Summary
Planter tilby et nytt system for produksjon av farmasøytiske proteiner i kommersiell skala som er mer skalerbar og kostnadseffektiv og sikker enn dagens uttrykk paradigmer. I denne studien rapporterer vi en enkel og praktisk, men likevel skalerbar tilnærming for å introdusere target-genet inneholder
Abstract
Pattedyrcelle kultur er den store plattformen for kommersiell produksjon av humane vaksiner og terapeutiske proteiner. Men det kan ikke møte den økende verdensomspennende behov for farmasøytiske produkter på grunn av sin begrensede skalerbarhet og høye kostnader. Planter har vist seg å være en av de mest lovende alternative farmasøytisk produksjon plattformer som er robust, skalerbar, lave kostnader og trygt. Den senere tids utvikling av virus-baserte vektorer har gjort det mulig hurtig og høyt nivå forbigående ekspresjon av rekombinante proteiner i planter. For ytterligere å optimalisere nytten av forbigående uttrykk system, viser vi en enkel, effektiv og skalerbar metode for å introdusere target-genet inneholder Agrobacterium inn plantevev i denne studien. Våre resultater tyder på at både agroinfiltration med sprøyte og vakuum metoder har resultert i effektiv innføring av Agrobacterium inn i bladene og robust produksjonen av to fluorescerende proteiner; GFP og DsRed. Viderevi viser de unike fordelene som tilbys av begge metodene. Sprøyte infiltrasjon er enkel og trenger ikke dyrt utstyr. Den tillater også fleksibilitet til å enten infiltrere hele permisjon med ett mål gen, eller å innføre gener av flere mål på ett blad. Således kan den brukes for laboratorieskala ekspresjon av rekombinante proteiner, så vel som for sammenligning av forskjellige proteiner eller vektorer på avkastning eller ekspresjon kinetikk. Enkelheten av sprøyte infiltrasjon antyder også sin nytte i videregående skole og høyskole utdanning for faget av bioteknologi. I kontrast er vakuum infiltrasjon mer robust og kan være skalert opp for kommersiell produksjon av farmasøytiske proteiner. Det har også fordelen av å kunne agroinfiltrate plantearter som ikke er mottagelig for sprøyte infiltrasjon som salat og Arabidopsis. Samlet gir kombinasjonen av sprøyte og vakuum agroinfiltration forskere og lærere en enkel, effektiv og robustmetodikk for forbigående protein uttrykk. Det vil i stor grad rette for utvikling av farmasøytiske proteiner og fremme naturfag.
Introduction
Siden 1970 har plantene blitt utforsket som alternativer til pattedyr, insekt, og bakteriell cellekulturer for kommersiell produksjon av rekombinante proteiner og protein legemiddelselskap en. Plant-baserte systemer for uttrykket av biopharmaceuticals har vist lovende i de siste årene som flere nye behandlinger for sykdommer, som Gauchers sykdom 2, og aviær H5N1 influensa 3, har vist suksess i kliniske studier. Utviklingen av kompetente mekanismer for rekombinant protein uttrykk i planter i tiårene etter de innledende forsøkene har skapt et potensial for plante-baserte systemer for å endre gjeldende paradigmet av protein produksjonen for tre hovedgrunner. For det første er det en merkbar nedgang i kostnader som pattedyr, insekt, og bakteriell bioreaktorer kreve betydelige oppstart kostnader, dyre vekst media og kompliserte prosesser for nedstrøms rensing fire. Etableringen av stabile transgene planterlinjer også tillater dem å gå raskere enn skalerbarhet av andre ekspresjonssystemer som protein uttrykker planter kan dyrkes og høstes på en landbruks skala fem. Dernest plantebaserte ekspresjonssystemer i betydelig grad redusere risikoen for overføring av et humant eller animalsk patogen fra protein-uttrykkende vert til mennesker, demonstrerer overlegenhet i offentlig sikkerhet 6.. Til slutt, planter utnytte et eukaryot endomembransystemet system som ligner på pattedyrceller, slik at for riktig posttranslasjonell modifisering av proteiner, inkludert glykosylering og monteringen av multippel-subenheten proteiner 7. Denne evnen setter plante-baserte systemer forut for de som er basert på prokaryotiske systemer, slik som bakterier, siden et større antall farmasøytiske rekombinante proteiner, inkludert monoklonale antistoffer (mAbs), har en mer komplisert struktur og kreve omfattende modifikasjoner posttranslational eller monteringsprosedyrer 8..
