Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков
Summary
Растения предложить новую систему для производства фармацевтических белков в промышленном масштабе, который является более масштабируемым, экономически эффективным и безопасным, чем текущий парадигмы выражения. В этом исследовании мы сообщаем простой и удобный, но масштабируемый подход ввести целевой ген, содержащий<em> Agrobacterium tumefaciens</em> В растения для временной экспрессии белка.
Abstract
Культуре клеток млекопитающих является основной платформы для коммерческого производства вакцин для человека и терапевтических белков. Тем не менее, она не может удовлетворить растущий во всем мире спрос на лекарственные из-за его ограниченной масштабируемостью и высокой стоимостью. Растения показано, что одним из наиболее перспективных альтернативных платформ фармацевтического производства, которые являются надежной, масштабируемой, недорогой и безопасный. Недавнее развитие вируса векторы на основе позволило быстро и на высоком уровне временной экспрессии рекомбинантных белков в растениях. Для дальнейшей оптимизации полезности переходные системы экспрессии, мы демонстрируем простое, эффективное и масштабируемое методологии ввести целевой ген, содержащий Agrobacterium в ткань растений в данном исследовании. Наши результаты показывают, что агроинфильтрации как с шприц и вакуумные методы привели к эффективному введение в Agrobacterium листьев и надежный выпуск двух флуоресцентные белки, GFP и DsRed. Кроме того,мы демонстрируем уникальные достоинства обоих методов. Шприц инфильтрации прост и не требует дорогостоящего оборудования. Это также позволяет гибко либо проникать весь отпуск одного гена-мишени, или для введения генов из нескольких целей на одном листе. Таким образом, он может быть использован для лабораторного масштаба экспрессии рекомбинантных белков, а также для сравнения различных белков или векторы выход или выражение кинетики. Простота шприц инфильтрации также предполагает его полезность в средней школе и колледже образования для предмета биотехнологии. В отличие от вакуумной инфильтрации является более надежной и может быть расширены для коммерческого производства фармацевтических белков. Он также предлагает то преимущество, что в состоянии agroinfiltrate видов растений, которые не поддаются для шприца инфильтрации, такие как салат и Arabidopsis. В целом, сочетание и вакуумного шприца агроинфильтрации предоставляет исследователям и педагогам простой, эффективный и надежныйМетодология временной экспрессии белка. Это будет в значительной степени способствовать развитию фармацевтических белков и поощрения научного образования.
Introduction
С 1970-х растений были изучены в качестве альтернативы млекопитающих, насекомых и бактериальные культуры клеток для промышленного производства рекомбинантных белков и белковых терапевтических 1. Завод-систем для выражения биофармацевтических препаратов показали обещание в последние годы в несколько обработок романа для заболевания, как болезнь Гоше 2, и птичьего гриппа H5N1 3, показали успехи в клинических испытаниях. Развитие компетентного механизмы экспрессии рекомбинантных белков в растениях в течение десятилетий после тех первых экспериментов были созданы возможности для растительных систем для изменения существующей парадигмы производства белка по трем основным причинам. Во-первых, существует заметное снижение стоимости, как млекопитающих, насекомых, и бактериальные биореакторов потребует значительных стартовых затрат, дорогих питательных сред и сложных процессов для последующей очистки 4. Создание стабильных трансгенного растениялиний также позволяет им опережать масштабируемости в системах экспрессии белка как выражения растения могут быть выращены и собраны на сельскохозяйственных масштабе 5. Во-вторых, растительных системах экспрессии значительно снизить риск передачи человека или животного патогена из белка, экспрессирующих множество для человека, демонстрирующий превосходство в общественной безопасности 6. Наконец, растения используют эукариотической системе endomembrane, который похож на клетки млекопитающих, что позволяет должным пост-трансляционной модификации белков, включая гликозилирования и сборка нескольких субъединиц белки 7. Эта способность ставит растительных системах раньше тех, на основе прокариотических системах, таких как бактерии, так как более широкий круг фармацевтических рекомбинантных белков, в том числе моноклональных антител (МКА), имеют более сложную структуру и требуют больших посттрансляционных модификаций или сборки 8.
