Summary
Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende introduceren
Abstract
Zoogdiercelculturen is het belangrijkste platform voor de commerciële productie van humane vaccins en therapeutische eiwitten. Het kan echter niet voldoen aan de toenemende wereldwijde vraag naar geneesmiddelen vanwege de beperkte schaalbaarheid en hoge kosten. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve farmaceutische productieplatforms die robuust, schaalbaar, goedkoop en veilig. De recente ontwikkeling van virus-gebaseerde vectoren is toegestaan snelle en hoog-niveau transiënte expressie van recombinant eiwitten in planten. Verder optimaliseren van de bruikbaarheid van het tijdelijke expressiesysteem, demonstreren we een eenvoudig, efficiënt en schaalbaar methodologie om target-gen dat Agrobacterium introduceren in plantenweefsel in deze studie. Onze resultaten geven aan dat zowel agroinfiltration spuit en vacuüm methoden hebben geleid tot de efficiënte introductie van Agrobacterium in bladeren en levenskrachtige twee fluorescerende eiwitten, GFP en DsRed. VoortsWe tonen de unieke voordelen van beide methoden. Spuit infiltratie is eenvoudig en dure apparatuur hoeft niet. Ook kan de flexibiliteit om ofwel infiltreren gehele verlaten met een doelgen, of genen van meerdere doelen voeren op een blad. Zo kan het worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek expressie van recombinante eiwitten en voor verschillende eiwitten of vectoren waarin voor yield of expressie kinetiek. De eenvoud van de spuit infiltratie suggereert ook haar nut in de middelbare school en universiteit onderwijs voor het vak van de biotechnologie. Daarentegen, vacuüm infiltratie meer robuust en opgeschaald voor commerciële vervaardiging van farmaceutische eiwitten. Het biedt ook het voordeel van het kunnen plantensoorten die niet vatbaar is voor spuit infiltratie zoals sla en Arabidopsis zijn agroinfiltrate. Kortom, de combinatie van spuit en vacuüm agroinfiltration biedt onderzoekers en docenten een eenvoudige, efficiënte en robuustemethodologie voor transiënte eiwitexpressie. Het zal veel gemakkelijker de ontwikkeling van farmaceutische eiwitten en bevorderen van wetenschappelijk onderwijs.
Introduction
Sinds 1970 zijn planten onderzocht als alternatieven voor zoogdieren, insecten en bacteriële celculturen voor de commerciële productie van recombinant proteïnen en therapeutische eiwitten 1. Plant-gebaseerde systemen voor de expressie van biofarmaceutische producten hebben aangetoond belofte in de afgelopen jaren een aantal nieuwe behandelingen voor ziekten, zoals de ziekte van Gaucher 2, en aviaire influenza H5N1 3, succesvol zijn gebleken in klinische onderzoeken. De ontwikkeling van competente mechanismen voor recombinante eiwitexpressie in planten in de decennia aangezien deze eerste experimenten heeft het potentieel voor plantaardige systemen voor het huidige paradigma van eiwitproductie aanpassen voor drie primaire redenen. Ten eerste is er een opmerkelijke afname in kosten bij zoogdieren, insecten en bacteriële bioreactoren vereisen aanzienlijke opstartkosten, duur groeimedia en gecompliceerde processen voor stroomafwaartse zuivering 4. De oprichting van stabiele transgene plantlijnen laat hen ook om de schaalbaarheid van andere expressie systemen overtreffen als eiwit expressie planten kunnen worden geteeld en geoogst op een agrarische schaal 5. Ten tweede, plantaardige expressiesystemen het risico op het overdragen van een mens of dier pathogeen het eiwit tot expressie gastheer voor mensen te verminderen, waaruit superioriteit openbare veiligheid 6. Tenslotte planten gebruik van een eukaryoot endomembranesysteem dat vergelijkbaar zoogdiercellen, waardoor goede post-translationele modificatie van eiwitten zoals glycosylering en de montage van meerdere-subeenheideiwitten 7. Dit vermogen geeft plantaardige systemen voordat deze basis prokaryotische systemen, zoals bacteriën, aangezien een groter aantal farmaceutische recombinante eiwitten, waaronder monoklonale antilichamen (mAbs) hebben een ingewikkeldere structuur en vereisen uitgebreide posttranslationele modificaties of assembly 8.