Det er to store hensiktssmerter å uttrykke rekombinante proteiner i planter. Den første er utvikling av et stabilt transgen linje, hvor DNA som koder for det aktuelle protein er klonet inn i en ekspresjonskassett og introdusert til enten den kjernefysiske eller kloroplast genomer. Ved å gjøre det, blir det fremmede DNA arvelige gjennom påfølgende generasjoner og gir mulighet for enormt forbedret skalerbarhet, langt over det andre ekspresjonssystemer en. Innføring av eksogene DNA til den kjernefysiske genom er vanligvis oppnås ved Agrobacterium tumefaciens infeksjon av plante vev, eller sjeldnere, etter microprojectile bombardement av vevet ni. Plantehormoner blir så brukt for å indusere differensiering og vekst av transgene plantevev slik som røtter og blader. Transformasjon av kloroplast genomet kan ikke oppnås med A. tumefaciens, men helt avhengig gull eller wolfram partikler belagt med DNA sparken ballistically inn i planteceller. Den andre metoden for å uttrykke recombinant protein i planter er gjennom forbigående uttrykk 10. I dette scenariet er virus-deriverte vektorer genet av interesse levert via A. tumefaciens til fullt utviklede planter gjennom en prosess som kalles agroinfiltration. I stedet for å integrere inn i anlegget genomet, blir levert genkonstruksjon deretter begynne å lede den forbigående produksjon av det ønskede protein, som kan høstes og isolert etter en kort inkuberingsperiode. Transient genekspresjon gir fordelen av større samlet proteinakkumulering, så vel som en forbedret tid for produksjon av protein, som planter vil være klar til å høste omtrent 1-2 uker etter agroinfiltration 11.. Dette er betydelig raskere enn prosesser av generasjon, utvelgelse, og bekreftelse av stabile transgene planter linjer, som kan ta flere måneder til et år. Dette er imidlertid også en begrensning av den transiente ekspresjonssystem, da den ikke vil gi genetisk stabilt anlegg liien som kan brukes til å generere et frø bank for storskala kommersiell produksjon. Til tross for dette har det blitt utviklet metoder for å forbedre stor skala transient ekspresjon. Her viser vi en metode for generering av forbigående protein-uttrykker Nicotiana benthamiana planter ved hjelp av dekonstruerte virale vektorer levert av A. tumefaciens.
To viktige metoder blir utviklet for levering av A. tumefaciens i plantevev: benk skala infiltrasjon via sprøyte og stor skala infiltrasjon via vakuum kammer. Begge protokollene er beskrevet her bruker N. benthamiana, som er nært knyttet til den felles tobakksplanten, som vert anlegg for forbigående uttrykk av to fluoriserende proteiner: den grønne fluorescerende protein (GFP) fra maneter Aequorea victoria og den røde fluorescerende protein fra Discosoma korall (DsRed) 12,13. N. benthamiana er den vanligste for vertsplantenrekombinant protein fordi det er mottagelig for genetisk transformasjon, kan gi store mengder biomasse raskt, og er en produktiv frø produsent for oppskalering produksjon 14. En annen fordel med å bruke N. benthamiana som verter for protein uttrykk er tilgjengeligheten av en rekke ekspresjonsvektorene 2,5. I denne studien, to dekonstruerte virale vektorer, en basert på en tobakk mosaikk virus (TMV) RNA replikonsystemet (MagnICON vektorer) og andre avledet fra bønne gul dverg virus (BeYDV) DNA replikonsystemet (geminiviral vektorer) 4,11, 15-18, er vant til å bære GFP og DsRed genet og gi dem i N. benthamiana celler via A. tumefaciens. Tre DNA-konstruksjoner vil bli brukt for GFP eller DsRed uttrykk med MagnICON vektorer. De omfatter 5'-modul (pICH15879) som inneholder promotor og andre genetiske elementer for å drive ekspresjon av målgenet, 3'-modul som inneholder genet av interesse (pich-GFP eller pich-DsRed) og integrase modul (pICH14011) som koder for et enzym som integrerer de 5 'og 3' modulene sammen ved uttrykket 8,15. Tre DNA-konstruksjoner er også nødvendig for uttrykk med geminiviral vektorer. I tillegg til vektorer som inneholder replikonet av målgenet (pBYGFP eller pBYDsRed), er en vektor som koder for replikering protein (pREP110) som kreves for amplifikasjon av mål-replikon 11,14,16. Videre er inkluderingen av en vektor koding stanse suppressor p19 fra tomat buskete stunt virus ønsket for høy target genuttrykk 11,16.
