Summary
النباتات توفر نظام رواية لإنتاج البروتينات الدوائية على نطاق تجاري وهذا هو أكثر استيعابا، فعالة من حيث التكلفة وآمنة من نماذج التعبير الحالي. في هذه الدراسة، ونحن التقرير مقاربة بسيطة ومريحة، وحتى الآن قابلة لإدخال الجينات التي تحتوي على الهدف
Abstract
ثقافة خلايا الثدييات هو المنصة الرئيسية للإنتاج التجاري من اللقاحات البشرية والبروتينات العلاجية. ومع ذلك، فإنه لا يمكن تلبية الطلب المتزايد في جميع أنحاء العالم للادوية، نظرا لقابلية محدودة والتكلفة العالية. وقد أظهرت النباتات لتكون واحدة من أكثر واعدة منصات إنتاج الأدوية البديلة التي هي قوية وقابلة للتطوير، منخفضة التكلفة وآمنة. وقد سمح التطور الأخير من ناقلات القائم على فيروس التعبير عابر سريع وعلى مستوى عال من البروتينات المؤتلف في النباتات. لمزيد من تعظيم فائدة من نظام التعبير عابرة، ونحن يبرهن على وجود منهجية بسيطة وفعالة وقابلة للتطوير لإدخال الجينات التي تحتوي على الهدف الأجرعية في الأنسجة النباتية في هذه الدراسة. نتائجنا تشير إلى أن agroinfiltration مع كل حقنة والفراغ وأسفرت الأساليب في مقدمة كفاءة الأجرعية في الأوراق وإنتاج قوي من اثنين من البروتينات الفلورية؛ GFP وDsRed. وعلاوة على ذلك،ونحن لشرح المزايا الفريدة التي توفرها كلا الأسلوبين. تسلل حقنة بسيطة ولا تحتاج إلى معدات باهظة الثمن. كما يسمح للمرونة إما اختراق إجازة كامل مع الجين المستهدف واحد، أو لإدخال جينات من أهداف متعددة على ورقة واحدة. وهكذا، فإنه يمكن استخدامها لمختبر التعبير مقياس من البروتينات المؤتلف وكذلك لمقارنة البروتينات أو نواقل مختلفة لمحصول أو التعبير حركية. بساطة تسلل حقنة أيضا تقترح فائدتها في المدرسة الثانوية والتعليم الجامعي لموضوع التكنولوجيا الحيوية. في المقابل، تسلل الفراغ هو أكثر قوة ويمكن زيادتها الى أعلى لتصنيع التجارية من البروتينات الدوائية. فإنه يوفر أيضا ميزة كونها قادرة على agroinfiltrate الأنواع النباتية التي ليست قابلة للتسلل حقنة مثل الخس ونبات الأرابيدوبسيس. وعموما، فإن الجمع بين حقنة وagroinfiltration فراغ يوفر الباحثين والمربين بسيطة وفعالة وقويةمنهجية لعابر التعبير البروتين. وسيسهل بشكل كبير في تطوير البروتينات الدوائية وتعزيز تعليم العلوم.
Introduction
منذ 1970s، تم استكشاف النباتات كبدائل للالثدييات، الحشرات، والبكتيرية مزارع الخلايا لإنتاج التجاري من البروتينات المؤتلف والتداوي البروتين 1. وقد أظهرت أنظمة المستندة إلى النباتات للتعبير عن المستحضرات الصيدلانية البيولوجية واعدة في السنوات الأخيرة، حيث العديد من العلاجات رواية للأمراض، مثل مرض غوشيه 2، وإنفلونزا الطيور H5N1 3، وقد أظهرت نجاح في التجارب السريرية. وقد خلق وضع آليات المختصة للتعبير البروتين المؤتلف في النباتات في العقود التي تلت تلك التجارب الأولية المحتملة للأنظمة المستندة إلى النباتات لتغيير النموذج الحالي للإنتاج البروتين لثلاثة أسباب رئيسية. أولا، هناك انخفاض ملحوظ في التكاليف على النحو المفاعلات الحيوية الثدييات، الحشرات، والبكتيرية تتطلب تكاليف كبيرة بدء التشغيل، وسائط النمو باهظة الثمن، وعمليات معقدة لتنقية المصب 4. إنشاء مصنع المعدلة وراثيا مستقرةخطوط أيضا تتيح لهم التفوق على قابلية نظم التعبير الأخرى مثل البروتين النباتات معربا يمكن تزرع وتحصد على نطاق الزراعية 5. ثانيا، نظم التعبير المستندة إلى النباتات تقلل إلى حد كبير خطر انتقال العامل الممرض الإنسان أو الحيوان من المضيف البروتين، معربا عن البشر، مما يدل على التفوق في السلامة العامة 6. وأخيرا، والنباتات الاستفادة من نظام endomembrane حقيقية النواة مشابه لخلايا الثدييات، والسماح لمناسبة التعديل بعد متعدية من البروتينات بما في ذلك ارتباط بالغليكوزيل والجمعية من البروتينات متعددة الوحيدات 7. هذه القدرة يضع أنظمة المستندة إلى النباتات قبيل تلك التي تستند على أنظمة بدائية، مثل البكتيريا، لأن عددا أكبر من البروتينات المؤتلف الصيدلانية، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS)، لديها بنية أكثر تعقيدا وتتطلب تعديلات واسعة ما بعد النقل أو التجميع 8.
