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Biology

पुनः संयोजक प्रोटीन का उच्च स्तर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पौधे के कुशल Agroinfiltration

Published: July 23, 2013 doi: 10.3791/50521
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University
* These authors contributed equally

Summary

संयंत्रों वर्तमान अभिव्यक्ति मानदंड से अधिक है, स्केलेबल लागत प्रभावी और सुरक्षित है कि एक व्यावसायिक पैमाने पर दवा प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक उपन्यास प्रणाली प्रदान करते हैं. इस अध्ययन में, हम युक्त लक्ष्य जीन को पेश करने के लिए एक सरल और सुविधाजनक है, अभी तक स्केलेबल दृष्टिकोण रिपोर्ट

Abstract

स्तनधारी सेल संस्कृति मानव टीके और उपचारात्मक प्रोटीनों के वाणिज्यिक उत्पादन के लिए प्रमुख मंच है. हालांकि, यह अपने सीमित scalability और उच्च लागत के कारण दवाइयों के लिए बढ़ती दुनिया भर में मांग को पूरा नहीं कर सकते हैं. पौधे मजबूत, स्केलेबल, कम लागत और सुरक्षित हैं कि सबसे होनहार वैकल्पिक दवा उत्पादन प्लेटफॉर्म में से एक होने का पता चला है. वायरस आधारित वैक्टर के हाल ही के विकास के पौधों में पुनः संयोजक प्रोटीन का तेजी से और उच्च स्तर क्षणिक अभिव्यक्ति की अनुमति दी है. आगे क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली की उपयोगिता का अनुकूलन करने के लिए, हम इस अध्ययन में संयंत्र के ऊतकों में लक्ष्य जीन युक्त Agrobacterium लागू करने के लिए एक सरल, कुशल और स्केलेबल पद्धति को प्रदर्शित करता है. GFP और dsRed, हमारे परिणाम तरीकों पत्ते और दो ​​फ्लोरोसेंट प्रोटीन का मजबूत उत्पादन में Agrobacterium के कुशल शुरूआत में हुई है सिरिंज और वैक्यूम दोनों के साथ कि agroinfiltration संकेत मिलता है. इसके अलावा,हम दोनों तरीकों से की पेशकश की अद्वितीय लाभ प्रदर्शित करता है. सिरिंज घुसपैठ आसान है और महंगे उपकरण की जरूरत नहीं है. यह भी लचीलापन या तो एक लक्ष्य जीन के साथ पूरे छुट्टी घुसपैठ करने के लिए, या एक पत्ती पर कई लक्ष्यों के जीन को पेश करने की अनुमति देता है. इस प्रकार, यह पुनः संयोजक प्रोटीन की प्रयोगशाला पैमाने अभिव्यक्ति के लिए और साथ ही उपज या अभिव्यक्ति कैनेटीक्स के लिए विभिन्न प्रोटीन या वैक्टर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सिरिंज घुसपैठ की सादगी भी जैव प्रौद्योगिकी के विषय के लिए हाई स्कूल और कॉलेज शिक्षा के क्षेत्र में अपनी उपयोगिता का पता चलता है. इसके विपरीत, वैक्यूम घुसपैठ और अधिक मजबूत है और दवा प्रोटीन की व्यावसायिक निर्माण के लिए छोटा हो सकता है. यह भी इस तरह के सलाद और Arabidopsis रूप में सिरिंज घुसपैठ के लिए उत्तरदायी नहीं हैं कि पौधों की प्रजातियों agroinfiltrate करने में सक्षम होने का लाभ प्रदान करता है. कुल मिलाकर, सिरिंज और वैक्यूम agroinfiltration के संयोजन शोधकर्ताओं और शिक्षकों को प्रदान करता है एक सरल, कुशल, और मजबूतक्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कार्यप्रणाली. यह बहुत दवा प्रोटीन के विकास की सुविधा और विज्ञान की शिक्षा को बढ़ावा देंगे.

Introduction

1970 के दशक के बाद से, पौधों पुनः संयोजक प्रोटीन और प्रोटीन चिकित्सा 1 के वाणिज्यिक उत्पादन के लिए, स्तनधारी कीट, और बैक्टीरियल सेल संस्कृतियों के लिए विकल्प के रूप में लगाया गया है. Biopharmaceuticals की अभिव्यक्ति के लिए संयंत्र आधारित सिस्टम नैदानिक ​​परीक्षणों में सफलता से पता चला है, Gaucher रोग के 2, और एवियन H5N1 इन्फ्लूएंजा 3 जैसे रोगों के लिए कई उपन्यास उपचार के रूप में हाल के वर्षों में वादा दिखाया है. उन आरंभिक प्रयोगों के बाद के दशकों में पौधों में पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सक्षम तंत्र के विकास के तीन मुख्य कारणों के लिए प्रोटीन के उत्पादन के वर्तमान प्रतिमान बदलने के लिए संयंत्र आधारित सिस्टम के लिए क्षमता का सृजन किया है. सबसे पहले, स्तनधारी कीट, और बैक्टीरियल बायोरिएक्टर काफी स्टार्टअप लागत, महंगे विकास मीडिया, और नीचे की ओर शुद्धि 4 के लिए जटिल प्रक्रियाओं की आवश्यकता के रूप में लागत में उल्लेखनीय कमी आई है. स्थिर ट्रांसजेनिक संयंत्र का निर्माणलाइनें भी प्रोटीन व्यक्त पौधों हो गई है और एक कृषि पैमाने 5 पर काटा जा सकता है के रूप में उन्हें अन्य अभिव्यक्ति सिस्टम के scalability आगे बढ़ना करने की अनुमति देता है. दूसरे, संयंत्र आधारित अभिव्यक्ति सिस्टम काफी सार्वजनिक सुरक्षा 6 में श्रेष्ठता का प्रदर्शन, मनुष्य के लिए प्रोटीन व्यक्त मेजबान से एक मानव या जानवर रोगज़नक़ संचारण के जोखिम को कम. अन्त में, पौधों ग्लाइकोसिलेशन और कई सबयूनिट प्रोटीन की 7 विधानसभा सहित प्रोटीन की उचित बाद translational संशोधन के लिए अनुमति देता है, स्तनधारी कोशिकाओं के समान है कि एक यूकेरियोटिक झिल्ली तंत्र का उपयोग. यह क्षमता एक अधिक जटिल संरचना है और व्यापक posttranslational संशोधनों या विधानसभा 8 की आवश्यकता होती है, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) सहित दवा पुनः संयोजक प्रोटीन की एक व्यापक संख्या, के बाद से, बैक्टीरिया जैसे प्रोकार्योटिक सिस्टम के आधार पर उन के आगे संयंत्र आधारित सिस्टम कहते हैं.