Det er vanligvis tre hovedtrinn for innføring av gener av rekombinante proteiner i planteceller ved agroinfiltration inkludert plantevekst, A. tumefaciens kultur forberedelse, og infiltrasjon. Som hvert trinn er kritisk for den ultimate suksess for denne prosedyren derfor en detaljert beskrivelse for hver er gittfor både sprøyte infiltrasjon og vakuum infiltrasjon under.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Plant Growth
- Place 60 torv pellets i en forplantning skuffen. Tilsett 4 l med vann fra springen og la torven pellets absorbere vann i 2 timer.
- Legg to N. benthamiana frø i hver torv pellet ved hjelp av en såmaskin, dekke brettet med en gjennomsiktig plast kuppel, og tillate dem å spire i en 25 ° C, 84% luftfuktighet miljø med en 16/8 timers dag / natt syklus (figur 1A).
- Fjern kuppelen to uker etter såing, tappe vann fra skuffen, og legg to L av Jack gjødsel i en konsentrasjon på 1,48 g / L (Figur 1B). Fortsett å dyrke planter i et 25 ° C og 50% luftfuktighet med en 16/8 timers dag / natt syklus. Levere to L av Jack gjødsel hver to dager per skuffen.
- I uke 4, overføre plantene med torv pellets til et nytt magasin som er vert seks anlegg for å gi tilstrekkelig plass for videre vekst (figur 1C) før de er klare til å bli infiltrert ved 6 ukers alder (Figur1D).
2. A. tumefaciens Kultur Forberedelse
2.1 Forberedelse til sprøyte infiltrasjon
- Streak A. tumefaciens GV3101 stammer inneholder geminiviral vektorer P19, pREP110, pBYGFP og pBYDsRed på LB agar plater som inneholder kanamycin (100 mikrogram / ml). Strek én stamme per plate og vokse ved 30 ° C i 48 timer.
- Tilsvarende strek og vokse GV3101 stammer skjuler de MagnICON vektorer av fem »-modulen (pICH15879), 3 'modul som inneholder målet genet for GFP eller DsRed (Pich-GFP eller Pich-DsRed), og Integrasehemmere (pCH14011) på LB agar skåler inneholdende Carbenicillin (100 pg / ml).
- Fra en enkelt koloni på en LB-agarplate, inokulere GV3101 stammer husing geminiviral vektorer inn i 3 ml YENB medium (0,75% Bacto gjærekstrakt, 0,8% næringsbuljong, juster pH til 7,5 med NaOH) + kanamycin (100 ug / ml) i en 15 ml rundbunnet kultur rør, vokser den flytende kultur ved 30 ° C ien shaker over natten med en 300 rpm rotasjonshastighet.
- Tilsvarende vaksinere og vokse GV3101 stammer skjuler MagnICON vektorer i YENB media + Carbenicillin (100 mikrogram / ml) i en shaker over natten ved 30 ° C.
- Måle og registrere OD 600 verdier for hver flytende kultur med et spektrofotometer og bruke følgende formel for å beregne den nødvendige volum (V sub) som skal subkultiveres for en ny kultur med en start-OD 600 på 0,025 i 10 ml YENB medier med passende antibiotika .
Sub V (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Overføring V sub (ml) av natten kultur til (10 - V sub) ml YENB medier med egnede antibiotika for hver stamme. Dyrk den nye kulturen over natten ved 30 ° C i en rister med en 250 rpm rotasjonshastighet inntil OD 600 verdien er i området fra 1,7 til 2,0.
- Måle og registrere OD 600 verdier for hver flytende kultur og bruke formelen nedenfor for å calcUlate det nødvendige volum (V inf) som skal fortynnes i 50 ml infiltrering buffer for å gi en endelig OD 600 på 0,12 for hver stamme.
V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Overføring V inf (ml) av hver kultur til et mikrosentrifugerør og spinne ned cellene ved sentrifugering ved 12.000 xg i 2 min, og deretter fjerne supernatanten resuspender cellene i 10 ml infiltrasjon buffer (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO 4) ved å virvle kort.