Er zijn twee belangrijke passendpijn tot de uiting van recombinante eiwitten in planten. De eerste is de ontwikkeling van een transgene lijn stabiel, waarbij DNA dat codeert voor het doeleiwit wordt gekloneerd in een expressie cassette en ingevoerd om de nucleaire en chloroplastgenomen bedoeld. Daarbij, het vreemde DNA wordt erfelijk door opvolgende generaties en zorgt voor enorm verbeterde schaalbaarheid, veel verder dan die van andere systemen meningsuiting 1. Introductie van exogeen DNA aan het nucleaire genoom wordt gewoonlijk bereikt door Agrobacterium tumefaciens infectie van plantenweefsel of, minder vaak, door microprojectielbombardement van het weefsel 9. Plantenhormonen worden vervolgens gebruikt om differentiatie en groei van transgene plantenweefsel zoals wortels en bladeren induceren. Transformatie van de chloroplast genoom kan niet worden bereikt met A. tumefaciens, maar vertrouwt volledig op goud of wolfraam deeltjes bekleed met DNA afgevuurd ballistisch in plantencellen. De tweede methode van het uiten van recombinatient in planten is door tijdelijke expressie 10. In dit scenario worden virus afgeleide vectoren herbergen het gen van belang geleverd via A. tumefaciens tot volledig ontwikkelde planten door middel van een proces genaamd agroinfiltration. In plaats van integratie in het plantengenoom, wordt de geleverde genconstruct dan beginnen direct de tijdelijke productie van het gewenste eiwit, die kunnen worden geoogst en geïsoleerd na een korte incubatieperiode. Transiënte genexpressie biedt het voordeel van een grotere totale eiwit accumulatie en een verbeterde tijd eiwitproductie, zoals planten direct ongeveer 1-2 weken na oogsten agroinfiltration 11 zal zijn. Dit is aanzienlijk sneller dan de processen van productie, selectie, en de bevestiging van stabiele transgene plant lijnen, die enkele maanden kan duren tot een jaar. Dit is echter ook de beperking van het tijdelijke expressiesysteem, omdat het niet zal opleveren genetisch stabiele plantaardige lines die kunnen worden gebruikt om een zaadbank voor grootschalige commerciële productie genereren. Desondanks zijn methoden ontwikkeld om grootschalige tijdelijke expressie verbeteren. Hier laten we zien een methode van generatie van voorbijgaande proteïne-expressie Nicotiana benthamiana planten met behulp gedeconstrueerd virale vectoren door A. geleverd tumefaciens.
Twee belangrijke methoden ontwikkeld voor de levering van A. tumefaciens in plantenweefsel: bench schaal infiltratie via een injectiespuit en grootschalige infiltratie via de vacuümkamer. Beide protocollen worden beschreven met N. benthamiana, die nauw verwant is aan de gemeenschappelijke tabaksplant, zoals de waardplant voor transiënte expressie van twee fluorescerende eiwitten: het groen fluorescerend eiwit (GFP) van kwallen Aequorea Victoria en de rode fluorescente eiwit uit Discosoma koraal (DsRed) 12,13. N. benthamiana is de meest voorkomende waardplant voorrecombinant eiwit omdat het vatbaar is voor genetische transformatie kunnen grote hoeveelheden biomassa snel leveren en is een vruchtbare zaad producent opschaling productie 14. Een ander voordeel van N. benthamiana als gastheren voor eiwitexpressie is de beschikbaarheid van een verscheidenheid van expressievectoren 2,5. In deze studie, twee deconstructed virale vectoren, op basis van een tabak (TMV) RNA replicon systeem (MagnICON vectoren) en de andere zijn afgeleid van de boon yellow dwarf virus (BeYDV) DNA replicon systeem (geminiviral vectoren) 4,11, 15-18, worden gebruikt om het GFP en DsRed gen dragen en zal ze in N. benthamiana cellen via A. tumefaciens. Drie DNA constructen zullen worden gebruikt voor GFP en DsRed MagnICON expressie vectoren. Zij omvatten de 5 'module (pICH15879) bevattende de promoter en andere genetische elementen voor het aandrijven van de expressie van het doelwitgen, het 3'module die het gen van belang (Pich-GFP of Pich-DsRed) en het integrase module (pICH14011) codeert voor een enzym dat integreert de 5 'en 3' modules samen bij expressie 8,15. Drie DNA-constructen zijn ook nodig voor expressie met geminiviral vectoren. Naast de vectoren die replicon van het doelgen (pBYGFP of pBYDsRed), wordt een vector die codeert voor het replicatie-eiwit (pREP110) vereist voor de amplificatie van de doelwit replicon 11,14,16. Bovendien is de opname van een vector die codeert voor de silencing suppressor p19 van tomaat bossige stunt virus gewenst voor niveau doelwitgenexpressie hoog 11,16.