दो प्रमुख appro रहे हैंपौधों में पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए दर्द. पहला लक्ष्य प्रोटीन के लिए कोडिंग डीएनए एक अभिव्यक्ति कैसेट में क्लोन और परमाणु या क्लोरोप्लास्ट जीनोम को या तो शुरू की है, जहां एक स्थिरतापूर्वक ट्रांसजेनिक लाइन का विकास है. ऐसा करने में, विदेशी डीएनए उत्तरवर्ती पीढ़ियों के माध्यम से पैतृक हो जाता है और अब तक अन्य अभिव्यक्ति सिस्टम 1 के उस पार, काफी सुधार scalability के लिए अनुमति देता है. परमाणु जीनोम को exogenous डीएनए का परिचय आमतौर पर ऊतक 9 के microprojectile बमबारी से, कम अक्सर, संयंत्र के ऊतकों की Agrobacterium tumefaciens संक्रमण के द्वारा प्राप्त किया या है. संयंत्र हार्मोन फिर भेदभाव और जड़ों और पत्तियों के रूप में इस तरह के ट्रांसजेनिक पौधे ऊतक के विकास को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है. क्लोरोप्लास्ट जीनोम का परिवर्तन ए के साथ हासिल नहीं किया जा सकता है डीएनए के साथ लेपित tumefaciens, लेकिन सोने या टंगस्टन कणों पर पूरी तरह से निर्भर करता है संयंत्र कोशिकाओं में ballistically निकाल दिया. recombina व्यक्त करने का दूसरा तरीकापौधों में NT के प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति के माध्यम से 10 है. इस परिदृश्य में, ब्याज की जीन शरण वायरस व्युत्पन्न वैक्टर ए के माध्यम से वितरित कर रहे हैं एक प्रक्रिया के माध्यम से पूरी तरह से विकसित पौधों को tumefaciens agroinfiltration बुलाया. इसके बजाय संयंत्र जीनोम में एकीकृत करने की, वितरित जीन का निर्माण तो एक छोटी ऊष्मायन अवधि के बाद काटा और अलग किया जा सकता है, जो वांछित प्रोटीन की क्षणिक उत्पादन निर्देशित करने के लिए शुरू हो जाएगा. पौधों agroinfiltration 11 के बाद लगभग 1-2 सप्ताह फसल के लिए तैयार हो जाएगा के रूप में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति, अधिक से अधिक समग्र प्रोटीन संचय के साथ ही प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक बेहतर समय का लाभ प्रदान करता है. इस एक वर्ष के लिए कई महीने लग सकते हैं जो स्थिर ट्रांसजेनिक पौधे, लाइनों की पीढ़ी, चयन, और पुष्टि की प्रक्रियाओं की तुलना में काफी तेज है. यह आनुवंशिक रूप से स्थिर संयंत्र ली उपज नहीं होगा, क्योंकि यह तथापि, यह भी क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली की सीमा हैबड़े पैमाने पर वाणिज्यिक उत्पादन के लिए एक बीज बैंक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि nes. इस के बावजूद, दृष्टिकोण बड़े पैमाने क्षणिक अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है. यहाँ हम ए द्वारा दिया deconstructed वायरल वैक्टर का उपयोग क्षणिक प्रोटीन व्यक्त निकोटियाना benthamiana पौधों की पीढ़ी की एक विधि का प्रदर्शन tumefaciens.

दो प्रमुख तरीकों ए के वितरण के लिए विकसित की जा रही हैं संयंत्र के ऊतकों में tumefaciens: निर्वात चैम्बर के माध्यम से सिरिंज और बड़े पैमाने पर घुसपैठ के माध्यम से बेंच पैमाने पर घुसपैठ. दोनों प्रोटोकॉल एन का उपयोग कर यहाँ वर्णित हैं बारीकी से आम तंबाकू के पौधे से संबंधित है जो benthamiana, दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन का क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए मेजबान संयंत्र के रूप में: जेलिफ़िश Aequorea विक्टोरिया और Discosoma मूंगा (dsRed) 12,13 से लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP). एन benthamiana के लिए सबसे आम मेजबान संयंत्र हैयह आनुवंशिक परिवर्तन करने के लिए उत्तरदायी है क्योंकि पुनः संयोजक प्रोटीन, तेजी से बायोमास की उच्च मात्रा में उपज, और बड़े पैमाने अप उत्पादन 14 के लिए एक विपुल बीज उत्पादक है सकते हैं. एन का उपयोग करने का एक और लाभ प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए मेजबान के रूप में benthamiana अभिव्यक्ति वैक्टर 2,5 की एक किस्म की उपलब्धता है. इस अध्ययन में, दो deconstructed वायरल वैक्टर, एक तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) आरएनए replicon प्रणाली (MagnICON वैक्टर) और सेम पीले बौना वायरस (BeYDV) डीएनए replicon प्रणाली (geminiviral वैक्टर) 4,11 से ली गई अन्य, के आधार पर एक 15-18, GFP और dsRed जीन ले और एन में उन्हें वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है ए के माध्यम से benthamiana कोशिकाओं tumefaciens. तीन डीएनए निर्माणों GFP या MagnICON वैक्टर साथ dsRed अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. वे ब्याज की जीन युक्त मॉड्यूल (पिच 5 'लक्ष्य जीन, 3 की अभिव्यक्ति ड्राइविंग के लिए प्रमोटर और अन्य आनुवंशिक तत्वों से युक्त मॉड्यूल (pICH15879)' शामिलGFP या पिच-dsRed), और इंटिग्रेस मॉड्यूल (pICH14011) अभिव्यक्ति 8,15 पर 5 और 3 'मॉड्यूल एक साथ एकीकृत करता है कि एक एंजाइम के लिए कोडिंग. तीन डीएनए निर्माणों भी geminiviral वैक्टर के साथ अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हैं. लक्ष्य जीन (pBYGFP या pBYDsRed) की replicon युक्त वैक्टर के अलावा, प्रतिकृति प्रोटीन (pREP110) के लिए कोडिंग के एक वेक्टर लक्ष्य replicon 11,14,16 के प्रवर्धन के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, टमाटर जंगली स्टंट वायरस से मुंह बंद शमन p19 एन्कोडिंग एक वेक्टर के शामिल किए जाने के उच्च स्तर लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 11,16 के लिए वांछित है.