- Bland resuspenderes cellene i pBYGFP pREP110 + + P19, spinne cellene ned ved 12.000 xg i 2 min, og resuspender i totalt 50 ml av infiltrasjon buffer. Dette Agrobacteria kombinasjonen er for geminiviral uttrykk for GFP.
- Tilsvarende, bland følgende kombinasjoner av Agrobacteria celler, spinner ned og resuspender dem i 50 ml av infiltrasjon buffer. De omfatter (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 for geminiviral uttrykk for DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 for geminiviral co-uttrykk for GFP og DsRed, (3) pREp110 + p19 som negativ kontroll over geminiviral uttrykk, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 for MagnICON uttrykk for GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 for MagnICON uttrykk for DsRed, og (6) pICH15879 + pCH14011 som negativ kontroll for MagnICON uttrykk.
2.2 Forberedelse til Vacuum infiltrasjon
- Inokulere og kultur hver GV3101 belastning inneholder geminiviral vektorer eller MagnICON vektorer i 15 ml YENB media med passende antibiotika i en 50 ml autoklaveres kolbe og vokse over natten som beskrevet for sprøyte infiltrasjon over.
- Måle og registrere OD 600 verdier for hver flytende kultur med et spektrofotometer og bruke følgende formel for å beregne den nødvendige volum (V sub) som skal subkultiveres for en ny kultur med en start-OD 600 på 0,025 i 250 ml YENB medier med passende antibiotika .
V sub 600 - Overføring V sub (ml) av natten kultur til (250 - V sub) ml YENB medier i en 1 L kolbe med autoklaverte egnede antibiotika for hver stamme og dyrke den nye kulturen natten over som beskrevet for sprøyte infiltrasjon ovenfor.
- Måle og registrere OD 600 verdier for hver flytende kultur og bruke følgende formel for å beregne den nødvendige volum (V inf) som skal fortynnes med 3 l av infiltrering buffer for å gi en endelig OD 600 på 0,12 for hver stamme.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 - Pellet og resuspender V inf (ml) av hver kultur i infiltrasjon buffer som beskrevet for sprøyte infiltrasjon og blande de resuspenderte kulturer i henhold til kombinasjonene som er beskrevet for sprøyte infiltrasjon. Repellet de blandede Agrobacteria cellene og resuspender dem i tre L av infiltrasjon buffer.
3.1 Sprøyte infiltrasjon
- Velg fire 6-ukers gamle N. benthamiana planter med fem blader hver. De første tre blad regnet fra toppen av hver plante vil bli infiltrert utelukkende med en av kombinasjonene av A. tumefaciens stammer i infiltrasjon buffer. Den fjerde blad vil være spot-infiltrert med alle fire belastningsskader kombinasjoner for geminiviral uttrykk eller alle tre kombinasjoner for MagnICON uttrykk. Den siste blad på hver plante vil bli infiltrert med kombinasjoner av negative kontroller.
- Opprett en liten nick med en nål i epidermis på baksiden av bladet (figur 2A). OBS: Pass på at du ikke skraper så hardt som å pierce blad gjennom begge sider, som Agrobacteria cellene i infiltrasjon blandingen vil passere gjennom punktering til den andre siden av bladet.
- Ta et fast grep på forsiden av bladet, og mens søknad skånsommottrykk til den nick med tommelen på én hånd, injiser Agrobacterium blandinger i buffer infiltrasjon inn i nick med en sprøyte uten nål (figur 2B). Merk: Som Agrobacterium blandingen inn i mellomrom mellom av bladet, vil infiltrert området slår synlig mørkere grønn (figur 2C).
- Fortsett å injisere de Agrobacterium blandinger inn nicket til den mørkere grønn sirkel slutter å ekspandere. Lag en annen nick og gjenta trinn 3.1.2-3.1.4 til hele bladet er infiltrert og hele bladet blir mørkere grønn for de tre første bladene og den siste blad.
- For fjerde blad av hver plante, vil alle fire (geminiviral vektor) eller tre (MagnICON vektor) kombinasjoner bli infiltrert inn i den. Gjør ett nick for hver kombinasjon av Agrobacterium stammer, og infiltrere hvert nick med en kombinasjon.
- Etter infiltrasjon, flytte plantene tilbake til vekst rom og Monitor protein uttrykk mellom 2-15 dager etter infiltrasjon (dpi).
