Effektiv Agroinfiltration af planter til højt niveau transient ekspression af rekombinante proteiner
Summary
Planter tilbyder en roman system til produktion af farmaceutiske proteiner i kommerciel målestok, der er mere skalerbar, omkostningseffektiv og sikker end de nuværende udtryk paradigmer. I denne undersøgelse rapporterer vi en enkel og bekvem, men skalerbar fremgangsmåde til at indføre mål-gen indeholdende<em> Agrobacterium tumefaciens</em> I planter til protein forbigående ekspression.
Abstract
Pattedyrcellekultur er den vigtigste platform til kommerciel produktion af humane vacciner og terapeutiske proteiner. Men det kan ikke imødekomme den stigende globale efterspørgsel efter lægemidler på grund af sin begrænsede skalerbarhed og høje omkostninger. Planter har vist sig at være en af de mest lovende alternative farmaceutiske produktionsanlæg platforme, der er robust, skalerbar billig og sikker. Den seneste udvikling af virus-baserede vektorer har tilladt hurtig og højt niveau forbigående ekspression af rekombinante proteiner i planter. For yderligere at optimere anvendeligheden af den forbigående ekspression system vi vise en enkel, effektiv og skalerbar metode til at indføre mål-gen indeholdende Agrobacterium i plantevævet i denne undersøgelse. Vores resultater viser, at agroinfiltration med både sprøjten og vakuum metoder har resulteret i en effektiv indførelse af Agrobacterium til blade og robust produktion af to fluorescerende proteiner, GFP og DsRed. Endviderevi demonstrere de unikke fordele ved begge metoder. Sprøjte infiltration er enkel og behøver ikke dyrt udstyr. Det giver også fleksibilitet til enten infiltrere hele ferie med et målgen, eller at indføre gener af flere mål på et blad. Således kan det anvendes til laboratorie skala ekspression af rekombinante proteiner samt for at sammenligne forskellige proteiner eller vektorer for udbytte eller ekspression kinetik. Enkeltheden i sprøjten infiltration også antyder dens anvendelighed i high school og college uddannelse for emnet bioteknologi. I modsætning hertil er vakuum infiltration mere robust og kan skaleres op til kommerciel fremstilling af farmaceutiske proteiner. Det giver også den fordel, at kunne agroinfiltrate plantearter, der ikke er modtagelig for injektionssprøjte infiltration såsom salat og Arabidopsis. Samlet set kombinationen af sprøjten og vakuum agroinfiltration giver forskere og undervisere en enkel, effektiv og robustmetode til forbigående proteinekspression. Det vil i høj grad fremme udviklingen af farmaceutiske proteiner og fremme videnskabelig uddannelse.
Introduction
Siden 1970'erne har planterne blevet udforsket som alternativer til pattedyr, insekter, og bakterielle cellekulturer til kommerciel produktion af rekombinante proteiner og protein terapi 1.. Plant-baserede systemer til ekspression af biofarmaceutiske har vist lovende i de seneste år, da flere nye behandlinger for sygdomme, ligesom Gauchers sygdom 2 og aviær H5N1 influenza 3, har haft succes i kliniske forsøg. Udviklingen af kompetente mekanismer for rekombinant protein ekspression i planter I årtier siden disse indledende eksperimenter har skabt potentiale for plante-baserede systemer til at ændre den nuværende paradigme af protein produktion i tre primære grunde. Det første er der en mærkbar nedgang i omkostningerne som pattedyr-, insekt-og bakterielle bioreaktorer kræver betydelige startomkostninger, dyre vækstmedier og komplicerede processer til nedstrøms oprensning 4.. Oprettelsen af en stabil transgen plantelinjer giver dem også mulighed for at overhale skalerbarheden i andre ekspressionssystemer som protein udtrykker planter kunne dyrkes og høstes på en landbrugs-skala 5.. Andet plante-ekspressionssystemer reducere risikoen for overførsel af et menneske eller dyr patogen fra protein-udtrykkende vært til mennesker, viser overlegenhed i offentlig sikkerhed 6.. Endelig anlæg anvende en eukaryot endomembrane system, der svarer til pattedyrceller, der giver mulighed for korrekt posttranslationel modifikation af proteiner, herunder glycosylering og montering af flere underenhedsproteiner 7. Denne evne sætter plante-baserede systemer forud for dem, der bygger på prokaryote systemer, såsom bakterier, eftersom en bredere række af farmaceutiske rekombinante proteiner, herunder monoklonale antistoffer (mAb'er), har en mere kompliceret struktur og kræver omfattende posttranslationelle modifikationer eller montage 8..