Er zijn over het algemeen drie belangrijke stappen voor de invoering van de genen van recombinante eiwitten in plantencellen door agroinfiltration waaronder plantengroei, A. tumefaciens cultuur voorbereiding, en infiltratie. Aangezien elke stap is essentieel voor het uiteindelijke succes van deze procedure, dus een gedetailleerde beschrijving van elk wordtzowel spuit infiltratie en vacuüm infiltratie hieronder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plant Groei
- Plaats 60 turf pellets in een vermeerdering lade. Voeg 4 L van kraanwater en laat de turf pellets absorberen het water voor 2 uur.
- Voeg 2 N. benthamiana zaden in elke turf pellet met een zaaimachine, bedek de schaal met een doorzichtige plastic koepel en laat ze ontkiemen in een 25 ° C, 84% vochtigheid met een 16/8 uur dag / nacht cyclus (Figuur 1A).
- Verwijder de koepel twee weken na het zaaien, afvoer van water uit de lade en voeg 2 L van Jack's kunstmest bij een concentratie van 1,48 g / L (Figuur 1B). Blijven planten groeien in een 25 ° C, 50% vochtigheid met een 16/8 uur dag / nacht-cyclus. Leveren 2 L van Jack's kunstmest om de 2 dagen per tray.
- In week 4, dragen de planten met turf pellets naar een nieuwe lade die zes planten hosts om voldoende ruimte te bieden voor verdere groei (figuur 1C) tot ze klaar zijn om te worden geïnfiltreerd in leeftijd van 6 weken (figuur1D).
2. A. tumefaciens Cultuur Voorbereiding
2.1 Voorbereiding voor Spuit Infiltratie
- Streak A. tumefaciens GV3101 stammen bevattende de vectoren geminiviral p19, pREP110, pBYGFP en pBYDsRed op LB agarplaten die kanamycine (100 ug / ml). Streak een stam per plaat en groeien bij 30 ° C gedurende 48 uur.
- Ook streak en groeien GV3101 stammen die de MagnICON vectoren van de 5 'module (pICH15879), de 3' module die de doelwit-gen van GFP of DsRed (Pich-GFP of PICH-DsRed), en integrase (pCH14011) op LB Agar platen die carbenicilline (100 ug / ml).
- Uit een kolonie op LB Agar plaat, inoculeren GV3101 stammen met geminiviral vectoren in 3 ml YENB medium (0,75% Bacto gistextract, 0,8% Nutrient Broth, pH tot 7,5 met NaOH) + kanamycine (100 ug / ml) in a ml rondbodem cultuurbuis 15, groeien de vloeibare kweek bij 30 ° C ineen shaker 's nachts met een 300 rpm rotatiesnelheid.
- Ook enten en groeien GV3101 stammen met MagnICON vectoren YENB media + carbenicilline (100 ug / ml) in een shaker nacht bij 30 ° C.
- Meet en noteer OD600 waarden voor elke vloeibare kweek met een spectrofotometer en met de onderstaande formule om de noodzakelijke volume (V sub) worden gekweekt voor een nieuwe cultuur met een beginnende OD 600 van 0.025 in 10 ml YENB medium met geschikte antibiotica berekenen .
Sub V (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 - Transfer sub V (ml) van de overnacht cultuur (10 - V sub) YENB ml medium met geschikte antibiotica voor elke stam. Groeien de nieuwe kweek overnacht bij 30 ° C in een schudder met 250 rpm rotatiesnelheid totdat de OD 600-waarde in het traject van 1,7-2,0.
- Meten en opnemen OD 600 waarden voor elke vloeibare cultuur en gebruiken van de onderstaande formule te gebruiken Calculeren noodzakelijke volume (V inf) wordt verdund in 50 ml van infiltratie buffer tot een uiteindelijke OD600 van 0,12 geven voor elke stam.
Inf V (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 - Transfer inf V (ml) van elke kweek een microcentrifugebuis en spin down de cellen door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 2 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml infiltratie buffer (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO 4) door vortexen kort.
- Meng geresuspendeerd cellen van pBYGFP + pREP110 + p19, draai de cellen neer op 12.000 xg gedurende 2 minuten, en resuspendeer in totaal 50 ml van infiltratie buffer. Dit Agrobacteriën combinatie is voor geminiviral expressie van GFP.