هناك نوعان من APPRO الرئيسيةأوجاع إلى التعبير عن البروتينات المؤتلف في النباتات. الأول هو وضع خط ثابت المعدلة وراثيا، حيث يتم استنساخ الحمض النووي الترميز للبروتين الهدف إلى الكاسيت التعبير وأدخلت إما إلى الجينوم النووية أو بلاستيدات الخضراء. في القيام بذلك، يصبح الحمض النووي الأجنبية الموروثة من خلال الأجيال المتعاقبة، ويسمح لتحسن بشكل كبير والتدرجية، وأبعد من ذلك من أنظمة التعبير الأخرى 1. مقدمة من الحمض النووي الخارجية لالجينوم النووية ويتحقق عادة عن طريق عدوى الأجرعية المورمة من الأنسجة النباتية، أو أقل في كثير من الأحيان، عن طريق القصف microprojectile من النسيج 9. ثم يتم استخدام الهرمونات النباتية للحث على تمايز ونمو الأنسجة النباتية المعدلة وراثيا مثل الجذور والأوراق. لا يمكن أن يتحقق التحول من الجينوم بلاستيدات الخضراء مع A. المورمة، لكنها تعتمد كليا على الذهب أو التنغستن جسيمات المغلفة مع الحمض النووي أطلقت المقذوفات في الخلايا النباتية. الطريقة الثانية للتعبير عن recombinaNT البروتين في النباتات من خلال التعبير عابر 10. في هذا السيناريو، يتم تسليم ناقلات الفيروس المستمدة إيواء الجينات في المصالح عبر A. المورمة للنباتات تطويره بالكامل من خلال عملية تسمى agroinfiltration. بدلا من الاندماج في الجينوم المصنع، وبناء الجين تسليمها بعد ذلك تبدأ لتوجيه الإنتاج عابرة من البروتين المطلوب، والتي يمكن أن تحصد ومعزولة بعد فترة حضانة قصيرة. عابر التعبير الجيني يوفر ميزة أكبر تراكم البروتين الكلي فضلا عن الوقت تحسن من إنتاج البروتين، والنباتات سيكون جاهزا للحصاد ما يقرب من 1-2 أسابيع بعد agroinfiltration 11. هذا هو أسرع بكثير من عمليات توليد، والاختيار، وتأكيدا لخطوط النبات المعدلة وراثيا مستقرة، والتي يمكن أن يستغرق عدة أشهر إلى سنة. هذا ومع ذلك، هو أيضا الحد من نظام التعبير عابرة، لأنها لن تسفر مستقرة وراثيا النباتية لىNES التي يمكن استخدامها لتوليد بنك البذور للإنتاج التجاري على نطاق واسع. على الرغم من هذا، وقد وضعت مناهج لتحسين كبير التعبير عابر الحجم. نحن هنا لشرح أسلوب واحد من جيل من البروتين، معربا عن النباتات benthamiana نيكوتيانا عابر باستخدام ناقلات فيروسية فككت ألقاها أ. المورمة.
ويجري تطوير طريقتين الرئيسية لإيصال A. المورمة في الأنسجة النباتية: مقاعد البدلاء النطاق تسلل عبر حقنة وتسلل نطاق واسع عبر فراغ الغرفة. يتم وصف كل من البروتوكولات هنا باستخدام N. benthamiana، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا نبات التبغ شيوعا، حيث أن النبات المضيف للتعبير عابر من اثنين من البروتينات الفلورية: البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من قناديل البحر Aequorea فيكتوريا وبروتين أحمر فلوري من Discosoma المرجانية (DsRed) 12،13. N. benthamiana هو النبات العائل الأكثر شيوعا للالمؤتلف البروتين لأنها قابلة للتحول الجيني، يمكن أن تسفر عن كميات عالية من الكتلة الحيوية بسرعة، ومنتج البذور وافرة لإنتاج نطاق المتابعة 14. ميزة أخرى لاستخدام N. benthamiana بصفتها الدولة المضيفة للتعبير البروتين هو توافر مجموعة متنوعة من ناقلات التعبير 2،5. في هذه الدراسة، واثنين من ناقلات فيروسية فككت، واحدة على اساس فيروس فسيفساء التبغ (TMV) RNA نظام ريبليكون (ناقلات MagnICON) والأخرى المستمدة من الفول فيروس القزم الأصفر (BeYDV) DNA نظام ريبليكون (ناقلات geminiviral) 4،11، 15-18، وتستخدم لحمل الجينات وGFP DsRed وتسليمها إلى N. الخلايا benthamiana عبر A. وسوف تستخدم المورمة. ثلاثة بنيات الحمض النووي لGFP أو التعبير DsRed مع ناقلات MagnICON. وهي تشمل 5 'وحدة (pICH15879) التي تحتوي على المروج وعناصر وراثية أخرى لقيادة التعبير عن الجينات المستهدفة، 3' وحدة تحتوي على الجينات في المصالح (بيش-GFP أو بيش-DsRed)، وحدة integrase (pICH14011) الترميز للحصول على الانزيم الذي يجمع بين 5 'و 3' وحدات معا على التعبير 8،15. وهناك حاجة أيضا ثلاث بنيات الحمض النووي للتعبير مع ناقلات geminiviral. بالإضافة إلى ناقلات تحتوي على ريبليكون من الجين المستهدف (pBYGFP أو pBYDsRed)، متجه الترميز للبروتين النسخ المتماثل (pREP110) مطلوب من أجل التضخيم من الهدف ريبليكون 11،14،16. وعلاوة على ذلك، هو المطلوب إدراج ناقلات ترميز إسكات P19 القامع من الطماطم فيروس حيلة خطها لمستوى عال الهدف التعبير الجيني 11،16.
