulle varje parameter i denna metodik behöva att vara re-optimeras genom experiment.
Sammantaget, har vi visat att agroinfiltration med spruta och vakuum är en enkel yet effektiv metodik för att introducera målgen transporterar Agrobacterium in i växter för transient expression av rekombinanta proteiner. Båda metoderna har sina unika fördelar beroende på målet av forskning och produktion. Syringe infiltration är enkel, kräes endast små volymer av Agrobacterium kulturen och inte behöver dyra pumpar och kammare vakuumpumpar. Såsom demonstreras i denna betänkande, har den flexibiliteten att antingen infiltrera den hela blad med ena målgenen eller använd spot infiltration för att introducera gener av multipla uppsätta som mål på ena leaf. Den Hela leaf infiltration metod kan användas för liten laboratorie skala expression av rekombinant protein för deras biokemisk karakterisering, rening, och preclinical funktionella studier 1. I kontrast, kan spot infiltration användas för att uttrycka multipla proteinmål på ena leaf för att jämföra deras avkastning, kinetik uttrycknings-och toxicitet till växter. Den kan också användas för att jämföra uttrycket av ett reporter protein såsom GFP eller DsRed driven av olika expressionsvektorer på samma löv. Som ett resultat, kan ytterligare vektor förmåga, i att köra protein anhopning och deras kinetik expressions skall karakteriseras. Den Enkelheten av sprutans infiltration möjliggör också det engenomförbara verktyg för att undervisa och utbilda high school och grundutbildningen studenter i ämnet av bioteknik-och genetisk ingenjörskonst.
I jämförelse med injektionsspruta infiltration, kräver vakuum infiltration den investeringen av vakuumpumpar och kamrar och större volymer av Agrobacterium kulturer. Därför, är det inte den metod av val när bara några få växter behöver för att skall infiltreras. Emellertid, ger det den skalbarhet som inte kan matchas genom injektionsspruta infiltration. Det är robustare och kan infiltrera ett stort antal växter i en kort tidsperiod. Med den skalan som presenteras i denna betänkande, är vi kompetent att producera gram nivå av renade farmaceutiska proteiner tillräckliga för en Arrangera Gradvis I human kliniskt försök 4. Dessutom kan denna processen vara ytterligare skalas upp för kommersiell framställning av farmaceutiska proteiner från växter. Till exempel är processer på att utformas att dammsuga infiltrera tre metertons av N. benthamiana plantor per timmei en skala-up operation 24. En annan fördel med vakuuminfiltrering är att den kan användas för att agroinfiltrate växtarter som inte är amenable för spruta infiltration.
Sammanfattningsvis tillhandahåller kombinationen av sprutan och vakuuminfiltrering forskare, biotekniker och utbildare en enkel, effektiv, robust och skalbar metodik för transient uttryck av rekombinanta proteiner i växter. Det kommer väldeliga underlätta utvecklingen och produktion av farmaceutiska proteiner och främja utbildning i naturvetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar R. Sun och andra studenter av Chen: s Laboratorium för deras bidrag till plantera materiella generation. Vi tackar även Dr D. Grön för hans stöd av grundutbildningen forskningen i Högskolan of Technology-och Innovation (CTI). Denna forskning stöttades i del av NIH bidrag U01 AI075549 och 1R21AI101329 till Q. Chen, och en SSE bidrag från CTI av Arizona State University till Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, och J. Stahnke är grundutbildningen studenter som stöds av den SSE bidraget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