- Ook meng de volgende combinaties van Agrobacterium cellen, spin down en resuspendeer ze in 50 ml buffer infiltratie. Zij omvatten (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 voor geminiviral expressie van DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 voor geminiviral co-expressie van GFP en DsRed, (3) pREp110 + p19 als negatieve controle van geminiviral expressie, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 voor MagnICON expressie van GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 voor MagnICON expressie van DsRed, en (6) pICH15879 + pCH14011 als negatieve controle voor MagnICON expressie.
2.2 Voorbereiding voor Vacuüm Infiltratie
- Enten en cultuur elkaar GV3101 stam die geminiviral vectoren of MagnICON vectoren in 15 ml YENB media met de juiste antibiotica in een 50 ml autoclaaf kolf en groeien 's nachts, zoals beschreven voor spuit infiltratie hierboven.
- Meet en noteer OD600 waarden voor elke vloeibare kweek met een spectrofotometer en met de onderstaande formule om de noodzakelijke volume (V sub) worden gekweekt voor een nieuwe cultuur met een beginnende OD van 600 0,025 250 ml YENB medium met geschikte antibiotica berekenen .
V sub 600 - Transfer sub V (ml) van de overnacht cultuur (250 - V sub) ml YENB media in een 1 L kolf geautoclaveerd met geschikte antibiotica voor elke stam en groeien de nieuwe cultuur overnacht zoals beschreven voor spuit infiltratie hierboven.
- Meten en opnemen OD 600 waarden voor elke vloeibare cultuur en gebruik de onderstaande formule om de noodzakelijke volume (V inf) te worden verdund in 3 L van infiltratie buffer tot een uiteindelijke OD 600 van 0.12 geven voor elke stam te berekenen.
V inf (ml) = (3000 ml) x (0.12) / OD 600 - Pellet en resuspendeer inf V (ml) van elke kweek in infiltratie buffer zoals beschreven voor spuit infiltratie en meng de geresuspendeerde kweken volgens de beschreven spuit infiltratie combinaties. Repellet de gemengde Agrobacterium cellen en resuspendeer ze in 3 L infiltratie buffer.
3.1 Spuit Infiltratie
- Kies vier 6-weken oude N. benthamiana planten met 5 vertrekt elk. De eerste drie bladeren rekenen vanaf de bovenkant van elke plant worden volledig geïnfiltreerd met een van de combinaties van A. tumefaciens stammen in infiltratie buffer. De vierde blad zal zijn spot-geïnfiltreerd met alle vier de stam combinaties voor geminiviral expressie of alle drie de combinaties voor MagnICON expressie. Het laatste blad van elke plant wordt geïnfiltreerd met combinaties van negatieve controles.
- Een kleine inkeping met een naald in de epidermis aan de achterzijde van het blad (Figuur 2A). Attentie: zorg ervoor dat zo moeilijk om niet te krabben als te doorboren het blad door beide kanten, zoals de Agrobacteria cellen in de infiltratie mengsel door de punctie zal doorgeven aan de andere kant van het blad.
- Neem een stevige greep van de voorzijde van het blad en terwijl de toepassing van zachtetegendruk aan de nick met de duim van een hand, injecteer de Agrobacterium mengsels in infiltratie buffer in de nick met een spuit zonder naald (figuur 2B). Opmerking: Als de Agrobacterium mengsel komt in de intercellulaire ruimte van het blad, zal de geïnfiltreerde gebied draai zichtbaar donkerder groen (figuur 2C).
- Doorgaan met de Agrobacterium mengsels injecteren in de inkeping totdat de donkere groene cirkel stopt om uit te breiden. Maak een andere nick en herhaal de stappen 3.1.2-3.1.4 totdat het hele blad wordt geïnfiltreerd en het hele blad wordt donkerder groen voor de eerste drie bladeren en het laatste blad.
- Voor het vierde blad van elke plant, zullen alle vier (geminiviral vector) of drie (MagnICON vector) combinaties worden geïnfiltreerd in het. Maak een inkeping voor elke combinatie van Agrobacterium stammen, en infiltreren elke nick met een combinatie.
- Na infiltratie, verplaatsen planten terug naar de groei kamer en monitor eiwitexpressie tussen 2-15 dagen na infiltratie (dpi).
3.2 Vacuüm Infiltratie
- Plaats een bad in een vacuüm exsiccator en overdracht 3 L infiltratie buffer met de Agrobacterium-stammen aan het bad. Sluit de exsiccator tot een Vacuubrand membraan vacuümpomp (figuur 3A).
- Plaats een plant ondersteboven op de exsiccator plaat (figuur 3B) en laat de plaat met de plant totdat het hele blad en stengel systeem wordt ondergedompeld in de infiltratie buffer met de plaat rust bovenop van het bad. Plaats de exsiccator O-ring langs de rand en zet de exsiccator deksel op de kamer (Figuur 3C).