عموما هناك ثلاثة خطوات رئيسية لإدخال جينات البروتينات المؤتلف في خلايا النبات بواسطة agroinfiltration بما في ذلك نمو النبات، A. ثقافة المورمة إعداد، والتسلل. وتقدم كما في كل خطوة هو أمر حاسم لنجاح النهائي لهذا الإجراء، وبالتالي، وصفا مفصلا لكللكل من تسلل حقنة وتسلل الفراغ أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو النبات
- مكان 60 الجفت الكريات في صينية الانتشار. إضافة 4 لتر ماء الصنبور، والسماح للالجفت الكريات امتصاص الماء لمدة 2 ساعة.
- إضافة 2 N. بذور benthamiana في كل الجفت بيليه باستخدام بذارة، تغطية صينية بقبة بلاستيكية شفافة، والسماح لهم لتنبت في 25 ° C، 84٪ الرطوبة بيئة مع اليوم / ليلة دورة الموارد البشرية 16/8 (الشكل 1A).
- إزالة القبة بعد أسبوعين البذر، واستنزاف المياه من الدرج، وإضافة 2 لتر من السماد جاك بتركيز 1.48 جم / L (الشكل 1B). الاستمرار في زراعة النباتات في 25 ° C، 50٪ الرطوبة بيئة مع 8/16 ساعة يوميا / دورة الليل. توريد 2 L من الأسمدة جاك كل يوم 2 لكل علبة.
- في الأسبوع 4، ونقل النباتات مع الكريات الجفت إلى علبة الجديدة التي يستضيف ستة مصانع لتوفير مساحة كافية لمزيد من النمو (الشكل 1C) حتى تكون جاهزة للتسلل في 6 أسابيع من العمر (الشكل1D).
2. A. المورمة تحضير الثقافة
2.1 التحضير للتسلل الحقنة
- خط A. المورمة GV3101 سلالات تحتوي على ناقلات geminiviral P19، pREP110، pBYGFP، وpBYDsRed على لوحات أجار LB تحتوي على الكانامايسين (100 ميكروغرام / مل). خط سلالة واحدة لكل لوحة وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- وبالمثل، الإنتصارات وتنمو GV3101 سلالات إيواء ناقلات MagnICON من 5 'وحدة (pICH15879)، 3' وحدة تحتوي على الجين المستهدف من GFP أو DsRed (بيش-GFP أو بيش-DsRed)، وIntegrase (pCH14011) على آجار LB لوحات تحتوي على كربنيسيلين (100 ميكروغرام / مل).
- من مستعمرة واحدة على لوحة آجار LB، تطعيم GV3101 سلالات بايواء ناقلات geminiviral إلى 3 مل من وسائل الإعلام YENB (0.75٪ Bacto خلاصة الخميرة، المرق المغذي 0.8٪، وضبط درجة الحموضة إلى 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) + الكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) في 15 مل جولة القاع أنبوب الثقافة، وتنمو ثقافة السائل عند 30 درجة مئوية فيشاكر بين عشية وضحاها مع 300 معدل دوران دورة في الدقيقة.
- وبالمثل، تطعيم وتنمو GV3101 سلالات بايواء ناقلات MagnICON في YENB وسائل الاعلام + كربنيسيلين (100 ميكروغرام / مل) في شاكر بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- قياس وتسجيل OD 600 القيم لكل ثقافة السائل مع مقياس الطيف الضوئي واستخدام الصيغة أدناه لحساب حجم الضرورية (V الفرعية) إلى أن subcultured لثقافة جديدة مع OD بدءا من 600 0.025 في 10 مل من وسائل الإعلام YENB مع المضادات الحيوية المناسبة .
V الفرعية (مل) = (10 مل) × (0.025) / OD 600 - نقل V الفرعية (مل) من الثقافة بين عشية وضحاها إلى (10 - V الفرعية) مل من وسائل الاعلام YENB بالمضادات الحيوية المناسبة لكل سلالة. تنمو ثقافة جديدة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في شاكر مع معدل دوران دورة في الدقيقة 250 حتى 600 OD القيمة هي في حدود 1،7-2،0.
- وسجل قياس OD 600 القيم لكل ثقافة السائلة واستخدام الصيغة أدناه لأحسبulate حجم الضرورية (V INF) إلى أن تضعف في 50 مل من العازلة تسلل لإعطاء OD النهائية 600 من 0.12 لكل سلالة.
V INF (مل) = (50 مل) × (0.12) / OD 600 - نقل V INF (مل) من كل ثقافة إلى أنبوب microcentrifuge وتدور باستمرار الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 12،000 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة طاف ثم resuspend الخلايا في 10 مل العازلة تسلل (10 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.5 و 10 ملي MgSO 4) قبل vortexing لفترة وجيزة.