3.2 Vacuum infiltrasjon
- Plasser en kar i et vakuum eksikkator og overføring 3 L infiltrasjon buffer som inneholder Agrobacterium stammer til karet. Koble eksikkator til en Vacuubrand membran vakuumpumpe (figur 3A).
- Plasser en plante opp ned på eksikatoren plate (figur 3B) og senk plate med anlegget inntil hele blad og stilk systemet er neddykket i infiltrasjon buffer med platen hviler på toppen av karet. Plasser eksikatoren O ring langs kanten og sette eksikatoren lokket på kammeret (Figur 3C).
- Slå på vakuumpumpen og starter klokken når vakuumet når 100 mbar. Sakte åpne utløserventilen på eksikatoren etter 1 min ved 100 mbar for å tillate inngang av Agrobacteria inn i de interstitielle rom av neddykket plantevev. Gjenta dette trinnet en additional tid til å sikre god infiltrasjon.
- Etter infiltrasjon, ta planten ut av eksikkator og sette den tilbake til oppreist stilling. Flytt plantene tilbake til vekst rom og monitor protein uttrykk mellom 2-15 dpi.
4. Fluorescent Protein Detection and Photography
- Starter fra 2 dpi, flytte planter i mørkt rom og skinne UV-lys på baksiden av infiltrert blader med en håndholdt UV-lampe.
- Observer grønn fluorescens av GFP eller rød fluorescens av DsRed. GFP avgir et sterkere signal med langbølget UV-lys, mens DsRed er sterkere i henhold kortbølge UV lys.
- Ta fotografier av fluorescerende blader med et vanlig digitalt kamera uten blits.
- Flytt plantene tilbake til vekst rommet etter observasjon eller fotografering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En. Uttrykk av fluorescerende proteiner etter sprøyte infiltrasjon
For å demonstrere effekten av sprøyten infiltrasjon av Agrobacterium i plantevev, testet vi uttrykk for to fluoriserende proteiner - GFP og DsRed - av to forskjellige dekonstruerte plante virale vektorer - geminiviral og MagnICON - i N. benthamiana. For N. benthamiana blader som var helt infiltrert med Agrobacteria inneholder geminiviral vektorer, ble GFP uttrykk observert over hele bladet området under UV-lys starter fra så tidlig som to dpi og nådde topp opphopning på 4 dpi (Figur 4C). Denne tidlige GFP uttrykk ved geminiviral vektor er konsistent med tidligere resultater av andre rekombinante proteiner 14,16,18,19. I kontrast, blader infiltrert med MagnICON vektor som inneholder Agrobacterium kombinasjoner viste GFP fluorescens bare etter fem dpi og nådde sin maksimale accumulatipå på 7 dpi (Figur 4D). Ingen grønn fluorescens ble observert fra blader infiltrert med negativ kontroll Agrobacterium blandinger av pREP110 + p19 (Figur 4B) eller pICH15879 + pCH14011 (data ikke vist), noe som indikerer at fluorescens var spesifikke for GFP genet og var ikke et resultat av bakgrunnsfluorescens fra bladene. På sitt høyeste opphopning, er fluorescens av MagnICON vektor-uttrykte GFP mer intense enn geminiviral vektor (Figur 4C og 4D), tilsvarende resultater tidligere oppnådd for andre rekombinante proteiner 8,18. Den tidsmessige uttrykk mønster og den relative intensiteten til fluorescerende DsRed er lik den for GFP (data ikke vist). Ingen av de store nekrose ble observert på bladene infiltrert med GFP konstruktene (figur 4A). Lignende resultater ble også observert for DsRed-uttrykke planter, noe som indikerer at verken fluoriserende protein er svært giftig plante ceLLS. Imidlertid ble lokal nekrose ved nick området observert og de virket som "hull" i fotografiene (figur 4). Når begge fluorescerende proteiner ble uttrykt på samme blad via geminiviral vektorer med sprøyte spot-infiltrasjon, de ble oppdaget med sin forventede fluoriserende farge i stedet hvor de ble infiltrert (figur 5). Interessant, co-infiltrasjon av GFP og DsRed resulterte i gulaktig fluorescens (figur 5). Intensiteten av DsRed fluorescens syntes å være svakere enn for GFP på samme blad. Dette kan imidlertid ikke reflektere den svakere ekspresjon av DsRed, men snarere på grunn av den mindre enn optimal eksitering av DsRed ved UV-lys. Overall, våre resultater viser at sprøyten infiltrasjon effektivt introduserer rekombinant gen-bærer Agrobacteria inn plante blader og resulterte i robust uttrykk for våre target proteiner. I tillegg demonstrerte vi at denne metoden tillater fleksibilitettet til enten infiltrere hele blader for maksimal oppsamling av ett mål protein eller å få øye-infiltrere flere protein mål med flere vektorer for å sammenlikne deres uttrykk og uttrykk mønster.