पौधों की वृद्धि, ए सहित agroinfiltration द्वारा संयंत्र कोशिकाओं में पुनः संयोजक प्रोटीन की जीन की शुरूआत के लिए तीन प्रमुख कदम आम तौर पर कर रहे हैं tumefaciens संस्कृति तैयारी, और घुसपैठ. प्रत्येक के लिए हर कदम पर इस प्रक्रिया के अंतिम सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए, एक विस्तृत वर्णन प्रदान की गई हैसिरिंज घुसपैठ और नीचे वैक्यूम घुसपैठ दोनों के लिए.

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Protocol

1. संयंत्र विकास

  1. एक प्रचार ट्रे में रखें 60 पीट छर्रों. नल के पानी के 4 एल जोडें और पीट छर्रों 2 घंटे के लिए पानी को अवशोषित करते हैं.
  2. 2 एन जोड़ें एक बोने की मशीन का उपयोग कर प्रत्येक पीट गोली में benthamiana बीज, एक पारदर्शी प्लास्टिक के गुंबद के साथ ट्रे कवर, और उन्हें एक 16/8 घंटा दिन / रात चक्र (चित्रा 1 ए) के साथ एक 25 डिग्री सेल्सियस, 84% नमी वातावरण में उत्पन्न करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. दो सप्ताह बोने के बाद गुंबद निकालें ट्रे से पानी के निकास, और 1.48 ग्राम / एल (चित्रा 1 बी) के एक एकाग्रता में जैक उर्वरक के 2 एल जोड़ें. एक 16/8 घंटा दिन / रात चक्र के साथ एक 25 डिग्री सेल्सियस, 50% नमी वातावरण में पौधों को विकसित करने के लिए आगे बढ़ें. जैक उर्वरक के 2 एल ट्रे प्रति हर 2 दिन की आपूर्ति.
  4. वे उम्र के 6 सप्ताह (चित्रा में घुसपैठ करने के लिए तैयार हैं जब तक 4 सप्ताह में, आगे विकास (चित्रा 1C) के लिए पर्याप्त स्थान उपलब्ध कराने के लिए छह पौधों कि मेजबान एक नया ट्रे को पीट छर्रों के साथ पौधों का स्थानांतरण-1).

2. ए tumefaciens संस्कृति तैयारी

सिरिंज घुसपैठ के लिए 2.1 तैयारी

  1. स्ट्रीक ए geminiviral वैक्टर p19, pREP110, pBYGFP, और केनामाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त लेग अगर प्लेटों पर pBYDsRed युक्त tumefaciens GV3101 उपभेदों. स्ट्रीक एक प्लेट प्रति तनाव और 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है.
  2. इसी तरह, लकीर और लेग अग्रवाल पर GV3101 5 की MagnICON वैक्टर शरण उपभेदों 'मॉड्यूल (pICH15879), 3' GFP या dsRed (पिच GFP या पिच-dsRed) का लक्ष्य जीन युक्त मॉड्यूल, और integrase (pCH14011) हो जाना कार्बेनिसिलिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त प्लेटें.
  3. लेग अगर प्लेट पर एक ही कॉलोनी से, YENB मीडिया के 3 मिलीलीटर (0.75% Bacto खमीर निकालने, 0.8% पोषक शोरबा, NaOH के साथ 7.5 पीएच को समायोजित) में geminiviral वैक्टर शरण GV3101 उपभेदों टीका लगाना + केनामाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) में एक 15 मिलीलीटर दौर नीचे संस्कृति ट्यूब, डिग्री सेल्सियस में 30 पर तरल संस्कृति बढ़नेएक 300 आरपीएम रोटेशन दर के साथ रात में एक प्रकार के बरतन.
  4. इसी तरह, टीका लगाना और 30 में एक प्रकार के बरतन रात भर में YENB मीडिया + कार्बेनिसिलिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) में MagnICON वैक्टर शरण GV3101 उपभेदों डिग्री सेल्सियस बढ़ने
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ YENB मीडिया के 10 मिलीलीटर में 0.025 का एक प्रारंभिक 600 आयुध डिपो के साथ एक नई संस्कृति के लिए subcultured होने के लिए आवश्यक मात्रा (वी उप) की गणना करने के लिए नीचे सूत्र का उपयोग के साथ एक तरल संस्कृति के लिए उपाय और रिकॉर्ड 600 आयुध डिपो मूल्यों .
    वी उप (एमएल) = (10 मिलीलीटर) एक्स (0.025) / 600 आयुध डिपो
  6. करने के लिए रातोंरात संस्कृति का स्थानांतरण वी उप (एमएल) (10 - वी उप) प्रत्येक तनाव के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ YENB मीडिया से मिली. नई संस्कृति 30 पर रातोंरात एक 250 आरपीएम रोटेशन दर के साथ एक प्रकार के बरतन में डिग्री सेल्सियस 600 आयुध डिपो मूल्य 1.7-2.0 की रेंज में है जब तक. आगे बढ़ें
  7. उपाय और रिकॉर्ड आयुध डिपो प्रत्येक तरल संस्कृति के लिए 600 मूल्यों और चूना करने के लिए नीचे सूत्र का उपयोग करेंप्रत्येक तनाव के लिए 0.12 के अंतिम 600 आयुध डिपो देने के लिए घुसपैठ बफर के 50 मिलीलीटर में पतला होने के लिए आवश्यक मात्रा (वी inf) ulate.
    वी inf (एमएल) = (50 मिलीलीटर) एक्स (0.12) / 600 आयुध डिपो
  8. स्थानांतरण वी एक microcentrifuge ट्यूब प्रत्येक संस्कृति के संसाधनों (एमएल) और 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं नीचे स्पिन, सतह पर तैरनेवाला निकालें और फिर (10 मिमी एमईएस, 5.5 पीएच 10 मिलीलीटर घुसपैठ बफर में कोशिकाओं resuspend, 10 मिमी MgSO 4) संक्षिप्त vortexing द्वारा.
  9. मिक्स pBYGFP + pREP110 + p19 की कोशिकाओं resuspended, 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन, और घुसपैठ बफर की 50 मिलीलीटर की कुल में resuspend. इस Agrobacteria संयोजन GFP की geminiviral अभिव्यक्ति के लिए है.
  10. इसी तरह, Agrobacteria कोशिकाओं के निम्नलिखित संयोजन मिश्रण नीचे स्पिन और घुसपैठ बफर के 50 मिलीलीटर में उन्हें resuspend. वे शामिल हैं (1) pBYDsRed + pREP110 dsRed की geminiviral अभिव्यक्ति, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 के लिए + p19GFP और dsRed, (3) pREp110 GFP की MagnICON अभिव्यक्ति, (5) के लिए geminiviral अभिव्यक्ति की नकारात्मक नियंत्रण के रूप में + p19, (4) पिच-+ GFP pICH15879 + pCH14011 पिच-dsRed + pICH15879 + के सह अभिव्यक्ति geminiviral के लिए + p19 MagnICON dsRed की अभिव्यक्ति, और MagnICON अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में (6) pICH15879 + pCH14011 लिए pCH14011.