- مزيج معلق خلايا pBYGFP + + pREP110 P19، وتدور الخلايا في أسفل 12،000 x ج لمدة 2 دقيقة، و resuspend في مجموعه 50 مل من العازلة تسلل. هذا المزيج Agrobacteria هو للتعبير geminiviral من GFP.
- وبالمثل، مزج التركيبات التالية من الخلايا Agrobacteria، وتدور باستمرار و resuspend لهم في 50 مل من العازلة تسلل. وهي تشمل (1) pBYDsRed + + pREP110 P19 للتعبير geminiviral من DsRed، (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 لgeminiviral شارك في التعبير عن GFP وDsRed، (3) pREp110 + P19 كما سيطرة سلبية من التعبير geminiviral، (4) بيش-GFP + + pICH15879 pCH14011 لMagnICON التعبير عن GFP، (5) بيش-DsRed + + pICH15879 pCH14011 لMagnICON التعبير عن DsRed، و (6) pICH15879 + pCH14011 كما سيطرة سلبية للتعبير MagnICON.
2.2 التحضير للتسلل فراغ
- تلقيح وثقافة كل سلالة GV3101 تحتوي على ناقلات geminiviral أو ناقلات MagnICON إلى 15 مل من وسائل الإعلام YENB مع المضادات الحيوية المناسبة في قارورة تعقيمها 50 مل وتنمو بين عشية وضحاها كما هو موضح لتسلل حقنة أعلاه.
- قياس وتسجيل OD 600 القيم لكل ثقافة السائل مع مقياس الطيف الضوئي واستخدام الصيغة أدناه لحساب حجم الضرورية (V الفرعية) إلى أن subcultured لثقافة جديدة مع OD 600 من انطلاق 0.025 في 250 مل من وسائل الاعلام YENB مع المضادات الحيوية المناسبة .
V الفرعية > (مل) = (250 مل) × (0.025) / OD 600 - نقل V الفرعية (مل) من الثقافة بين عشية وضحاها إلى (250 - V الفرعية) مل من وسائل الاعلام YENB في 1 L قارورة تعقيمها مع المضادات الحيوية المناسبة لكل سلالة وتنمو ثقافة جديدة بين عشية وضحاها كما هو موضح لتسلل حقنة أعلاه.
- وسجل قياس OD 600 القيم لكل ثقافة السائلة واستخدام الصيغة أدناه لحساب حجم الضرورية (V INF) إلى أن تضعف في 3 L من العازلة تسلل لإعطاء OD النهائية 600 من 0.12 لكل سلالة.
V INF (مل) = (3000 مل) × (0.12) / OD 600 - بيليه و resuspend V INF (مل) من كل ثقافة في المخزن تسلل كما هو موضح لتسلل حقنة ومزج الثقافات معلق وفقا لمجموعات وصفها لتسلل حقنة. Repellet الخلايا Agrobacteria مختلطة و resuspend لهم في 3 L من العازلة تسلل.
ق = "jove_title"> 3. تسلل
3.1 التسلل الحقنة
- اختيار أربعة 6 أسابيع من العمر N. النباتات benthamiana مع 5 يترك لكل منهما. سيتم تسلل الأوراق الثلاثة الأولى عد من أعلى كل مصنع تماما مع واحدة من مجموعات من A. المورمة سلالات في المخزن تسلل. وسوف تكون ورقة الرابعة بقعة تسللت مع كافة تركيبات سلالة أربعة للتعبير geminiviral أو كل ثلاثة مجموعات للتعبير MagnICON. سيتم تسللت ورقة مشاركة في كل مصنع مع مجموعات من ضوابط السلبية.
- إنشاء نيك صغيرة مع إبرة في البشرة على الجانب الخلفي من ورقة (الشكل 2A). انتباه: تأكد من عدم خدش من الصعب حتى على اختراق ورقة من خلال كلا الجانبين، حيث أن الخلايا Agrobacteria في خليط تسلل سوف تمر من خلال ثقب إلى الجانب الآخر من ورقة.
- اتخاذ اجراء حازم من الجانب الأمامي من ورقة وحين تقدم بطلب لطيفالضغط المضاد للنيك مع الإبهام من جهة، حقن خليط الأجرعية في المخزن تسلل إلى نيك مع حقنة من دون إبرة (الشكل 2B). ملاحظة: كما يدخل خليط الأجرعية المساحة بين الخلايا من ورقة، فإن منطقة تسلل يتحول إلى اللون الأخضر أكثر قتامة واضح (الشكل 2C).
- الاستمرار في حقن خليط الأجرعية في نيك حتى يتوقف دائرة خضراء داكنة في التوسع. خلق نيك أخرى وكرر الخطوات 3.1.2-3.1.4 حتى يتم تسلل ورقة بأكملها ورقة كاملة اللون الأخضر أكثر قتامة للأوراق الثلاثة الأولى ورقة الماضي.
- للأوراق الرابع من كل محطة، وسيتم تسللت كافة تركيبات أربعة (ناقلات geminiviral) أو ثلاثة (MagnICON ناقلات) في ذلك. جعل واحدة نيك لكل مزيج من سلالات الأجرعية، والتسلل كل نيك مع تركيبة واحدة.