- Schakel de vacuümpomp en start de timing wanneer het vacuüm bereikt 100 mbar. Open langzaam het ventiel op de exsiccator na 1 min bij 100 mbar tot ingang van Agrobacteria toe in de interstitiële ruimten van ondergedompeld plantenweefsel. Herhaal deze stap een additionale tijd om goede infiltratie te garanderen.
- Na infiltratie, neem de plant uit de exsiccator en zet het terug naar zijn rechtopstaande positie. Verplaatsen planten terug naar de groei kamer en de monitor eiwitexpressie tussen 2-15 dpi.
4. Fluorescent Protein Detectie en fotografie
- Vanaf 2 dpi, zet planten in donkere kamer en glans UV-licht aan de achterzijde van geïnfiltreerde bladeren met een handbediende UV-lamp.
- Let op de groene fluorescentie van GFP of de rode fluorescentie van DsRed. GFP geeft ze een sterker signaal met lange golf UV-licht, terwijl DsRed is sterker onder korte golf UV-licht.
- Neem foto's van fluorescerende bladeren met een gewone digitale camera zonder flits.
- Verplaatsen planten terug naar de groei kamer na observatie of fotografie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Expressie van fluorescerende eiwitten door Spuit Infiltratie
GFP en DsRed - - Om de effectiviteit van de spuit infiltratie van Agrobacterium in het plantenweefsel te tonen, hebben we de expressie van twee fluorescerende eiwitten getest door twee verschillende gedeconstrueerd planten virale vectoren - geminiviral en MagnICON - in N. benthamiana. Voor N. benthamiana bladeren die volledig werden geïnfiltreerd met Agrobacteriën bevattende geminiviral vectoren, werd GFP expressie waargenomen over het volledige bladoppervlak onder UV-licht beginnen al vanaf 2 dpi en bereikte piek accumulatie op 4 dpi (Figuur 4C). Deze vroege GFP expressie door geminiviral vector is met eerdere resultaten van andere recombinante eiwitten 14,16,18,19. In tegenstelling, bladeren geïnfiltreerd met MagnICON vector-bevattende Agrobacterium combinaties toonden GFP-fluorescentie pas na 5 dpi en bereikte zijn maximum accumulatiop bij 7 dpi (Figuur 4D). Geen groene fluorescentie waargenomen van bladeren geïnfiltreerd met Agrobacterium negatieve controle mengsels pREP110 + p19 (Figuur 4B) of pICH15879 + pCH14011 (gegevens niet getoond), wat aangeeft dat de fluorescentie specifiek was voor het GFP-gen en niet het resultaat van de achtergrond fluorescentie van de bladeren. Op het hoogtepunt accumulatie, de fluorescentie van MagnICON vector GFP-expressie is intenser dan geminiviral vector (Figuur 4C en 4D), vergelijkbaar met eerder verkregen van andere recombinante eiwitten 8,18 resultaten. De temporale expressiepatroon en de relatieve fluorescentie-intensiteit van DsRed zijn vergelijkbaar met die van GFP (gegevens niet getoond). Geen belangrijke necrose werd waargenomen op bladeren geïnfiltreerd met GFP constructen (Figuur 4A). Vergelijkbare resultaten werden ook waargenomen voor DsRed expressie planten, wat aangeeft dat noch fluorescerend eiwit is zeer giftig voor planten cells. Echter, lokale necrose op de plaats nick waargenomen en ze verschenen als "gaten" in de foto's (figuur 4). Wanneer beide fluorescerende eiwitten werden op hetzelfde blad via geminiviral vectoren met spuit spot-infiltratie, werden ze gedetecteerd met de verwachte fluorescerende kleur op de plaats waar zij geïnfiltreerd (figuur 5). Interessant co-infiltratie van GFP en DsRed geleid gele fluorescentie (Figuur 5). De intensiteit van fluorescentie DsRed bleek zwakker dan die van GFP op hetzelfde blad. Dit kan echter niet de zwakkere expressie van DsRed, maar veeleer te wijten aan de minder-dan-optimale excitatie van DsRed door UV-licht. Overall, onze resultaten tonen aan dat spuit infiltratie introduceert efficiënte recombinante gen-uitvoering Agrobacteriën in planten bladeren en resulteerden in een sterke expressie van onze doelgroep eiwitten. Bovendien hebben we aangetoond dat deze methode kan de flexibiliteitteit om ofwel infiltreren hele bladeren voor maximale accumulatie van een doelwit eiwit of aan vlek-infiltreren meerdere eiwit targets met meerdere vectoren voor hun expressie en expressie patroon te vergelijken.
