Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי
Summary
צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן המכיל<em> Agrobacterium tumefaciens</em> לצמחים לביטוי חלבון חולף.
Abstract
תרבית תאי יונקים היא הפלטפורמה הגדולה לייצור מסחרי של חיסונים לבני אדם וחלבונים טיפוליים. עם זאת, הוא לא יכול לענות על ביקוש העולמי הגובר לתרופות בשל יכולת הרחבה המוגבלת שלה ועלותו הגבוהה. צמחים הראו להיות אחת פלטפורמות ייצור התרופות החלופיות המבטיחות ביותר כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. ההתפתחות האחרונה של וקטורים מבוססי וירוס אפשרה ביטוי חולף ומהיר ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטיים בצמחים. כדי לייעל עוד יותר את השירות של מערכת הביטוי החולף, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, יעילה וניתן להרחבה להציג Agrobacterium המכיל יעד גן לתוך רקמות צמח במחקר זה. התוצאות שלנו מעידות agroinfiltration שעם שניהם ומזרק ואקום שיטות הביאו במבוא יעיל של Agrobacterium לעלים וייצור חזק של שני חלבוני ניאון; GFP וDsRed. יתר על כן,אנחנו מדגימים את היתרונות הייחודיים המוצעים על ידי שתי השיטות. חדירת המזרק היא פשוטה ואינה זקוק לציוד יקר. זה גם מאפשר את הגמישות או לחדור לכל החופשה עם גן המטרה אחת, או להציג את הגנים של מטרות מרובות בדף אחד. לפיכך, ניתן להשתמש בו לביטוי בקנה מידה מעבדה של חלבונים רקומביננטיים, כמו גם להשוואה בין חלבונים או וקטורים שונים לקינטיקה תשואה או הביטוי. הפשטות של חדירת המזרק גם מציעה השירות שלה בבית הספר תיכון ומכללה לחינוך לנושא של ביוטכנולוגיה. לעומת זאת, חדירת האבק היא חזקה יותר, וניתן לשנות כלפי מעלה לייצור מסחרי של חלבוני תרופות. הוא מציע גם את היתרון של להיות מסוגל agroinfiltrate מיני צמחים שאינם ניתן לחדירת המזרק כגון חסה וארבידופסיס. בסך הכל, שילוב של מזרק וagroinfiltration הוואקום מספק לחוקרים ומחנכים פשוטים, יעיל וחזקהמתודולוגיה לביטוי חולף חלבון. זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של חלבוני תרופות ולקדם את החינוך מדעי.
Introduction
מאז 1970, צמחים נחקרו כחלופות לתרביות של תאי יונקים, חרקים, חיידקים ולייצור המסחרי של חלבונים רקומביננטיים ותרופות 1 חלבון. מערכות המבוססות על הצמח לביטוי של תרופות ביולוגיות הראו הבטחה בשנים האחרונות כמספר טיפולים החדשניים למחלות, כמו מחלת גושה 2, ושפעת עופות H5N1 3, הראו הצלחה בניסויים קליניים. פיתוח מנגנונים מוסמכים לביטוי חלבון רקומביננטי בצמחים בעשורים שחלף מאז ניסויים הראשוניים יצר את הפוטנציאל למערכות המבוססות על הצמח לשנות את הפרדיגמה הנוכחית של ייצור חלבון משלוש סיבות עיקריות. ראשית, יש ירידה בולטת בעלות כbioreactors יונקים, חרקים, חיידקים ודורשים עלויות משמעותיות בהפעלה, תקשורת צמיחה היקרות, מסובכים ותהליכים לטיהור מורד הזרם 4. יצירת הצמח מהונדס יציבקווים גם מאפשר להם לעבור את יכולת ההרחבה של מערכות ביטוי אחרות ניתן לגדל צמחים לבטא חלבון ונקטפו בקנה מידה חקלאית 5. שנית, מערכות ביטוי על בסיס צמחי להפחית באופן משמעותי את הסיכון להעברת הפתוגן אדם או בעל חיים מהמארח החלבון להביע לבני אדם, הוכיחו עליונות בביטחון ציבור 6. לבסוף, צמחים לנצל את מערכת endomembrane אוקריוטים כי הוא דומה לתאי יונקים, דבר המאפשרים לשינוי לאחר translational הנכון של חלבונים, כולל glycosylation וההרכבה של חלבונים מרובים מקטע 7. יכולת זו מעמידה את מערכות על בסיס צמחי לפני אלה המבוססים על מערכות פרוקריוטים, כגון חיידקים, שכן מספר רחב יותר של חלבונים רקומביננטיים תרופות, כולל נוגדנים חד שבטיים (מבז), יש מבנה מסובך יותר ודורש שינויים נרחבים posttranslational או הרכבה 8.
