Effektiv Agroinfiltration of Plants for High-level Forbigående Expression of rekombinante proteiner
Summary
Planter tilby et nytt system for produksjon av farmasøytiske proteiner i kommersiell skala som er mer skalerbar og kostnadseffektiv og sikker enn dagens uttrykk paradigmer. I denne studien rapporterer vi en enkel og praktisk, men likevel skalerbar tilnærming for å introdusere target-genet inneholder<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Inn planter for protein forbigående uttrykk.
Abstract
Pattedyrcelle kultur er den store plattformen for kommersiell produksjon av humane vaksiner og terapeutiske proteiner. Men det kan ikke møte den økende verdensomspennende behov for farmasøytiske produkter på grunn av sin begrensede skalerbarhet og høye kostnader. Planter har vist seg å være en av de mest lovende alternative farmasøytisk produksjon plattformer som er robust, skalerbar, lave kostnader og trygt. Den senere tids utvikling av virus-baserte vektorer har gjort det mulig hurtig og høyt nivå forbigående ekspresjon av rekombinante proteiner i planter. For ytterligere å optimalisere nytten av forbigående uttrykk system, viser vi en enkel, effektiv og skalerbar metode for å introdusere target-genet inneholder Agrobacterium inn plantevev i denne studien. Våre resultater tyder på at både agroinfiltration med sprøyte og vakuum metoder har resultert i effektiv innføring av Agrobacterium inn i bladene og robust produksjonen av to fluorescerende proteiner; GFP og DsRed. Viderevi viser de unike fordelene som tilbys av begge metodene. Sprøyte infiltrasjon er enkel og trenger ikke dyrt utstyr. Den tillater også fleksibilitet til å enten infiltrere hele permisjon med ett mål gen, eller å innføre gener av flere mål på ett blad. Således kan den brukes for laboratorieskala ekspresjon av rekombinante proteiner, så vel som for sammenligning av forskjellige proteiner eller vektorer på avkastning eller ekspresjon kinetikk. Enkelheten av sprøyte infiltrasjon antyder også sin nytte i videregående skole og høyskole utdanning for faget av bioteknologi. I kontrast er vakuum infiltrasjon mer robust og kan være skalert opp for kommersiell produksjon av farmasøytiske proteiner. Det har også fordelen av å kunne agroinfiltrate plantearter som ikke er mottagelig for sprøyte infiltrasjon som salat og Arabidopsis. Samlet gir kombinasjonen av sprøyte og vakuum agroinfiltration forskere og lærere en enkel, effektiv og robustmetodikk for forbigående protein uttrykk. Det vil i stor grad rette for utvikling av farmasøytiske proteiner og fremme naturfag.
Introduction
Siden 1970 har plantene blitt utforsket som alternativer til pattedyr, insekt, og bakteriell cellekulturer for kommersiell produksjon av rekombinante proteiner og protein legemiddelselskap en. Plant-baserte systemer for uttrykket av biopharmaceuticals har vist lovende i de siste årene som flere nye behandlinger for sykdommer, som Gauchers sykdom 2, og aviær H5N1 influensa 3, har vist suksess i kliniske studier. Utviklingen av kompetente mekanismer for rekombinant protein uttrykk i planter i tiårene etter de innledende forsøkene har skapt et potensial for plante-baserte systemer for å endre gjeldende paradigmet av protein produksjonen for tre hovedgrunner. For det første er det en merkbar nedgang i kostnader som pattedyr, insekt, og bakteriell bioreaktorer kreve betydelige oppstart kostnader, dyre vekst media og kompliserte prosesser for nedstrøms rensing fire. Etableringen av stabile transgene planterlinjer også tillater dem å gå raskere enn skalerbarhet av andre ekspresjonssystemer som protein uttrykker planter kan dyrkes og høstes på en landbruks skala fem. Dernest plantebaserte ekspresjonssystemer i betydelig grad redusere risikoen for overføring av et humant eller animalsk patogen fra protein-uttrykkende vert til mennesker, demonstrerer overlegenhet i offentlig sikkerhet 6.. Til slutt, planter utnytte et eukaryot endomembransystemet system som ligner på pattedyrceller, slik at for riktig posttranslasjonell modifisering av proteiner, inkludert glykosylering og monteringen av multippel-subenheten proteiner 7. Denne evnen setter plante-baserte systemer forut for de som er basert på prokaryotiske systemer, slik som bakterier, siden et større antall farmasøytiske rekombinante proteiner, inkludert monoklonale antistoffer (mAbs), har en mer komplisert struktur og kreve omfattende modifikasjoner posttranslational eller monteringsprosedyrer 8..