2. Expressie van fluorescerende eiwitten door Vacuüm Infiltratie
Vacuüm infiltratie werd eveneens onderzocht om een schaalbare agroinfiltration methode die kan worden gebruikt voor grootschalige productie van recombinante eiwitten door plantaardige transiënte expressiesystemen te ontwikkelen. Onze resultaten geven aan dat de temporele expressie van GFP en DsRed door geminiviral en MagnICON vectoren niet was veranderd door de verandering van infiltratiemethode en bleef vergelijkbaar met die van spuit infiltratie. Aangezien de volledige opname van een plant wordt bedekt infiltratie mengsel gedurende vacuüm infiltratie, werd fluorescentie waargenomen voor GFP (figuur 6) voor alle bladeren van de geïnfiltreerde planten. Vergeleken met spuit infiltratie is robuuster en kan achieve infiltratie van elke plant met een veel korter tijdsbestek. Zo duurt een ervaren student 15 min tot injectiespuit infiltreren een hele 6 weken oude N. benthamiana plant. Daarentegen kan dezelfde plant in 3 min worden geïnfiltreerd door aanzuiging van begin tot eind en meerdere planten kunnen worden geïnfiltreerd tegelijk.
Figuur 1. N. benthamiana plantengroei met turf pellets en groei trays. Wild-type planten op 0 (A), 2 (B), 4 (C) en 6 (D) weken na het zaaien.
Figuur 2. Spuit infiltratie van N. benthamiana verlaatmet Agrobacterium tumefaciens. Zeef GV3101 van A. tumefaciens herbergen GFP-expressie MagnICON vectoren werden geresuspendeerd in infiltratie buffer en geladen in een injectiespuit zonder naald. Een nick is gemaakt met een naald op de achterzijde van een 6-weken oude plant blad (A). De opening van de spuit werd geplaatst tegen het nick (B) en Agrobacteria in infiltratie buffer werden geïnjecteerd in de intercellulaire ruimte van de vleugel via de nick (C).
Figuur 3. Vacuüm infiltratie van N. benthamiana bladeren met Agrobacterium tumefaciens. Strain GV3101 van A. tumefaciens bevattende doeleiwit tot expressie vectoren werden geresuspendeerd in infiltration buffer en geladen in een 3 L bad. Het bad werd vervolgens geplaatst in een vacuüm exsiccator die was verbonden met een vacuümpomp (A). Een 6-weken oude fabriek werd ondersteboven geplaatst op de exsiccator plaat (B). Het gehele blad en stengel systeem werd vervolgens ondergedompeld in het bad als de plaat boven op de kamer (C) werd geplaatst. Agroinfiltration werd bereikt door het toepassen en het vrijgeven van een vacuüm bij 100 mbar tweemaal gedurende 1 minuut. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Expressie van GFP in spuit agroinfiltrated bladeren. Gehele N. benthamiana bladeren werden geïnfiltreerd met stam GV3101 van A. tumefaciens herbergt het GFP-gen in een geminiviral (A en C) of MagnICON vectof (D). Negatieve controle bladeren werden geïnfiltreerd met Agrobacterium stammen die niet bevatten dat GFP-gen (B). Bladeren werden gefotografeerd onder wit licht (A) of UV-licht (BD) op 4 dpi (AC) of 7 dpi (D).
Figuur 5. Expressie van GFP en DsRed in spuit spot-agroinfiltrated bladeren. N. benthamiana bladeren waren perfect geïnfiltreerd met GV3101 herbergen van de GFP, DsRed, of beide GFP en DsRed genen in geminiviral vectoren. Een negatieve controle ter plaatse werd geïnfiltreerd met pREP110 + p19. Bladeren werden gefotografeerd onder UV licht bij 4 dpi.