2. Uttrykk av fluorescerende proteiner etter Vacuum infiltrasjon
Vakuum infiltrering ble også undersøkt for å utvikle en skalerbar agroinfiltration metode som kan anvendes for storskala produksjon av rekombinante proteiner av plante transiente ekspresjonssystemer. Våre resultater tyder på at den temporale mønster ekspresjon av GFP eller DsRed ved geminiviral og MagnICON vektorer var uforandret ved forandring av infiltrasjon metode og forble lik som sprøyten infiltrasjon. Siden hele shoot av et anlegg er neddykket i infiltrasjon blandingen under vakuum infiltrasjon, fluorescens ble observert for GFP (figur 6) for alle blader av infiltrert planter. Sammenlignet med sprøyte infiltrasjon, er det mer robust og kan achieve infiltrasjon av hver plante med en mye kortere tidsperiode. For eksempel tar det en dyktig student 15 min til sprøyte-infiltrere en hel 6-ukers gamle N. benthamiana anlegget. I kontrast, kan det samme anlegget bli infiltrert i 3 minutter ved hjelp av vakuum fra start til slutt, og flere planter kan infiltreres samtidig.
Figur 1. N. benthamiana plantevekst med torv pellets og vekst skuffer. planter av vill type ved 0 (A), to (B) og 4 (c) og 6 (D) uker etter såing.
Figur 2. Sprøyte infiltrasjon av N. benthamiana etterlatermed Agrobacterium tumefaciens. Sil GV3101 av A. tumefaciens skjuler GFP-uttrykker MagnICON vektorer ble resuspendert i infiltrasjon buffer og lastet inn i en sprøyte uten nål. En nick ble laget med et nål på baksiden av en 6-ukers gamle planteblad (A). Åpningen av sprøyten ble plassert mot den nick (B) og Agrobacteria i infiltrasjon buffer ble injisert inn i det intracellulære rommet av bladet via kallenavn (C).
Figur 3. Vakuum infiltrasjon av N. benthamiana blader med Agrobacterium tumefaciens. Strain GV3101 av A. tumefaciens inneholder target protein-uttrykke vektorer ble resuspendert i infiltration buffer og lastet inn i et tre L kar. Karet ble deretter plassert inn i en vakuum-eksikkator som var koblet til en vakuumpumpe (A). En 6-ukers gamle anlegget ble plassert opp ned på eksikatoren platen (B). Hele blad og stilk systemet ble deretter neddykket i karet som platen ble plassert på toppen av kammeret (c). Agroinfiltration ble oppnådd ved å bruke og slippe et vakuum på 100 mbar to ganger i 1 min. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Uttrykk av GFP i sprøyten agroinfiltrated blader. Hele N. benthamiana bladene var infiltrert med belastning GV3101 av A. tumefaciens skjuler GFP genet i en geminiviral (A og C) eller MagnICON Vecteller (D). Negative kontroll bladene var infiltrert med Agrobacteria stammer som ikke inneholder at GFP genet (B). Bladene ble fotografert under hvitt lys (A) eller UV-lys (BD) ved 4 dpi (AC) eller 7 dpi (D).
Figur 5. Uttrykk av GFP og DsRed i sprøyte spot-agroinfiltrated blader. N. benthamiana bladene var spot-infiltrert med GV3101 husing GFP, DsRed, eller begge GFP og DsRed gener i geminiviral vektorer. En negativ kontroll stedet ble infiltrert med pREP110 + p19. Bladene ble fotografert under UV lys ved 4 dpi.