- بعد تسلل، نقل النباتات مرة أخرى إلى غرفة النمو ومونيتور تعبير البروتين بين 2-15 أيام آخر تسلل (نقطة في البوصة).
3.2 التسلل فراغ
- وضع الحوض في مجفف فراغ ونقل 3 L العازلة تسلل تحتوي على سلالات الأجرعية إلى الحوض. ربط المجفف إلى Vacuubrand الحجاب الحاجز مضخة فراغ (الشكل 3A).
- وضع محطة رأسا على عقب على لوحة المجفف (الشكل 3B) وخفض لوحة مع المصنع حتى يتم المغمورة ورقة بأكملها ونظام الجذعية في المخزن المؤقت تسلل مع لوحة يستريح على قمة من الحوض. وضع مجفف يا عصابة على طول الحافة ووضع غطاء على مجفف الدائرة (الشكل 3C).
- بدوره على مضخة فراغ وبدء توقيت عندما الفراغ تصل إلى 100 م بار. فتح ببطء صمام الإفراج عن مجفف بعد 1 دقيقة في 100 م بار للسماح مدخل Agrobacteria في المساحات الخلالي من الأنسجة النباتية المغمورة. كرر هذه الخطوة واحدة additiالوقت اونال لضمان تسلل جيدة.
- بعد تسلل، واتخاذ مصنع للخروج من مجفف وضعه مرة أخرى إلى مكانتها في وضع مستقيم. نقل النباتات مرة أخرى إلى غرفة النمو ورصد بروتين تعبير بين 2-15 نقطة في البوصة.
4. فلوري كشف عن البروتين والتصوير الفوتوغرافي
- ابتداء من 2 نقطة في البوصة، والنباتات الانتقال إلى غرفة مظلمة وتألق ضوء الأشعة فوق البنفسجية على الجانب الخلفي من أوراق تسللت مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد.
- مراقبة مضان أخضر من GFP أو مضان أحمر من DsRed. GFP يعطي قبالة إشارة أقوى مع طويلة موجة الأشعة فوق البنفسجية، في حين DsRed أقوى تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة.
- التقاط صور لأوراق الفلورسنت مع كاميرا رقمية عادية مع عدم وجود فلاش.
- نقل النباتات مرة أخرى إلى غرفة النمو بعد مراقبة أو التصوير الفوتوغرافي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. التعبير عن البروتينات الفلورية تسلل الحقنة
للتدليل على فعالية تسلل حقنة من الأجرعية في الأنسجة النباتية، اختبرنا التعبير عن اثنين من البروتينات الفلورية - GFP وDsRed - من قبل اثنين من مختلف فككت محطة ناقلات فيروسية - geminiviral وMagnICON - في N. benthamiana. لN. أوراق benthamiana التي كانت مخترقة تماما مع Agrobacteria ناقلات geminiviral المحتوية على ذلك، لوحظ GFP التعبير على مساحة الورقة بأكملها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بدءا في وقت مبكر من 2 نقطة في البوصة وصلت ذروة تراكم في 4 نقطة لكل بوصة (الشكل 4C). هذا التعبير GFP في وقت مبكر عن طريق ناقلات geminiviral يتسق مع النتائج السابقة من البروتينات المؤتلف أخرى 14،16،18،19. في المقابل، يترك تسللت مع MagnICON ناقلات التي تحتوي على تركيبات الأجرعية أظهرت GFP مضان فقط بعد 5 نقطة في البوصة وصلت إلى الحد الأقصى لها accumulatiفوق في 7 نقطة في البوصة (الشكل 4D). لم يلاحظ أي مضان أخضر من أوراق تسللت مع سيطرة سلبية الأجرعية خليط من pREP110 + P19 (الشكل 4B) أو pICH15879 + pCH14011 (لا تظهر البيانات)، مشيرا الى ان مضان كان محددا لهذا الجين GFP وليس نتيجة من مضان الخلفية من الأوراق. في تراكمه الذروة، ومضان من MagnICON ناقلات التي تبديها GFP هو أكثر كثافة من تلك التي من ناقلات geminiviral (الشكل 4C و 4D)، على غرار النتائج التي تم الحصول عليها سابقا عن البروتينات المؤتلف الأخرى 8،18. نمط التعبير الزمنية وشدة الفلورسنت النسبي للDsRed هي مماثلة لتلك التي GFP (لا تظهر البيانات). لم يلاحظ أي نخر كبير على أوراق تسللت مع يبني GFP (الشكل 4A). وقد لوحظت نتائج مماثلة أيضا لDsRed، معربا عن النباتات، مشيرا إلى أنه لا بروتين فلوري شديد السمية للنبات CELLS. ومع ذلك، لوحظ تنخر المحلية في موقع نيك وأنها ظهرت باسم "الثقوب" في الصور (الشكل 4). عندما أبديت كل من البروتينات الفلورية على نفس ورقة النواقل geminiviral مع حقنة موضعية تسلل، تم الكشف عن أنهم مع لونها الفلورسنت المتوقعة في البقعة حيث تم اختراقها من (الشكل 5). ومن المثير للاهتمام، أسفرت المشترك تسلل GFP وDsRed في مضان مصفر (الشكل 5). ظهرت كثافة مضان DsRed أن يكون أضعف من أن من GFP على نفس الورقة. ومع ذلك، قد لا يعكس التعبير أضعف من DsRed، ولكن نظرا بدلا من ذلك إلى إثارة أقل من المستوى الأمثل من DsRed بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وعموما، نتائجنا تثبت أن تسلل حقنة يدخل بكفاءة المؤتلف الجينات التي تحمل Agrobacteria في أوراق النبات وأسفرت عن التعبير قوية من البروتينات هدفنا. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن هذا الأسلوب يسمح للflexibilإيتي إما التسلل أوراق كامل لتراكم القصوى من البروتين هدف واحد أو لبقعة التسلل أهداف البروتين متعددة مع ناقلات متعددة لمقارنة التعبير ونمط التعبير.