Figuur 6. Expressie van GFP in vacuüm agroinfilcentreerde bladeren. N. benthamiana bladeren werden geïnfiltreerd met GV3101 herbergen van het GFP-gen in MagnICON vectoren. Bladeren werden gefotografeerd onder UV-licht op 7 dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toenemende vraag naar eiwit gebaseerde geneesmiddelen wereldwijd vereisen nieuwe productieplatforms die robuust, schaalbaar, lage kosten en een kluisje. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve productiesystemen voor farmaceutische productie eiwit. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van deconstructed virus gebaseerde vectoren transiënte expressie van eiwitten in planten, die sterk verbetert de snelheid en opbrengst van plantaardige expressiesystemen 2,10 ingeschakeld. Verder optimaliseren van de bruikbaarheid van het tijdelijke expressiesysteem, demonstreren we een eenvoudig maar efficiënt en schaalbaar benadering target-gen dat Agrobacterium introduceren in plantenweefsel. Onze resultaten geven aan dat agroinfiltration met ofwel de injectiespuit of vacuümmethode heeft geleid tot de efficiënte introductie van Agrobacterium in de plant bladeren en levenskrachtige twee fluorescerende eiwitten, GFP en DsRed.
Om de efficie zorgennt agroinfiltration en eiwitproductie, moeten de volgende kritische parameters zorgvuldig worden gecontroleerd. Afwijkingen van deze parameters kan resulteren in lage agroinfiltration efficiëntie en op zijn beurt, lage doeleiwitexpressie.
1. Plant ontwikkelingsstadium en gezondheid. De meest waarschijnlijke variabele in de werkwijze tussen laboratoria het plantmateriaal infiltratie. Terwijl planten fenotypisch gelijkaardige lijken, hun ontwikkelingsstadium en de fysiologische toestand van invloed op hun competentie in recombinante eiwitten tot expressie significant. Specifieke parameters die invloed op plantengroei en eiwit expressie niveaus zijn: temperatuur, vochtigheid, lichtintensiteit, levering van meststoffen, plantaardige inenting leeftijd, en de tijd die nodig is voor de maximale accumulatie van doelproteïne na blad infiltratie. Planten moeten consequent ontvangt gelijke hoeveelheden water en meststoffen dagelijks. Kleine veranderingen in de plantengroei voorwaarden kan drastisch veranderen de uiteindelijke size van planten en hun vermogen om recombinante eiwitten tot expressie. Onze eerdere studies wijzen erop dat planten onder natuurlijk licht leverde meer blad biomassa, maar eiwit opbrengst is veel lager dan die geteeld onder kunstlicht 4. Daarom, met behulp van kunstlicht is de methode van keuze voor de groei van planten. Onze resultaten tonen ook aan dat een 16 uur licht / 8 uur donker cyclus bij 25 ± 0,5 ° C is de optimale conditie te groeien N. benthamiana planten onder zulke kunstmatige verlichting 4. We toonden aan dat onder deze omstandigheden, 6 weken planten zijn de optimale leeftijd voor GFP en DsRed expressie zij produceren hoge niveaus van fluorescente proteïnen terwijl de biomassa opbrengst voldoende. Planten ouder dan 6-weken produceren meer biomassa, maar zijn te groot om te passen in de infiltratie kamer 4. Bovendien, bloemen beginnen te ontwikkelen na 6 weken van groei, negatieve gevolgen recombinant eiwitexpressie 4. Bijgevolg 6 weken planten bevatten de optimale leaf materiaal dat de gecombineerde noodzaak van biomassa opbrengst, eiwit accumulatie en het gemak van agroinfiltration evenwicht.
2. Groei en infiltratie concentratie van Agrobacterium. Een ander belangrijk punt van deze methode is de controle van groei en infiltratie concentratie A. tumefaciens, zoals gemeten door de OD 600. In elke cultuur en subcultuur stap, stammen van A. tumefaciens moeten worden gekweekt om, maar niet over de aangewezen OD 600. We hebben meerdere concentraties van A. onderzocht tumefaciens voor de laatste infiltratie van N. benthamiana verlaat 4. Lage Agrobacterium concentratie zal resulteren in onvoldoende afgifte van doelwitgenen in planten, wat leidt tot lage eiwitexpressie. Anderzijds, indien de concentratie infiltratie van Agrobacterium te hoog is, zal een overgevoeligheidsreactie in de geïnfiltreerde weefsels veroorzaken en leiden tot necrose 20. Onze resultaten aangetoond dat OD 600 = 0,12 Agrobacteriumstam balanceert de behoefte aan maximale levertijd van genconstructie zonder dat weefsel necrose en celdood. De gewenste dichtheid OD 600 van Agrobacterium kan worden verkregen gebruik makend van dezelfde kweekmedia temperatuur en kweekperiode.
3. Voor vacuüm infiltratie, is het belangrijk om de aangewezen vacuümdruk en infiltratie duur volgen. Onze resultaten tonen aan dat een 3 L bad infiltratie van Agrobacterium mengsel kunnen worden gebruikt om ongeveer 30 planten infiltreren. Als er meer dan 30 planten moeten worden geïnfiltreerd, een nieuwe partij van Agrobacterium infiltratie mengsel moet worden geleverd.