Figur 6. Uttrykk av GFP i vakuum agroinfiltrated blader. N. benthamiana bladene var infiltrert med GV3101 husing GFP genet i MagnICON vektorer. Bladene ble fotografert under UV lys på syv dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De økte kravene til protein-baserte legemidler over hele verden krever nye produksjonsplattformer som er robust, skalerbar, lave kostnader og trygt. Plantene har vist seg å være en av de mest lovende alternativ produksjonssystemer for farmasøytisk proteinproduksjon. I de senere årene har utviklingen av dekonstruerte virus-baserte vektorer aktivert forbigående uttrykk av proteiner i planter, som i stor grad forbedrer hastigheten og utbytte av anlegget ekspresjonssystemer 2,10. For ytterligere å optimalisere nytten av den transiente ekspresjonssystem, har vi også vist en enkel, men allikevel effektiv og skalerbar måte å innføre target-gen som inneholder Agrobacterium inn i plantevevet. Våre resultater tyder på at agroinfiltration med enten sprøyten eller vakuum-metoden har medført at den effektive innføring av Agrobacterium inn i anlegget blader og robust produksjonen av to fluorescerende proteiner, GFP og DsRed.
For å sikre efnt agroinfiltration og protein produksjon, må følgende kritiske parametere kontrolleres nøye. Avvik fra disse parameterne kan resultere i lav effektivitet agroinfiltration og i sin tur, lav målprotein ekspresjon.
En. Plant utviklingsstadiet og helse. Den mest sannsynlige variabel i denne metoden mellom laboratorier er plantematerialet for infiltrasjon. Mens planter kan vises fenotypisk like, deres utviklingsstadiet og fysiologiske tilstand påvirker deres kompetanse i å uttrykke rekombinante proteiner betydelig. Spesifikke parametre som har konsekvenser for plantevekst og protein uttrykk nivåer inkluderer temperatur, fuktighet, lysintensitet, tilførsel av gjødsel, plante vaksinasjon alder, og tiden som kreves for maksimal akkumulering av målet protein etter blad infiltrasjon. Planter må konsekvent får like mengder vann og gjødsel daglig. Mindre endringer i plante vekstvilkår kan drastisk endre den endelige size av planter og deres evne til å uttrykke rekombinante proteiner. Våre tidligere studier tyder på at planter som vokser under naturlig lys produsert mer blad biomasse, men protein avkastning er mye mindre enn det som dyrkes under kunstig lys fire. Derfor, ved hjelp av kunstig lys er metoden for valg for plantevekst. Våre resultater viser også at en 16 timers lys / 8 timers mørke-syklus ved 25 ± 0,5 ° C er den optimale tilstand for å vokse N. benthamiana planter under en slik kunstig belysning fire. Vi har vist at under disse betingelsene, 6-ukers planter er den optimale alder for GFP og DsRed uttrykk som de produserer høye nivåer av fluorescerende proteiner mens biomassen utbyttet er tilstrekkelig. Planter eldre enn 6 uker produsere mer biomasse, men er for høy til å passe inn i infiltrasjon kammeret 4. I tillegg blomstene begynner å utvikle seg etter 6 ukers vekst, negativt påvirker rekombinant proteinekspresjon 4.. Følgelig 6-ukers planter inneholder den optimale lEAF materiale som balanserer den samlede behov for biomasse yield, protein akkumulering, og den enkle agroinfiltration.
2. Vekst og infiltrasjon konsentrasjon av Agrobacterium. Et annet sentralt punkt i denne metodikken er kontroll av vekst og infiltrasjon konsentrasjon av A. tumefaciens, målt ved OD 600. I hver kultur og subkultur trinn, stammer av A. tumefaciens må vokst til, men ikke over den angitte OD 600. Vi har undersøkt flere konsentrasjoner av A. tumefaciens for den endelige infiltrasjon av N. benthamiana forlater fire. Lav Agrobacterium konsentrasjon vil føre til utilstrekkelig levering av mål-gener til planter, som fører til lav proteinekspresjon. På den annen side, dersom konsentrasjonen av infiltrasjon Agrobacterium er for høy, vil det utløse en hypersensitiv respons i den infiltrerte vev og føre til nekrose 20.. Vår results viste at OD 600 = 0,12 Agrobacterium påkjenning balanserer behovet for maksimal levering av genkonstruksjon uten å forårsake vevsnekrose og celledød. Den ønskede tetthet OD 600 av Agrobacterium kan oppnås ved bruk av konsistente dyrkningsmedier, temperatur og tid kultur.
3. For vakuum infiltrasjon, er det viktig å følge den utpekte vakuum press og infiltrasjon varighet. Våre resultater tyder på at en 3 liter kar av Agrobacterium infiltrasjon blanding kan brukes til å infiltrere omtrent 30 planter. Hvis mer enn 30 planter trenger for å bli infiltrert, trenger en ny gruppe med Agrobacterium infiltrasjon blandingen som skal leveres.