2. التعبير عن البروتينات الفلورية تسلل فراغ
تم فحص تسلل الفراغ أيضا إلى تطوير طريقة agroinfiltration قابلة للتطوير والتي يمكن استخدامها لإنتاج على نطاق واسع من البروتينات المؤتلف من قبل أنظمة التعبير عابر النبات. نتائجنا تشير الى ان نمط التعبير الزماني للGFP أو DsRed بواسطة geminiviral وMagnICON نواقل لم يتم تغييرها من قبل تغيير طريقة التسلل وظلت مماثلة لتلك التي تسلل حقنة. كما هي غارقة في تبادل لاطلاق النار كامل من مصنع في خليط تسلل خلال تسلل فراغ، لوحظ مضان GFP ل(الشكل 6) لجميع أوراق النباتات تسلل. مقارنة مع تسلل حقنة، بل هو أكثر قوة ويمكن ACتسلل hieve من كل مصنع مع إطار زمني أقصر بكثير. على سبيل المثال، فإنه يأخذ الطالب المهرة 15 دقيقة إلى حقنة واحدة التسلل بأكمله 6 أسابيع من العمر N. benthamiana النبات. في المقابل، فإن نفس النبات يمكن تسللت في 3 دقائق من فراغ من البداية الى النهاية، ويمكن أن تسلل النباتات متعددة في نفس الوقت.
الشكل 1. N. نمو النبات benthamiana مع الكريات الخث والصواني النمو. النباتات البرية من نوع عند 0 (A)، 2 (ب) و 4 (ج) و 6 (D) أسابيع بعد البذر.
الشكل 2. تسلل حقنة من N. benthamiana يتركمع المورمة الأجرعية. سلالة GV3101 من A. كان معلق المورمة إيواء GFP، معربا عن ناقلات MagnICON في المخزن تسلل وتحميلها في حقنة من دون إبرة. تم إنشاء نيك بإبرة على الجانب الخلفي من ورقة نبات من العمر 6 أسابيع (A). كان وضعه افتتاح حقنة ضد نيك (B) وAgrobacteria في المخزن تسلل تم حقنها في الفضاء بين الخلايا من ورقة عبر نيك (C).
الشكل (3). تسلل الفراغ من N. benthamiana يترك مع المورمة الأجرعية. سلالة GV3101 من A. كان معلق المورمة التي تحتوي على الهدف ناقلات البروتين، معربا عن في infiltratioن العازلة وتحميلها في حوض L 3. ثم وضعت الحوض في مجفف الفراغ الذي كان متصلا إلى مضخة فراغ (A). وضعت نبات 6 أسابيع القديمة رأسا على عقب على لوحة المجفف (B). ثم المغمورة ورقة بأكملها ونظام الجذعية في الحوض كما تم وضع لوحة فوق الدائرة (C). وقد تحقق Agroinfiltration من خلال تطبيق والإفراج عن فراغ في 100 م بار مرتين لمدة 1 دقيقة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. التعبير عن GFP في حقنة agroinfiltrated الأوراق. N. بأكملها كانت مخترقة الأوراق benthamiana مع سلالة GV3101 من A. المورمة ايواء الجين GFP في geminiviral (A و C) أو MagnICON vectأو (D). وقد تسللت خارج سيطرة سلبية مع سلالات Agrobacteria التي لا تحتوي على هذا الجين GFP (B). صورت الأوراق تحت الضوء الأبيض (A) أو الأشعة فوق البنفسجية (BD) في 4 نقطة لكل بوصة (AC) أو 7 نقطة في البوصة (D).
الشكل 5. التعبير عن GFP وDsRed في حقنة يترك بقعة agroinfiltrated. N. كانت أوراق benthamiana بقعة تسللت مع GV3101 إيواء GFP، DsRed، أو كليهما GFP DsRed والجينات في ناقلات geminiviral. تم اختراق بقعة السيطرة السلبية مع pREP110 + P19. صورت الأوراق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 4 نقطة لكل بوصة.