वैक्यूम घुसपैठ के लिए 2.2 तैयारी

  1. टीका लगाना और संस्कृति प्रत्येक GV3101 एक 50 मिलीलीटर autoclaved फ्लास्क में उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ YENB मीडिया के 15 मिलीलीटर में geminiviral वैक्टर या MagnICON वैक्टर युक्त तनाव और बढ़ने रातोंरात के रूप में ऊपर सिरिंज घुसपैठ के लिए वर्णित है.
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ YENB मीडिया की 250 मिलीलीटर में 0.025 का एक प्रारंभिक 600 आयुध डिपो के साथ एक नई संस्कृति के लिए subcultured होने के लिए आवश्यक मात्रा (वी उप) की गणना करने के लिए नीचे सूत्र का उपयोग के साथ एक तरल संस्कृति के लिए उपाय और रिकॉर्ड 600 आयुध डिपो मूल्यों .
    वी उप 600 आयुध डिपो
  3. स्थानांतरण वी करने के लिए रातोंरात संस्कृति के उप (एमएल) (250 - वी उप) प्रत्येक तनाव के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक 1 एल autoclaved कुप्पी में YENB मीडिया से मिली और रात के रूप में ऊपर सिरिंज घुसपैठ के लिए वर्णित नई संस्कृति बढ़ता है.
  4. उपाय और रिकॉर्ड आयुध डिपो प्रत्येक तरल संस्कृति के लिए 600 मूल्यों और प्रत्येक तनाव के लिए 0.12 के अंतिम 600 आयुध डिपो देने के लिए घुसपैठ बफर के 3 एल में पतला होने के लिए आवश्यक मात्रा (वी inf) की गणना करने के लिए नीचे सूत्र का उपयोग करें.
    वी inf (एमएल) = (3000 मिलीग्राम) एक्स (0.12) / 600 आयुध डिपो
  5. गोली और सिरिंज घुसपैठ के लिए वर्णित और सिरिंज घुसपैठ के लिए वर्णित संयोजनों के अनुसार resuspended संस्कृतियों के मिश्रण के रूप में घुसपैठ बफर में प्रत्येक संस्कृति की resuspend वी inf (एमएल). Repellet मिश्रित Agrobacteria कोशिकाओं और घुसपैठ बफर के 3 एल में उन्हें resuspend.

3.1 सिरिंज घुसपैठ

  1. चार 6 सप्ताह पुरानी एन चुनें 5 के साथ benthamiana पौधों प्रत्येक पत्ते. प्रत्येक संयंत्र के ऊपर से गिनती के पहले तीन पत्तियों ए के संयोजन में से एक के साथ पूरी तरह से घुसपैठ की जाएगी घुसपैठ बफर में उपभेदों tumefaciens. चौथा पत्ता होगा हाजिर घुसपैठ geminiviral अभिव्यक्ति के लिए सभी चार तनाव संयोजन या MagnICON अभिव्यक्ति के लिए सभी तीन संयोजन के साथ. प्रत्येक संयंत्र पर आखिरी पत्ता नकारात्मक नियंत्रण के संयोजन के साथ घुसपैठ की जाएगी.
  2. पत्ती के पीछे की ओर (2A चित्रा) पर epidermis में एक सुई के साथ एक छोटा सा निक बनाएँ. ध्यान दें: घुसपैठ मिश्रण में Agrobacteria कोशिकाओं पत्ती के दूसरे पक्ष को पंचर के माध्यम से पारित होगा, दोनों पक्षों के माध्यम से पत्ते में छेद करने के रूप में इतनी मेहनत खरोंच करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें.
  3. पत्ती के सामने पक्ष की एक फर्म पकड़ लो और कोमल आवेदन करते समयएक हाथ के अंगूठे के साथ निक काउंटर दबाव, एक सुई (चित्रा 2 बी) के बिना एक सिरिंज के साथ निक में घुसपैठ बफर में Agrobacterium मिश्रण इंजेक्षन. नोट: Agrobacterium मिश्रण पत्ती की कहनेवाला अंतरिक्ष में प्रवेश करती है, घुसपैठ क्षेत्र (चित्रा -2) जाहिरा तौर पर गहरे हरे रंग के हो जाएंगे.
  4. गहरे हरे रंग चक्र का विस्तार करने के लिए बंद हो जाता है जब तक निक में Agrobacterium मिश्रण इंजेक्षन करने के लिए आगे बढ़ें. पूरे पत्ती घुसपैठ और पूरी पत्ती पहले तीन पत्तियों और आखिरी पत्ती के लिए गहरे हरे रंग बदल जाता है जब तक एक और निक और दोहराने कदम 3.1.2-3.1.4 बनाएँ.
  5. प्रत्येक संयंत्र की चौथी पत्ती के लिए, सभी चार (geminiviral वेक्टर) या तीन (MagnICON वेक्टर) संयोजन इसे में घुसपैठ की जाएगी. Agrobacterium उपभेदों के प्रत्येक संयोजन के लिए एक निक करें, और एक संयोजन के साथ प्रत्येक निक घुसपैठ.
  6. घुसपैठ के बाद, वृद्धि कमरे और मोनी को पौधों वापस चाल2-15 दिनों के बाद घुसपैठ (डीपीआई) के बीच टो प्रोटीन अभिव्यक्ति.