4. De spesifikke parametre presenteres i denne artikkelen er optimalisert for uttrykk av proteiner ved hjelp N. benthamiana planter dyrkes under spesielle forhold som er beskrevet ovenfor med dekonstruerte virus-baserte vektorer. Som diskutert tidligere, than mest vanskelig parameter å styre i denne metodikken er plantemateriale. Vi har uttrykt en rekke vaksiner og terapeutiske proteiner ved hjelp av planter og infiltrasjon prosedyre vi beskrevet her og fikk gode resultater i alle tilfeller 4,8,14,18,21-23. Disse resultatene viste at de forholdene vi har utviklet er optimal for protein uttrykk. Men hvis forskjellige vert plantearter, uttrykk vektorer, eller forskjellige N. Benthamiana vekstforhold ble brukt for infiltrasjon, ville hver parameter i denne metodikken må re-optimalisert av eksperimenter.
Totalt har vi vist at agroinfiltration med sprøyte og vakuum er en enkel og effektiv metode for å innføre mål gen bærer Agrobacterium inn planter for forbigående uttrykk av rekombinante proteiner. Begge metodene har sine unike fordeler avhengig av målet for forskning og produksjon. Sprøyte infiltrasjon er enkel, som kreveres bare små mengder Agrobacterium kultur og ikke trenger dyre pumper og vakuum kamre. Som vist i denne rapporten, har den fleksibilitet til enten å infiltrere hele bladet med ett mål gen eller bruke flekk infiltrasjon å introdusere gener av flere mål på ett blad. Hele blad infiltrasjon metoden kan brukes for liten laboratorieskala ekspresjon av rekombinant protein i deres biokjemiske karakterisering, rensing, og prekliniske funksjonelle studier 1. I kontrast, kan flekk infiltrasjon brukes til å uttrykke flere protein mål på ett blad for å sammenligne deres avkastning, uttrykk kinetikk og giftighet for planter. Den kan også brukes til å sammenligne ekspresjonen av en reporter protein som GFP eller DsRed drevet av forskjellige ekspresjonsvektorer, for det samme blad. Som et resultat, kan forskjellige vektor evne i kjøring proteinakkumulering og deres uttrykk kinetikk karakteriseres. Enkelheten av sprøyte infiltrasjon gjør det også engjennomførbart verktøy for å undervise og lære videregående skole og studenter i faget av bioteknologi og genteknologi.
I sammenligning med sprøyte infiltrasjon, krever vakuum infiltrasjon investering av vakuum pumper og kammer og større volumer av Agrobacterium kulturer. Derfor er det ikke metoden valgfrihet når bare noen få planter trenger å bli infiltrert. Det gir imidlertid den skalerbarheten som ikke kan matches av sprøyte infiltrasjon. Det er mer robust og kan infiltrere et stort antall planter i løpet av kort tid. Med skalaen presenteres i denne rapporten, er vi i stand til å produsere gram nivå av renset farmasøytiske proteiner tilstrekkelig for en fase I kliniske studie fire. Videre kan denne prosessen bli ytterligere skalert opp for kommersiell produksjon av farmasøytiske proteiner fra planter. For eksempel er prosesser blir utformet til å støvsuge infiltrere tre tonn N. benthamiana planter per timei en skala opp drift 24. En annen fordel med vakuum-infiltrering, er at den kan brukes til å agroinfiltrate plantearter som ikke er mottagelig for sprøyte infiltrasjon.
Oppsummert gir kombinasjonen av sprøyte og vakuum infiltrasjon forskere, biotechnologists og lærere en enkel, effektiv, robust og skalerbar metodikk for forbigående uttrykk av rekombinante proteiner i planter. Det vil i stor grad forenkle utvikling og produksjon av farmasøytiske proteiner og fremme naturfag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker R. Sun og andre studenter av Chens Laboratory for deres bidrag til plantemateriale generasjon. Vi vil også takke Dr. D. Grønn for sin støtte til lågare forskning i College of Technology og innovasjon (CTI). Denne forskningen ble støttet delvis av NIH tilskudd U01 AI075549 og 1R21AI101329 til Q. Chen, og en SSE stipend fra CTI av Arizona State University til Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, og J. Stahnke er lavere grads studenter som støttes av SSE tilskuddet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