4. De specifieke parameters die in dit document zijn geoptimaliseerd voor expressie van eiwitten met N. benthamiana planten geteeld onder specifieke omstandigheden zoals hierboven beschreven met gedeconstrueerd virus-gebaseerde vectoren. Zoals eerder besproken, tHij moeilijkste parameter te controleren in deze methodiek is het plantmateriaal. We hebben geuit een verscheidenheid van vaccins en therapeutische eiwitten met behulp van planten en de infiltratie procedure die we hier beschreven en behaalde uitstekende resultaten in alle gevallen 4,8,14,18,21-23. Deze resultaten toonden dat de voorwaarden die wij hebben ontwikkeld, optimaal voor eiwitexpressie. Echter, indien het een andere gastheer plantensoorten, expressie vectoren, of anders N. Benthamiana groeiomstandigheden werden gebruikt voor infiltratie zou elke parameter in deze methode moeten opnieuw worden geoptimaliseerd door experimenten.
Algemeen hebben we aangetoond dat agroinfiltration met spuit en vacuüm is een eenvoudige maar efficiënte methode om doelwitgen die Agrobacterium in planten voor transiënte expressie van recombinant proteïnen te voeren. Beide methoden hebben hun unieke voordelen afhankelijk van het doel van onderzoek en productie. Spuit infiltratie is simpel, requires slechts kleine volumes Agrobacterium cultuur en hoeft niet duur pompen en vacuümkamers. Zoals aangetoond in dit verslag heeft de flexibiliteit om ofwel infiltreren hele blad met een doelgen of gebruik spot infiltratie genen van meerdere doelen voeren op een blad. Het gehele blad infiltratie methode kan worden gebruikt voor kleine laboratoriumschaal expressie van recombinante eiwitten voor hun biochemische karakterisatie, zuivering en preklinische functionele studies 1. In tegenstelling, kan spot infiltratie worden gebruikt om meerdere eiwit targets op een blad te betuigen aan vergelijken hun opbrengst, expressie kinetiek en toxiciteit voor planten. Het kan ook worden gebruikt om de expressie van een reportergen zoals GFP of DsRed vergelijken met uiteenlopende expressievectoren op hetzelfde blad. Hierdoor kan het vermogen van verschillende vector in een eiwit accumulatie en hun expressie kinetiek worden gekarakteriseerd. De eenvoud van de spuit infiltratie kan ook eenhaalbaar instrument om te leren en te trainen middelbare school en studenten in het onderwerp van bio-en gentechnologie.
In vergelijking met spuit infiltratie, vacuüm infiltratie vereist de investering van vacuümpompen en kamers en grotere volumes van Agrobacterium culturen. Daarom is de werkwijze van keuze als enkele planten moeten worden geïnfiltreerd. Echter, het biedt de schaalbaarheid die niet door spuit infiltratie kan worden geëvenaard. Het is robuuster en kunnen grote aantallen planten infiltreren in een korte tijd. Met de schaal in dit verslag, zijn we in staat om gram niveau van gezuiverde farmaceutische eiwitten voldoende voor een Fase I klinische proef 4 produceren. Bovendien kan deze werkwijze verder opgeschaald voor commerciële vervaardiging van farmaceutische eiwitten uit planten. Bijvoorbeeld worden werkwijzen worden ontworpen om vacuüm infiltreren drie ton N. benthamiana planten per uurin een schaal-up operatie 24. Een ander voordeel van vacuüm infiltratie is dat het kan worden gebruikt om plantensoorten die niet vatbaar zijn voor spuit infiltratie agroinfiltrate.
Samengevat, de combinatie van spuit en vacuüm infiltratie biedt onderzoekers biotechnologists en docenten een eenvoudige, efficiënte, robuuste en schaalbare methode voor transiënte expressie van recombinant eiwitten in planten. Het zal veel gemakkelijker de ontwikkeling en productie van farmaceutische eiwitten en bevorderen van wetenschappelijk onderwijs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken R. Zon en andere studenten van Chen's Laboratorium voor hun bijdrage aan materiaal generatie planten. We danken ook dr. D. Green voor zijn steun van undergraduate onderzoek in de Universiteit van Technologie en Innovatie (CTI). Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH subsidie U01 AI075549 en 1R21AI101329 naar Q. Chen, en een SSE subsidie van CTI van de Arizona State University naar Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, en J. Stahnke zijn undergraduate studenten ondersteund door de SSE subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8" with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