3.2 वैक्यूम घुसपैठ

  1. एक निर्वात desiccator और टब को Agrobacterium उपभेदों युक्त स्थानांतरण 3 एल घुसपैठ बफर में एक टब रखें. एक Vacuubrand डायाफ्राम वैक्यूम पंप (चित्रा 3) के लिए desiccator जुड़ें.
  2. Desiccator प्लेट (3B चित्रा) पर उल्टा एक संयंत्र प्लेस और पूरी पत्ती और स्टेम प्रणाली टब के ऊपर आराम की थाली के साथ घुसपैठ बफर में डूबे हुए है जब तक संयंत्र के साथ थाली कम है. रिम साथ desiccator हे अंगूठी प्लेस और चैम्बर (चित्रा -3 सी) पर desiccator ढक्कन लगा.
  3. वैक्यूम पंप पर मुड़ें और वैक्यूम 100 मिलीबार पहुंचता है जब समय शुरू करते हैं. धीरे धीरे जलमग्न संयंत्र ऊतक का बीचवाला रिक्त स्थान में Agrobacteria के प्रवेश द्वार की अनुमति के लिए 100 मिलीबार पर 1 मिनट के बाद desiccator पर रिलीज वाल्व खुला. इस कदम से एक additi दोहराएँअच्छा घुसपैठ सुनिश्चित करने के लिए onal समय.
  4. घुसपैठ के बाद, desiccator के संयंत्र के बाहर ले और अपने ईमानदार स्थिति में वापस डाल दिया. 2-15 डीपीआई के बीच विकास का कमरा और मॉनिटर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पौधों को वापस ले जाएँ.

4. फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने और फोटोग्राफी

  1. अंधेरे कमरे में डीपीआई, चाल पौधों 2 से शुरू और एक हाथ से आयोजित यूवी दीपक के साथ घुसपैठ की पत्तियों के पीछे की ओर पराबैंगनी प्रकाश चमक रहा है.
  2. GFP या dsRed की लाल रोशनी की हरी प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करें. DsRed छोटी लहर पराबैंगनी प्रकाश के तहत मजबूत है, जबकि GFP, लंबी लहर पराबैंगनी प्रकाश के साथ एक मजबूत संकेत देता है.
  3. कोई फ्लैश के साथ एक नियमित रूप से डिजिटल कैमरा के साथ फ्लोरोसेंट पत्तों की तस्वीरें ले लो.
  4. अवलोकन या फोटोग्राफी के बाद विकास के कमरे में पौधों वापस ले जाएँ.

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Representative Results

1. सिरिंज घुसपैठ से फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति

Geminiviral और MagnICON - - एन में दो अलग deconstructed संयंत्र वायरल वैक्टर द्वारा - GFP और dsRed - संयंत्र के ऊतकों में Agrobacterium की सिरिंज घुसपैठ के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, हम दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति का परीक्षण किया benthamiana. एन के लिए पूरी तरह Agrobacteria युक्त geminiviral वैक्टर के साथ घुसपैठ कर रहे थे कि benthamiana पत्ते, GFP अभिव्यक्ति के रूप में जल्दी के रूप में 2 डीपीआई से शुरू होने वाले पराबैंगनी प्रकाश के तहत पूरे पत्ती क्षेत्र में मनाया और 4 डीपीआई (चित्रा 4C) में चोटी संचय पहुँच गया था. Geminiviral वेक्टर से यह जल्दी GFP अभिव्यक्ति अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन 14,16,18,19 के पिछले परिणामों के साथ संगत है. इसके विपरीत, MagnICON वेक्टर युक्त Agrobacterium संयोजन केवल 5 डीपीआई के बाद GFP प्रतिदीप्ति दिखाया और पहुंच गया इसकी अधिकतम accumulati साथ घुसपैठ पत्ते7 डीपीआई (चित्रा 4D) पर पर. कोई हरी प्रतिदीप्ति pREP110 की नकारात्मक नियंत्रण Agrobacterium मिश्रण के साथ घुसपैठ की पत्तियों से मनाया गया + p19 (चित्रा 4 बी) या pICH15879 प्रतिदीप्ति से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का परिणाम नहीं GFP जीन के लिए विशिष्ट था और था कि यह दर्शाता है + pCH14011 (नहीं दिखाया डेटा), पत्ते. अपने चरम संचय में MagnICON वेक्टर व्यक्त GFP की रोशनी पहले से अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन 8,18 के लिए प्राप्त परिणामों के समान geminiviral वेक्टर (चित्रा 4C और 4D), की तुलना में अधिक तीव्र है. लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न और dsRed के रिश्तेदार फ्लोरोसेंट तीव्रता GFP (नहीं दिखाया डेटा) के समान हैं. कोई बड़ी परिगलन GFP के निर्माणों (चित्रा -4 ए) के साथ घुसपैठ की पत्तियों पर मनाया गया. इसी तरह के परिणाम भी न तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन संयंत्र CE के लिए बेहद जहरीला है कि यह दर्शाता है, dsRed व्यक्त पौधों के लिए मनाया गयाLLS. हालांकि, निक स्थल पर स्थानीय परिगलन मनाया और वे फोटो में "छेद" (चित्रा 4) के रूप में दिखाई दिया था. दोनों फ्लोरोसेंट प्रोटीन सिरिंज हाजिर घुसपैठ साथ geminiviral वैक्टर के माध्यम से एक ही पत्ते पर व्यक्त किया गया है, वे वे घुसपैठ कर रहे थे जहां जगह (चित्रा 5) में उनकी उम्मीद फ्लोरोसेंट रंग के साथ पाया गया. दिलचस्प है, GFP के सह घुसपैठ और dsRed (चित्रा 5) पीले प्रतिदीप्ति में हुई. dsRed प्रतिदीप्ति की तीव्रता ही पत्ते पर GFP की है कि तुलना में कमजोर हो दिखाई दिया. हालांकि, इस dsRed के कमजोर अभिव्यक्ति प्रतिबिंबित नहीं कर सकते, लेकिन पराबैंगनी प्रकाश से dsRed की कम से अधिक इष्टतम उत्तेजना के लिए नहीं बल्कि कारण. कुल मिलाकर, हमारे परिणाम सिरिंज घुसपैठ कुशलतापूर्वक पुनः संयोजक जीन ले जाने के पौधे के पत्तों में Agrobacteria परिचय और हमारे लक्ष्य प्रोटीन की मजबूत अभिव्यक्ति में कहा कि परिणाम प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, हम इस विधि flexibil की अनुमति देता है कि प्रदर्शनअल्पसंख्यक या तो एक लक्ष्य प्रोटीन की अधिक से अधिक संचय के लिए पूरे पत्ते घुसपैठ करने या उनकी अभिव्यक्ति और अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना करने के लिए कई वैक्टर के साथ कई प्रोटीन लक्ष्य हाजिर-घुसपैठ की.