الشكل (6). التعبير عن GFP في فراغ agroinfilأوراق trated. N. كانت مخترقة الأوراق benthamiana مع GV3101 ايواء الجين GFP في ناقلات MagnICON. صورت الأوراق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 7 نقطة في البوصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطلبات المتزايدة للادوية القائم على البروتين تتطلب في جميع أنحاء العالم منصات الإنتاج الجديدة التي هي قوية وقابلة للتطوير، منخفضة التكلفة وآمنة. وقد أظهرت النباتات لتكون واحدة من نظم الإنتاج البديلة الواعدة لإنتاج البروتين الصيدلانية. في السنوات الأخيرة، وتطوير فككت ناقلات القائم على الفيروس وقد مكن التعبير عابرة من البروتينات في النباتات، مما يعزز كثيرا من سرعة وإنتاجية النظم التعبير النبات 2،10. لمزيد من تعظيم فائدة من نظام التعبير عابرة، ونحن يبرهن على وجود نهج بسيطة لكنها فعالة وقابلة للتطوير لإدخال الجينات التي تحتوي على الهدف الأجرعية في الأنسجة النباتية. نتائجنا تشير إلى أن agroinfiltration إما مع حقنة أو فراغ وقد أدى الأسلوب في مقدمة كفاءة الأجرعية في أوراق النبات وإنتاج قوي من اثنين من البروتينات الفلورية، GFP وDsRed.
لضمان efficieNT agroinfiltration وإنتاج البروتين، المعلمات الهامة التالية يجب ان تسيطر عليها بعناية. الانحراف عن هذه المعايير قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة agroinfiltration وبدوره، اخفض مستوى الهدف تعبير البروتين.
1. المرحلة التنموية صحة النبات و. المتغير الأكثر احتمالا في هذه الطريقة بين المختبرات هو المادة النباتية للتسلل. بينما قد تظهر النباتات مشابهة ظاهريا، ومرحلة نموهم والحالة الفسيولوجية تؤثر على كفاءتهم في التعبير عن البروتينات المؤتلف بشكل ملحوظ. معايير محددة والتي لها آثار على نمو النبات ومستويات بروتين تعبير تشمل درجة الحرارة والرطوبة وشدة الضوء، وإمدادات من الأسمدة، العمر تلقيح النبات، والوقت اللازم لأقصى قدر من تراكم البروتين الهدف بعد تسلل ورقة. النباتات يجب أن يتلقى باستمرار كميات متساوية من المياه والأسمدة يوميا. تغييرات طفيفة في ظروف نمو النبات قد تتغير بشكل كبير من الاحجام النهائي(ه) من النباتات وقدرتها على التعبير عن البروتينات المؤتلف. وتشير دراساتنا السابقة أن النباتات التي تزرع تحت الضوء الطبيعي أسفرت عن أكثر رقة الكتلة الحيوية، ولكن العائد البروتين هو أقل من ذلك بكثير نمت تحت الضوء الاصطناعي 4. ولذلك، باستخدام الضوء الاصطناعي هو الأسلوب المفضل لنمو النبات. نتائجنا تظهر أيضا أن ساعة ضوء / 8 ساعة دورة الظلام 16 في 25 ± 0.5 ° C هو الشرط الأمثل لتنمو N. النباتات benthamiana في ظل هذه الاصطناعي الإضاءة 4. أثبتنا أنه في ظل هذه الظروف، والنباتات 6 أسابيع هي عمر الأمثل لGFP DsRed والتعبير لأنها تنتج مستويات عالية من البروتينات الفلورية في حين أن العائد الكتلة الحيوية كافية. النباتات أقدم من 6 أسابيع انتاج المزيد من الكتلة الحيوية ولكن طويل القامة جدا لتناسب في غرفة تسلل 4. وبالإضافة إلى ذلك، والزهور تبدأ في النمو بعد 6 أسابيع من النمو، مما يؤثر سلبا المؤتلف البروتين التعبير 4. ونتيجة لذلك، والنباتات 6 أسابيع تحتوي على لتر الأمثلالمواد EAF أن يوازن بين الحاجة المشتركة لمحصول الكتلة الحيوية، وتراكم البروتين، وسهولة agroinfiltration.
2. النمو وتركيز تسلل الأجرعية. آخر نقطة رئيسية في هذه المنهجية هو السيطرة على النمو وتركيز تسلل A. المورمة، مقاسا OD 600. في كل خطوة الثقافة وثقافة فرعية، سلالات A. يجب أن تزرع المورمة، ولكن ليس على OD المعين 600. اطلعنا تركيزات متعددة من A. المورمة للتسلل النهائي من N. benthamiana يترك 4. سوف تركيز الأجرعية منخفضة تؤدي إلى تسليم كافية من الجينات المستهدفة في النباتات، مما يؤدي إلى انخفاض بروتين تعبير. من ناحية أخرى، إذا كان تركيز تسلل الأجرعية مرتفع جدا، وسوف تثير رد فعل شديد الحساسيه في الأنسجة تسلل ويؤدي إلى نخر 20. لدينا Rأظهرت esults أن OD 600 = 0.12 الأجرعية سلالة يوازن بين الحاجة لتسليم الأقصى من بناء الجين دون التسبب في نخر الأنسجة وموت الخلايا. المطلوب OD 600 كثافة الأجرعية يمكن الحصول عليها باستخدام وسائل الإعلام ثقافة متسقة، ودرجة الحرارة والوقت والثقافة.
3. لتسلل فراغ، فمن المهم اتباع الضغط فراغ المعينة ومدة تسلل. نتائجنا تشير الى ان واحد 3 L حوض من خليط الأجرعية تسلل يمكن استخدامها لاختراق ما يقرب من 30 محطة. إذا تحتاج إلى أكثر من 30 مصانع لتكون مخترقة، دفعة جديدة من خليط تسلل الأجرعية يتعين توريدها.