Det er to store hensiktssmerter å uttrykke rekombinante proteiner i planter. Den første er utvikling av et stabilt transgen linje, hvor DNA som koder for det aktuelle protein er klonet inn i en ekspresjonskassett og introdusert til enten den kjernefysiske eller kloroplast genomer. Ved å gjøre det, blir det fremmede DNA arvelige gjennom påfølgende generasjoner og gir mulighet for enormt forbedret skalerbarhet, langt over det andre ekspresjonssystemer en. Innføring av eksogene DNA til den kjernefysiske genom er vanligvis oppnås ved Agrobacterium tumefaciens infeksjon av plante vev, eller sjeldnere, etter microprojectile bombardement av vevet ni. Plantehormoner blir så brukt for å indusere differensiering og vekst av transgene plantevev slik som røtter og blader. Transformasjon av kloroplast genomet kan ikke oppnås med A. tumefaciens, men helt avhengig gull eller wolfram partikler belagt med DNA sparken ballistically inn i planteceller. Den andre metoden for å uttrykke recombinant protein i planter er gjennom forbigående uttrykk 10. I dette scenariet er virus-deriverte vektorer genet av interesse levert via A. tumefaciens til fullt utviklede planter gjennom en prosess som kalles agroinfiltration. I stedet for å integrere inn i anlegget genomet, blir levert genkonstruksjon deretter begynne å lede den forbigående produksjon av det ønskede protein, som kan høstes og isolert etter en kort inkuberingsperiode. Transient genekspresjon gir fordelen av større samlet proteinakkumulering, så vel som en forbedret tid for produksjon av protein, som planter vil være klar til å høste omtrent 1-2 uker etter agroinfiltration 11.. Dette er betydelig raskere enn prosesser av generasjon, utvelgelse, og bekreftelse av stabile transgene planter linjer, som kan ta flere måneder til et år. Dette er imidlertid også en begrensning av den transiente ekspresjonssystem, da den ikke vil gi genetisk stabilt anlegg liien som kan brukes til å generere et frø bank for storskala kommersiell produksjon. Til tross for dette har det blitt utviklet metoder for å forbedre stor skala transient ekspresjon. Her viser vi en metode for generering av forbigående protein-uttrykker Nicotiana benthamiana planter ved hjelp av dekonstruerte virale vektorer levert av A. tumefaciens.
To viktige metoder blir utviklet for levering av A. tumefaciens i plantevev: benk skala infiltrasjon via sprøyte og stor skala infiltrasjon via vakuum kammer. Begge protokollene er beskrevet her bruker N. benthamiana, som er nært knyttet til den felles tobakksplanten, som vert anlegg for forbigående uttrykk av to fluoriserende proteiner: den grønne fluorescerende protein (GFP) fra maneter Aequorea victoria og den røde fluorescerende protein fra Discosoma korall (DsRed) 12,13. N. benthamiana er den vanligste for vertsplantenrekombinant protein fordi det er mottagelig for genetisk transformasjon, kan gi store mengder biomasse raskt, og er en produktiv frø produsent for oppskalering produksjon 14. En annen fordel med å bruke N. benthamiana som verter for protein uttrykk er tilgjengeligheten av en rekke ekspresjonsvektorene 2,5. I denne studien, to dekonstruerte virale vektorer, en basert på en tobakk mosaikk virus (TMV) RNA replikonsystemet (MagnICON vektorer) og andre avledet fra bønne gul dverg virus (BeYDV) DNA replikonsystemet (geminiviral vektorer) 4,11, 15-18, er vant til å bære GFP og DsRed genet og gi dem i N. benthamiana celler via A. tumefaciens. Tre DNA-konstruksjoner vil bli brukt for GFP eller DsRed uttrykk med MagnICON vektorer. De omfatter 5'-modul (pICH15879) som inneholder promotor og andre genetiske elementer for å drive ekspresjon av målgenet, 3'-modul som inneholder genet av interesse (pich-GFP eller pich-DsRed) og integrase modul (pICH14011) som koder for et enzym som integrerer de 5 'og 3' modulene sammen ved uttrykket 8,15. Tre DNA-konstruksjoner er også nødvendig for uttrykk med geminiviral vektorer. I tillegg til vektorer som inneholder replikonet av målgenet (pBYGFP eller pBYDsRed), er en vektor som koder for replikering protein (pREP110) som kreves for amplifikasjon av mål-replikon 11,14,16. Videre er inkluderingen av en vektor koding stanse suppressor p19 fra tomat buskete stunt virus ønsket for høy target genuttrykk 11,16.
Det er vanligvis tre hovedtrinn for innføring av gener av rekombinante proteiner i planteceller ved agroinfiltration inkludert plantevekst, A. tumefaciens kultur forberedelse, og infiltrasjon. Som hvert trinn er kritisk for den ultimate suksess for denne prosedyren derfor en detaljert beskrivelse for hver er gittfor både sprøyte infiltrasjon og vakuum infiltrasjon under.
Protocol
Representative Results
Discussion
De økte kravene til protein-baserte legemidler over hele verden krever nye produksjonsplattformer som er robust, skalerbar, lave kostnader og trygt. Plantene har vist seg å være en av de mest lovende alternativ produksjonssystemer for farmasøytisk proteinproduksjon. I de senere årene har utviklingen av dekonstruerte virus-baserte vektorer aktivert forbigående uttrykk av proteiner i planter, som i stor grad forbedrer hastigheten og utbytte av anlegget ekspresjonssystemer 2,10. For ytterligere å optimali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker R. Sun og andre studenter av Chens Laboratory for deres bidrag til plantemateriale generasjon. Vi vil også takke Dr. D. Grønn for sin støtte til lågare forskning i College of Technology og innovasjon (CTI). Denne forskningen ble støttet delvis av NIH tilskudd U01 AI075549 og 1R21AI101329 til Q. Chen, og en SSE stipend fra CTI av Arizona State University til Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, og J. Stahnke er lavere grads studenter som støttes av SSE tilskuddet.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