2. वैक्यूम घुसपैठ से फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति

वैक्यूम घुसपैठ भी संयंत्र क्षणिक अभिव्यक्ति सिस्टम द्वारा पुनः संयोजक प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक स्केलेबल agroinfiltration विधि विकसित करने के लिए जांच की गई थी. हमारे परिणाम लौकिक अभिव्यक्ति GFP के पैटर्न या geminiviral और MagnICON वैक्टर द्वारा dsRed घुसपैठ विधि के बदलाव से बदल दिया है और सिरिंज घुसपैठ के समान नहीं रह गया था कि संकेत मिलता है. एक संयंत्र की पूरी शूटिंग वैक्यूम घुसपैठ के दौरान घुसपैठ मिश्रण में डूब जाता है, प्रतिदीप्ति घुसपैठ पौधों की सभी पत्तियों के लिए GFP (चित्रा 6) के लिए मनाया गया. सिरिंज घुसपैठ के साथ तुलना में, यह और अधिक मजबूत है और कर सकते हैं एसीएक बहुत छोटे समय सीमा के साथ प्रत्येक संयंत्र की hieve घुसपैठ. उदाहरण के लिए, यह सिरिंज की घुसपैठ एक पूरे 6 सप्ताह पुरानी एन करने के लिए एक कुशल छात्र 15 मिनट लगते हैं benthamiana संयंत्र. इसके विपरीत, एक ही पौधे खत्म करने के लिए और कई पौधों को एक ही समय में घुसपैठ की जा सकती है शुरू से निर्वात से 3 मिनट में घुसपैठ की जा सकती है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एन 0 (ए) में पीट छर्रों और विकास ट्रे के साथ benthamiana पौधों की वृद्धि. जंगली प्रकार पौधों, 2 (बी), बोने के बाद 4 (सी) और 6 (डी) सप्ताह.

चित्रा 2
चित्रा 2. एन की सिरिंज घुसपैठ benthamiana पत्तेAgrobacterium tumefaciens साथ. ए के GV3101 तनाव GFP-व्यक्त MagnICON वैक्टर शरण tumefaciens घुसपैठ बफर में resuspended और एक सुई के बिना एक सिरिंज में भरी हुई थी. एक निक एक 6 सप्ताह पुराने पौधे की पत्ती (ए) के पीछे की ओर एक सुई के साथ बनाया गया था. सिरिंज के उद्घाटन के निक (बी) और घुसपैठ बफर में Agrobacteria निक (सी) के माध्यम से पत्ती की कहनेवाला अंतरिक्ष में इंजेक्शन थे के खिलाफ तैनात किया गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. एन के वैक्यूम घुसपैठ benthamiana Agrobacterium tumefaciens साथ छोड़ देता है. ए के तनाव GV3101 लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त वैक्टर युक्त tumefaciens infiltratio में resuspended थेएन बफर और एक 3 एल टब में भरा हुआ है. टब तो एक वैक्यूम पंप (ए) से जुड़ा था कि एक निर्वात desiccator में रखा गया था. एक 6 सप्ताह के पुराने संयंत्र desiccator थाली (बी) पर उल्टा रखा गया था. प्लेट चैम्बर (सी) के ऊपर रखा गया था के रूप में पूरे पत्ती और स्टेम व्यवस्था तो टब में डूब गया था. Agroinfiltration 1 मिनट के लिए दो बार 100 मिलीबार में एक निर्वात लागू करने और रिहा द्वारा प्राप्त किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा. सिरिंज में GFP की अभिव्यक्ति पत्तियों agroinfiltrated. पूरे एन benthamiana पत्तियों ए के तनाव GV3101 के साथ घुसपैठ कर रहे थे एक geminiviral (ए और सी) या MagnICON vect में GFP जीन शरण tumefaciensया (घ). नकारात्मक नियंत्रण पत्ते कि GFP जीन (बी) को शामिल नहीं करते कि Agrobacteria उपभेदों के साथ घुसपैठ कर रहे थे. पत्तियां 4 डीपीआई (एसी) या 7 डीपीआई (डी) में सफेद रोशनी (ए) या ​​पराबैंगनी प्रकाश (बी) के तहत फोटो खींच रहे थे.

चित्रा 5
चित्रा 5. GFP की अभिव्यक्ति और सिरिंज में dsRed हाजिर agroinfiltrated पत्तियों. एन benthamiana पत्तियों GV3101 dsRed GFP, या geminiviral वैक्टर में GFP और dsRed जीन दोनों को शरण देने के साथ हाजिर घुसपैठ थे. एक नकारात्मक नियंत्रण स्थान pREP110 + p19 के साथ घुसपैठ था. पत्तियां 4 डीपीआई पर पराबैंगनी प्रकाश के तहत फोटो खींच रहे थे.

चित्रा 6
6 चित्रा. वैक्यूम agroinfil में GFP की अभिव्यक्तिtrated पत्तियों. एन benthamiana पत्तियों GV3101 MagnICON वैक्टर में GFP जीन को शरण देने के साथ घुसपैठ कर रहे थे. पत्तियां 7 डीपीआई पर पराबैंगनी प्रकाश के तहत फोटो खींच रहे थे.

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Discussion

प्रोटीन आधारित दवाइयों के लिए बढ़ती मांग दुनिया भर में मजबूत, स्केलेबल, कम लागत और सुरक्षित हैं कि नई उत्पादन प्लेटफार्मों की आवश्यकता होती है. संयंत्रों दवा प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे होनहार वैकल्पिक उत्पादन प्रणालियों में से एक हो चला है. हाल के वर्षों में, deconstructed वायरस आधारित वैक्टर का विकास काफी गति और संयंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम 2,10 की उपज को बढ़ाता है जो पौधों में प्रोटीन, का क्षणिक अभिव्यक्ति सक्षम है. आगे क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली की उपयोगिता का अनुकूलन करने के लिए, हम संयंत्र के ऊतकों में लक्ष्य जीन युक्त Agrobacterium लागू करने के लिए एक सरल अभी तक कुशल और स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. हमारे परिणाम विधि पौधे के पत्ते और दो ​​फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP और dsRed की मजबूत उत्पादन में Agrobacterium के कुशल शुरूआत में हुई है सिरिंज या वैक्यूम या तो साथ कि agroinfiltration संकेत मिलता है.