Der er to store hensigtssmerter at udtrykke rekombinante proteiner i planter. Den første er udviklingen af en stabilt transgen linie, hvor DNA, der koder for målproteinet klones ind i en ekspressionskassette og introduceret til enten de nukleare eller chloroplast genomer. Herved bliver det fremmede DNA arvelige gennem efterfølgende generationer og giver mulighed for voldsomt forbedret skalerbarhed, langt ud over, at andre ekspressionssystemer 1.. Introduktion af eksogent DNA til kernegenomet opnås sædvanligvis ved Agrobacterium tumefaciens infektion af plantevæv eller, sjældnere, ved mikroprojektilbombardement af vævet 9. Plantehormoner anvendes derefter til at inducere differentiering og vækst af transgene plantevæv såsom rødder og blade. Transformation af kloroplast-genomet ikke kan opnås med A. tumefaciens, men beror udelukkende på guld eller tungsten partikler belagt med DNA fyret ballistisk i planteceller. Den anden metode til at udtrykke recombinant-protein i planter er gennem forbigående ekspression 10.. I dette scenario er virus-afledte vektorer huser genet af interesse leveret via A. tumefaciens til fuldt udviklede planter gennem en proces, der kaldes agroinfiltration. Stedet for at integrere i plantegenomet, vil den leverede genkonstruktion derefter begynde at lede forbigående produktion af det ønskede protein, der kan høstes og isoleres efter en kort inkubationstid. Forbigående genekspression tilbyder fordelen ved større samlet protein akkumulering samt en forbedret cirka proteinproduktion, som planter vil være klar til høst ca 1-2 uger efter agroinfiltration 11. Det er betydeligt hurtigere end de processer af produktion, udvælgelse, og bekræftelse af stabile transgene plante linjer, som kan tage flere måneder til et år. Dette er imidlertid også den begrænsning af forbigående ekspression systemet, da det ikke vil give genetisk stabil plante liian, der kan bruges til at generere en frøbank for omfattende kommerciel produktion. Alligevel har fremgangsmåder blevet udviklet til at forbedre stor skala transient ekspression. Her viser vi en metode generation af forbigående protein-udtrykkende Nicotiana benthamiana planter ved hjælp af dekonstruerede virale vektorer leveret af A. tumefaciens.
To store metoder er blevet udviklet til levering af A. tumefaciens til plantevæv: bænk skala infiltrering via sprøjte og omfattende infiltration via vakuumkammeret. Begge protokoller er beskrevet her med N. benthamiana, som er nært beslægtet med den fælles tobaksplanten, som værtsplanten til transient ekspression af to fluorescerende proteiner: det grønne fluorescerende protein (GFP) fra goplen Aequorea victoria og rødt fluorescerende protein fra Discosoma koral (DsRed) 12,13. N. benthamiana er den mest almindelige værtsplante forrekombinant protein, fordi det er muligt at foretage en genetisk transformation, kan give store mængder af biomasse hurtigt, og er en produktiv frøproducent for opskalering produktion 14.. En anden fordel ved at bruge N. benthamiana som værter for protein-ekspression er tilgængeligheden af en række ekspressionsvektorer 2,5. I denne undersøgelse, to deconstructed virusvektorer ene bygger på en tobak (TMV) RNA replicon-systemet (MagnICON vektorer) og den anden stammer fra bønne gul dværg virus (BeYDV) DNA replicon-systemet (geminiviral vektorer) 4,11, 15-18, anvendes til at udøve GFP og DsRed gen og levere dem i N. benthamiana celler via A. tumefaciens. Tre DNA-konstruktioner vil blive anvendt til GFP eller DsRed udtryk med MagnICON vektorer. De omfatter 5'modulet (pICH15879) indeholdende promotoren og andre genetiske elementer til at drive ekspressionen af målgenet, 3'modul indeholdende genet af interesse (Pich-GFP eller Pich-DsRed), og integrase modul (pICH14011) koder for et enzym, der integrerer 5'-og 3'-modulerne sammen efter ekspression 8,15. Tre DNA-konstruktioner er også behov for ekspression med geminiviral vektorer. Ud over vektorer indeholdende replikon af målgenet (pBYGFP eller pBYDsRed), en vektor der koder for replikation proteinet (pREP110) kræves til opformering af målet replikon 11,14,16. Desuden er inddragelsen af en vektor der koder for tavshed suppressor p19 fra tomat busket stunt virus ønsket for højt niveau målgenekspression 11,16.
Der er generelt tre vigtige skridt for indførelse af gener af rekombinante proteiner i planteceller ved agroinfiltration herunder plantevækst A. tumefaciens kultur forberedelse, og infiltration. Da hvert skridt er afgørende for den ultimative succes af denne procedure derfor en detaljeret beskrivelse for hver givesbåde sprøjten infiltration og vakuum infiltration nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
De stigende krav til proteinbaserede lægemidler på verdensplan kræver nye produktionsplatforme, der er robuste, skalerbar, billige og sikker. Planter har vist sig at være en af de mest lovende alternative produktionssystemer til farmaceutisk proteinproduktion. I de senere år har udviklingen af deconstructed virus-baserede vektorer aktiveret forbigående ekspression af proteiner i planter, hvilket i høj grad øger hastigheden og udbyttet af plante ekspressionssystemer 2,10. For yderligere at optime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker R. Solen og andre studerende i Chens Laboratorium for deres bidrag til plantemateriale generation. Vi takker også Dr. D. Green for hans støtte til bachelor forskning i kollegiet for Teknologi og Innovation (CTI). Denne forskning blev støttet delvist af NIH tilskud U01 AI075549 og 1R21AI101329 til Q. Chen og en SSE bevilling fra CTI of Arizona State University til Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado og J. Stahnke er studerende understøttes af SSE tilskud.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