ישנם שתי appro הגדולהכאבים כדי לבטא חלבונים רקומביננטיים בצמחים. הראשון הוא הפיתוח של קו מהונדס ביציבות, כאשר ה-DNA המקודד חלבון המטרה הוא משובט לתוך קלטת ביטוי והציג גם את הגנום הגרעיני או הכלורופלסט. בתוך כך, דנ"א הזר הופך להיות תורשתי באמצעות דורות הבאים ומאפשר ליכולת הרחבה השתפרה מאוד, הרבה מעבר לזה של מערכות ביטוי אחרות 1. מבוא של ה-DNA אקסוגני לגנום הגרעיני מושגת בדרך כלל על ידי זיהום Agrobacterium tumefaciens של רקמת צמח או, לעתים קרובות יותר, בהפצצות microprojectile של הרקמה 9. הורמונים צמחיים משמשים לאחר מכן כדי לגרום להתמיינות וגדילה של רקמות צמח מהונדס כמו שורשים ועלים. הפיכתו של הגנום הכלורופלסט לא ניתן להשיג עם א ' tumefaciens, אלא מסתמך אך ורק על חלקיקי זהב או טונגסטן מצופה דנ"א ירה בליסטי לתוך תאי צמח. השיטה השנייה של הבעת recombinaחלבון NT בצמחים הוא דרך ביטוי חולף 10. בתרחיש זה, וקטורי הנגזרות וירוס מחסה הגן של עניין מועברים דרך א tumefaciens לצמחים המפותחים באמצעות תהליך הנקרא agroinfiltration. במקום להשתלב בגנום הצמח, מבנה הגן נמסר אז יהיה להתחיל לכוון את הייצור החולף של החלבון הרצוי, שיכול להיות שנקטפו ומבודד לאחר תקופת דגירה קצרה. ביטוי חולף גן מציע את היתרון של הצטברות גדולה יותר הכוללת חלבון, כמו גם זמן משופר של ייצור חלבון, כמו צמחים יהיו מוכנים לקצור כ 1-2 שבועות לאחר agroinfiltration 11. זו מהירה יותר באופן משמעותי מתהליכי ייצור, בחירה ואישור של קווי צמחים מהונדסים יציבים, אשר יכול לקחת מספר חודשים עד שנה. זה לעומת זאת, הוא גם המגבלה של מערכת הביטוי החולף, כפי שהוא לא יניב יציב גנטי צמח Liנס שיכול לשמש ליצירת בנק זרע לייצור מסחרי בקנה מידה גדול. למרות זאת, גישות פותחו כדי לשפר את הביטוי חולף בקנה מידה גדול. כאן אנו מדגימים שיטה אחת של דור של צמחים חולפים חלבון המבטא-ניקוטיאנה benthamiana באמצעות וקטורים ויראליים מפורקים נמסרו על ידי א tumefaciens.
שתי שיטות עיקריות מפותחות עבור המשלוח של א ' tumefaciens לתוך רקמות צמח: היקף חדירת ספסל באמצעות מזרק והסתננות בקנה מידה גדולה באמצעות תא ואקום. שני הפרוטוקולים מתוארים כאן באמצעות נ benthamiana, אשר קשור באופן הדוק לצמח הטבק המשותף, כצמח הפונדקאי לביטוי זמני של שני חלבוני ניאון: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea ויקטוריה וחלבון פלואורסצנטי האדום מDiscosoma אלמוגים (DsRed) 12,13. נ benthamiana הוא הצמח הפונדקאי הנפוץ ביותר עבורחלבון רקומביננטי כי זה ניתן לשינוי גנטי, יכול להניב כמויות גבוהות של ביומסה במהירות, והוא מפיק זרעים פורה לייצור בהיקף של עד 14. יתרון נוסף של שימוש בנ benthamiana כמארחים לביטוי חלבון הוא הזמינות של מגוון רחב של וקטורי ביטוי 2,5. במחקר זה, שני וקטורים ויראליים מפורקים, אחד המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) רנ"א replicon מערכת (וקטורי MagnICON) והאחר שהופק ממערכת replicon DNA (וקטורי geminiviral) 4,11 וירוס הגמד הצהוב השעועית (BeYDV), 15-18, משמשים לביצוע ה-GFP וגן DsRed ולספק אותם לנ תאי benthamiana Via A. tumefaciens. שלוש בונה DNA תשמש לGFP או ביטוי DsRed עם וקטורי MagnICON. הם כוללים 'מודול (pICH15879) המכיל את האמרגן ואלמנטים גנטיים אחרים לנהיגת הביטוי של גן המטרה, 3' 5 מודול המכיל את הגן של עניין (Pich-GFP או Pich-DsRed), ומודול integrase (pICH14011) קידוד לאנזים המשלב 5 'ו 3' מודולים יחד על ביטוי 8,15. שלושה מבני DNA גם יש צורך לביטוי עם וקטורי geminiviral. בנוסף לוקטורים המכילים replicon של גן המטרה (pBYGFP או pBYDsRed), וקטור המקודד חלבון השכפול (pREP110) נדרש ההגברה של יעד replicon 11,14,16. יתר על כן, הכללתו של וקטור קידוד P19 מדכא השתקה מוירוס פעלולים סבוך עגבנייה היא רצויה לביטוי גן המטרה ברמה גבוה 11,16.
יש בדרך כלל שלושה שלבים עיקריים לכניסתה של הגנים של חלבונים רקומביננטיים לתוך תאי צמח על ידי agroinfiltration כולל גידול צמח, א tumefaciens תרבות הכנה, והסתננות. כמו בכל שלב הוא קריטי להצלחתו הסופית של הליך זה ולכן, תיאור מפורט, לכל אחד מהם סיפקעבור שניהם חדירת מזרק וחדירת ואקום בהמשך.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדרישה הגוברת לתרופות המבוססות על חלבונים ברחבי העולם דורשת פלטפורמות ייצור חדשות כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. צמחים הראו להיות אחת ממערכות הייצור החלופיות המבטיחות ביותר לייצור חלבון תרופות. בשנים האחרונות, ההתפתחות של וקטורים מבוססי וירוס מפורק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לר 'סאן ותלמידים אחרים של המעבדה של חן על תרומתם לדור לשתול חומר. כמו כן, אנו מודים לד"ר ד 'גרין לתמיכה במחקר לתואר הראשון שלו במכללה לטכנולוגיה וחדשנות (CTI). מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH U01 AI075549 ו1R21AI101329 לשאלת חן, ומענק SSE מCTI של אוניברסיטת אריזונה לחן ש. ק Leuzinger, דנט מ ', ג'הורטדו, וג' Stahnke הם סטודנטים לתואר ראשון הנתמכים על ידי מענק מז.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