कुशल सुनिश्चित करने के लिएNT के agroinfiltration और प्रोटीन के उत्पादन, निम्नलिखित महत्वपूर्ण मापदंडों को ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए. इन मानकों से विचलन कम agroinfiltration दक्षता में और बारी, कम लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति में हो सकता है.

1. संयंत्र विकास मंच और स्वास्थ्य. प्रयोगशालाओं के बीच इस विधि में सबसे अधिक संभावना चर घुसपैठ के लिए संयंत्र सामग्री है. पौधों phenotypically समान दिखाई दे सकते हैं, वहीं उनके विकास मंच और शारीरिक स्थिति काफी पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त करने में उनकी योग्यता को प्रभावित करती है. पौधों की वृद्धि और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रभाव डालता है जो विशिष्ट मानदंडों तापमान, आर्द्रता, प्रकाश तीव्रता, उर्वरक की आपूर्ति, संयंत्र टीका उम्र, और पत्ता घुसपैठ के बाद लक्ष्य प्रोटीन की अधिकतम संचय के लिए समय की आवश्यकता शामिल हैं. संयंत्रों लगातार दैनिक पानी और उर्वरक की बराबर मात्रा में प्राप्त करना चाहिए. संयंत्र के विकास की स्थिति में मामूली परिवर्तन काफी अंतिम siz बदल सकते हैंपौधों और पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त करने की क्षमता के ए. हमारे पिछले अध्ययनों प्राकृतिक प्रकाश के तहत बड़े पौधों अधिक पत्ती बायोमास मिले संकेत मिलता है कि, लेकिन प्रोटीन उपज कृत्रिम प्रकाश 4 के तहत हो कि तुलना में काफी कम है. इसलिए, कृत्रिम प्रकाश का उपयोग पौधों की वृद्धि के लिए पसंद की विधि है. हमारे परिणाम यह भी पता चलता है कि 25 में एक 16 घंटा प्रकाश / 8 घंटा अंधेरे चक्र ± 0.5 डिग्री सेल्सियस एन विकसित करने के लिए इष्टतम स्थिति है इस तरह के कृत्रिम प्रकाश व्यवस्था के तहत 4 benthamiana पौधों. हम बायोमास उपज पर्याप्त है, जबकि वे फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उच्च स्तर का उत्पादन के रूप में इन शर्तों के तहत, 6 सप्ताह के पौधों GFP और dsRed अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम उम्र के हैं कि प्रदर्शन किया. 6 सप्ताह से अधिक पुराने संयंत्रों अधिक बायोमास उत्पादन लेकिन घुसपैठ कक्ष 4 में फिट करने के लिए बहुत लंबे हैं. इसके अलावा, फूल नकारात्मक पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति 4 को प्रभावित करने, विकास के 6 सप्ताह के बाद विकसित करने के लिए शुरू करते हैं. नतीजतन, 6 सप्ताह के पौधों इष्टतम एल होतेबायोमास उपज, प्रोटीन संचय, और agroinfiltration में आसानी के संयुक्त की जरूरत है कि शेष EAF सामग्री.

2. ग्रोथ और Agrobacterium की घुसपैठ एकाग्रता. इस पद्धति में एक और महत्वपूर्ण बिंदु विकास और ए के घुसपैठ एकाग्रता का नियंत्रण है के रूप में आयुध डिपो के 600 से मापा tumefaciens,. ए की हर संस्कृति और उपसंस्कृति चरण में, उपभेदों tumefaciens करने के लिए विकसित किया जाना चाहिए, लेकिन नामित आयुध डिपो के 600 से अधिक. हम ए के कई सांद्रता की जांच की है नहीं एन के अंतिम घुसपैठ के लिए tumefaciens benthamiana 4 छोड़ देता है. कम Agrobacterium एकाग्रता कम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी, पौधों में लक्ष्य जीन की अपर्याप्त वितरण में परिणाम देगा. Agrobacterium की घुसपैठ एकाग्रता बहुत अधिक है, तो दूसरी ओर, यह घुसपैठ ऊतक में एक अत्यंत अनुभुत प्रतिक्रिया ट्रिगर किया जाएगा और नेक्रोसिस 20 को जन्म दे. हमारे अनुसंधानesults 600 आयुध डिपो = 0.12 Agrobacterium तनाव ऊतक परिगलन और कोशिका मृत्यु के कारण के बिना जीन का निर्माण की अधिकतम वितरण के लिए की जरूरत है कि शेष का प्रदर्शन किया. Agrobacterium के वांछित 600 आयुध डिपो घनत्व लगातार संस्कृति मीडिया, तापमान और संस्कृति समय का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.

3. वैक्यूम घुसपैठ के लिए, यह नामित वैक्यूम दबाव और घुसपैठ की अवधि का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे परिणाम Agrobacterium घुसपैठ मिश्रण से एक 3 एल टब लगभग 30 पौधों घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि संकेत मिलता है. 30 से अधिक पौधों में घुसपैठ करने की आवश्यकता है, तो Agrobacterium घुसपैठ मिश्रण का एक नया बैच आपूर्ति किए जाने की जरूरत है.

4. इस अखबार में प्रस्तुत विशिष्ट मानदंडों एन उपयोग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित कर रहे हैं विशेष परिस्थितियों में उगाया benthamiana पौधों deconstructed वायरस आधारित वैक्टर के साथ ऊपर वर्णित है. चर्चा के रूप में पहले, टीइस पद्धति में नियंत्रित करने के लिए वह सबसे मुश्किल पैरामीटर संयंत्र सामग्री है. हम पौधों और हम यहाँ वर्णित है और सभी मामलों 4,8,14,18,21-23 में उत्कृष्ट परिणाम प्राप्त घुसपैठ प्रक्रिया का उपयोग टीकों और चिकित्सीय प्रोटीन की एक किस्म व्यक्त की है. इन परिणामों से हम विकसित किया है शर्तों प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोगी हैं कि प्रदर्शन किया. हालांकि, अगर अलग मेजबान प्रजातियों के पौधे, अभिव्यक्ति वैक्टर, या अलग एन Benthamiana बढ़ती शर्तों घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस पद्धति में प्रत्येक पैरामीटर के प्रयोगों द्वारा फिर से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी.