4. يتم تحسين معايير محددة المعروضة في هذه الورقة للتعبير عن البروتينات باستخدام N. النباتات benthamiana نمت في ظل الظروف المحددة الموصوفة أعلاه مع فككت ناقلات القائم على الفيروس. كما نوقش في وقت سابق، رانه المعلمة الأكثر صعوبة في السيطرة في هذه المنهجية هو المواد النباتية. لقد أعربنا عن مجموعة متنوعة من اللقاحات والبروتينات العلاجية باستخدام النباتات وإجراء عمليات التسلل وصفنا هنا والحصول على نتائج ممتازة في جميع الحالات 4،8،14،18،21-23. وأظهرت هذه النتائج أن الظروف وضعنا هي الأمثل للتعبير البروتين. ومع ذلك، إذا الأنواع المختلفة النبات المستضيف، ناقلات التعبير، أو مختلفة N. واستخدمت ظروف النمو Benthamiana للتسلل، فإن كل معلمة في هذه المنهجية تحتاج إلى إعادة الأمثل من خلال التجارب.
وعموما، لقد أثبتنا أن agroinfiltration مع حقنة والفراغ هي منهجية بسيطة لكنها فعالة لإدخال الجين المستهدف تحمل الأجرعية في النباتات للتعبير عابر من البروتينات المؤتلف. كل الطرق لها مزاياها الفريدة اعتمادا على الهدف من البحث والإنتاج. تسلل حقنة بسيطة، اشتراطاتES فقط كميات صغيرة من ثقافة الأجرعية وليس بحاجة مضخات مكلفة وغرف فراغ. كما هو موضح في هذا التقرير، فإنه لديه المرونة لإما التسلل إلى ورقة كاملة مع الجين المستهدف واحد أو استخدام تسلل بقعة لإدخال جينات من أهداف متعددة على ورقة واحدة. كامل طريقة تسلل ورقة يمكن استخدامها لمختبر صغير التعبير مقياس من البروتين المؤتلف لتوصيف بهم الكيمياء الحيوية، وتنقية، والدراسات الفنية قبل السريرية 1. في المقابل، تسلل بقعة يمكن استخدامها للتعبير عن الأهداف البروتين متعددة على ورقة واحدة للمقارنة عوائدها، حركية التعبير وسمية للنباتات. ويمكن أيضا أن تستخدم لمقارنة التعبير عن واحد من البروتين مراسل مثل GFP أو DsRed يقودها ناقلات التعبير المختلفة على نفس الورقة. ونتيجة لذلك، فإن قدرة النواقل المختلفة في دفع تراكم البروتين وحركية التعبير عنها يمكن وصفها. بساطة تسلل حقنة تمكن أيضا عليهأداة مجدية لتعليم وتدريب طلاب المدارس الثانوية والجامعية في موضوع التكنولوجيا الحيوية والهندسة الوراثية.
في مقارنة مع تسلل حقنة، تسلل الفراغ يتطلب الاستثمار من مضخات التفريغ والدوائر وكميات أكبر من الثقافات الأجرعية. ولذلك، فإنه ليس الأسلوب المفضل عندما تحتاج فقط عدد قليل من النباتات لتكون مخترقة. ومع ذلك، لأنها توفر التدرجية التي لا يمكن أن يقابله تسلل حقنة. فمن أكثر قوة ويمكن التسلل أعداد كبيرة من النباتات في فترة قصيرة من الزمن. مع حجم المقدمة في هذا التقرير، ونحن قادرون على انتاج المستوى غرام من البروتينات المنقى الأدوية كافية لمرحلة أنا الإنسان السريرية محاكمة 4. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه العملية المزيد من تحجيم المتابعة للتصنيع التجاري من البروتينات الدوائية من النباتات. على سبيل المثال، يجري تصميم العمليات لفراغ تسلل ثلاثة طن متري من N. النباتات benthamiana للساعة الواحدةفي عملية نطاق المتابعة 24. ميزة أخرى لتسلل الفراغ هو أنه يمكن استخدامها لagroinfiltrate الأنواع النباتية التي ليست قابلة للتسلل حقنة.
وباختصار، فإن الجمع بين حقنة وتسلل فراغ يوفر الباحثين والتقانات الحيوية والمربين منهجية بسيطة وفعالة وقوية وقابلة للتعبير عابر من البروتينات المؤتلف في النباتات. وسيسهل بشكل كبير في تطوير وإنتاج البروتينات الدوائية وتعزيز تعليم العلوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تتنافس المصالح المالية.
Acknowledgments
نشكر R. الشمس وغيرهم من الطلاب من مختبر تشن لمساهمتهم في محطة توليد المواد. نحن أيضا نشكر الدكتور D. الأخضر لدعمه من البحوث الجامعية في كلية التكنولوجيا والابتكار (سي تي أي). وأيد هذا البحث في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI075549 U01 و1R21AI101329 إلى Q. تشن، ومنحة SSE من CTI من جامعة ولاية أريزونا إلى Q. تشن. K. يوزنغر، M. دنت، J. هورتادو، وJ. Stahnke هي طلاب المرحلة الجامعية بدعم من منحة SSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