कुल मिलाकर, हम सिरिंज और वैक्यूम के साथ agroinfiltration पुनः संयोजक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पौधों में Agrobacterium ले जाने के लक्ष्य जीन को पेश करने के लिए एक सरल अभी तक कुशल पद्धति है कि प्रदर्शन किया है. दोनों तरीकों अनुसंधान और उत्पादन के लक्ष्य के आधार पर अपने अद्वितीय फायदे हैं. सिरिंज घुसपैठ, requir सरल हैतों Agrobacterium संस्कृति और की ही छोटी मात्रा में महंगा पंप और निर्वात कक्षों की आवश्यकता नहीं है. इस रिपोर्ट में प्रदर्शन के रूप में, यह एक लक्ष्य जीन के साथ पूरी पत्ती घुसपैठ या एक पत्ती पर कई लक्ष्यों के जीन शुरू करने की जगह घुसपैठ का उपयोग करने के लिए या तो लचीलापन है. पूरे पत्ती घुसपैठ विधि अपने जैव रासायनिक लक्षण वर्णन, शुद्धि, और preclinical कार्यात्मक अध्ययन 1 के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के छोटे प्रयोगशाला पैमाने अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, जगह घुसपैठ पौधों को उनकी उपज, अभिव्यक्ति कैनेटीक्स और विषाक्तता तुलना करने के लिए एक पत्ती पर कई प्रोटीन लक्ष्य व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी ऐसी GFP के रूप में एक संवाददाता प्रोटीन की अभिव्यक्ति तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है या एक ही पत्ते पर अलग अभिव्यक्ति वैक्टर द्वारा संचालित dsRed किया जा सकता है. नतीजतन, प्रोटीन संचय और उनकी अभिव्यक्ति कैनेटीक्स ड्राइविंग में अलग वेक्टर की क्षमता होती जा सकता है. सिरिंज घुसपैठ की सादगी भी यह एक सक्षम बनाता हैसंभव उपकरण उच्च विद्यालय और जैव प्रौद्योगिकी और जेनेटिक इंजीनियरिंग के विषय में स्नातक छात्रों को पढ़ाने और प्रशिक्षित करने के लिए.

सिरिंज घुसपैठ के साथ इसकी तुलना में, निर्वात घुसपैठ वैक्यूम पंप और कक्षों और Agrobacterium संस्कृतियों की बड़ी मात्रा में निवेश की आवश्यकता है. बस कुछ पौधों में घुसपैठ करने की आवश्यकता है जब इसलिए, यह चुनाव का तरीका नहीं है. हालांकि, यह सिरिंज घुसपैठ से मिलान नहीं किया जा सकता कि scalability प्रदान करता है. यह और अधिक मजबूत है और समय की एक छोटी अवधि में पौधों की बड़ी संख्या में घुसपैठ कर सकते हैं. इस रिपोर्ट में प्रस्तुत पैमाने के साथ, हम एक चरण मैं मानव नैदानिक ​​परीक्षण 4 के लिए पर्याप्त दवा प्रोटीन शुद्ध ग्राम स्तर का उत्पादन करने में सक्षम हैं. इसके अलावा, इस प्रक्रिया पौधों से दवा प्रोटीन की व्यावसायिक निर्माण के लिए आगे बढ़ाया अप किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, प्रक्रियाओं एन के तीन मीट्रिक टन घुसपैठ वैक्यूम करने के लिए तैयार किया जा रहा प्रति घंटे benthamiana पौधोंएक बड़े पैमाने अप आपरेशन 24 में. वैक्यूम घुसपैठ का एक और लाभ यह सिरिंज घुसपैठ के लिए उत्तरदायी नहीं हैं कि पौधों की प्रजातियों agroinfiltrate के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सारांश में, सिरिंज और वैक्यूम घुसपैठ के संयोजन शोधकर्ताओं, biotechnologists और शिक्षकों के पौधों में पुनः संयोजक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए एक सरल, कुशल, मजबूत और स्केलेबल पद्धति प्रदान करता है. यह बहुत दवा प्रोटीन के विकास और उत्पादन को सुविधाजनक बनाने और विज्ञान की शिक्षा को बढ़ावा देंगे.

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Disclosures

लेखक कोई वित्तीय हितों की होड़ है.

Acknowledgments

हम आर रवि और उनके योगदान के लिए चेन प्रयोगशाला के अन्य छात्रों को सामग्री पीढ़ी संयंत्र के लिए धन्यवाद. हम भी प्रौद्योगिकी और अभिनव (सीटीआई) के कॉलेज में स्नातक अनुसंधान के अपने समर्थन के लिए डॉ. डी. ग्रीन धन्यवाद. इस शोध प्र. चेन के लिए एनआईएच अनुदान U01 AI075549 और 1R21AI101329, और प्र. चेन को एरिजोना स्टेट यूनिवर्सिटी के सीटीआई से एक द.पू. अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लालकृष्ण Leuzinger, एम. सेंध, जे हर्टाडो, और जे Stahnke द.पू. अनुदान द्वारा समर्थित स्नातक छात्र हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GFP Invitrogen V353-20 www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed Clontech 632152 www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector Icon Genetics n/a www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector Author’s Lab n/a See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana Author’s Lab n/a herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 Author’s Lab n/a See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates Sigma L0418 www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates Sigma L0543 www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate Sigma M2773-500 g www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone Fisher 73049-73-7 www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract Becton, Dickinson CO. REF 212750 www.bd.com
Difco Nutrient Broth Becton, Dickinson CO. REF 234000 www.bd.com
MES hydrate Buffer Sigma M8250-1kg www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin Sigma C1613-1ML www.sigmaaldrich.com
Kanamycin Sigma 70560-51-9 www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide Sigma 221465 www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer Hummert International Jul-25 www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump Fisher 13-878-113 www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve Fisher NC9386590 www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring Fisher 08-594-15C www.fishersci.com
3 L Tub Rubber-Maid n/a Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML Fisher NC9489269 www.fishersci.com
Peat Pellet Hummert International 14-2370-1 www.hummert.com
Propagation Tray Dome hydrofarm 132052 www.hydroponics.net
Propagaiton Tray hydrofarm 138758 www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder Gro-Mor INC n/a www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf Hummert International 65-6924-1 www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes Sigma CLS430172-500EA http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes Bio-Rad 223-9950 www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1415-2500 www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge Bio-Rad 166-0602EDU www.bio-rad.com
Incubator/Shaker Eppendorf Excella E25 www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 UVP 95-0021-12 www.uvp.com

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References

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पुनः संयोजक प्रोटीन का उच्च स्तर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पौधे के कुशल Agroinfiltration
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Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado,… More

Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado, J., Stahnke, J., Lai, H., Zhou, X., Chen, Q. Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (77), e50521, doi:10.3791/50521 (2013).

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