Есть два основных соответствуюболи в экспрессирующих рекомбинантные белки в растениях. Первым является разработка стабильно трансгенной линии, где ДНК, кодирующей целевой белок, клонировали в экспрессирующую кассету и введены либо к ядерной или хлоропластов геномов. При этом чужеродной ДНК становится наследственной через грядущие поколения и позволяет значительной мере улучшилась масштабируемость, намного превосходящее другие системы выражения 1. Введение экзогенной ДНК в ядерном геноме обычно достигается путем Agrobacterium tumefaciens инфекции тканей растений или, реже, на бомбардировки микрочастицами ткани 9. Завод гормонов затем используются для индукции дифференцировки и роста тканей трансгенных растений, таких как корней и листьев. Трансформация геном хлоропласта не может быть достигнуто с А. tumefaciens, но полностью полагается на золотые или вольфрамовые частицы, покрытые ДНК уволен баллистическим в клетки растений. Второй способ выражения рекомбинацииNT белка в растениях через временной экспрессии 10. В этом случае вирус полученных векторов, содержащих ген доставляется через А. tumefaciens в полной мере разработаны растений посредством процесса, называемого агроинфильтрации. Вместо интеграции в геном растения, поставленного генная конструкция начнет направлять переходного производства желаемого белка, которые могут быть собраны и изолированы после короткого периода инкубации. Переходные экспрессии гена дает преимущество более высокой общей накопление белка, а также улучшенное время производства белка, как растения будут готовы для сбора примерно через 1-2 недели после агроинфильтрации 11. Это значительно быстрее, чем процессы генерации, выбора и подтверждения стабильного линии трансгенных растений, что может занять от нескольких месяцев до года. Это, однако, является также ограничение переходного системы экспрессии, так как она не даст генетически стабильными завода Лидругом месте, которые могут быть использованы для создания банка семян для крупномасштабного коммерческого производства. Несмотря на это, подходы были разработаны для улучшения больших масштабах временной экспрессии. Здесь мы показываем один метод генерации переходных белка-экспрессирующие растения Nicotiana benthamiana деконструкции использованием вирусных векторов выступил А. tumefaciens.
Две основные методы разрабатываются для доставки А. tumefaciens в ткань растений: стендовом инфильтрации через шприц и большие масштабы инфильтрации через вакуумную камеру. Оба протокола описаны здесь используя N. benthamiana, которая тесно связана с общим завода табака, а растения-хозяина для временной экспрессии двух флуоресцентных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea Виктории и красного флуоресцентного белка из Discosoma коралл (DsRed) 12,13. Н. benthamiana является наиболее распространенным растением-хозяиномрекомбинантного белка, потому что это поддается генетической трансформации, может дать большое количество биомассы быстро, и плодовитый производитель семян для расширения масштабов производства 14. Другое преимущество использования N. benthamiana качестве хозяев для экспрессии белка является наличие различных векторов экспрессии 2,5. В этом исследовании, вскрывают две вирусные векторы, основанный на вирус табачной мозаики (ВТМ) РНК репликона системы (MagnICON векторы) и другие, полученные из бобов вирус желтой карликовости (BeYDV) ДНК репликон системы (geminiviral векторы), 4,11, 15-18, которые используются для выполнения GFP и ген DsRed и доставить их в N. benthamiana клеток с помощью А. tumefaciens. Три конструкции ДНК будет использоваться для GFP или DsRed выражение с MagnICON векторов. Они включают в себя 5 'модуль (pICH15879), содержащий промотор и другие генетические элементы для запуска экспрессии гена-мишени, 3'-модуль, содержащий представляющий интерес ген (PICH-GFP или PICH-DsRed) и интегразы модуль (pICH14011), кодирующий фермент, который объединяет 5 'и 3' модулей вместе при экспрессии 8,15. Три конструкции ДНК также необходимы для выражения geminiviral векторов. В дополнение к векторы, содержащие репликон гена-мишени (pBYGFP или pBYDsRed), вектор кодирующий белок репликации (pREP110) требуется для амплификации целевой репликон 11,14,16. Кроме того, включение вектор, кодирующий p19 супрессоров глушителей из томатной густые вируса трюков желательно за высокий уровень Экспрессия гена-мишени 11,16.
Есть вообще три основных этапа для введения генов рекомбинантных белков в клетки растений путем агроинфильтрации в том числе рост растений, А. tumefaciens культуры подготовки и инфильтрации. Как и каждый шаг имеет решающее значение для конечного успеха этой процедуры, поэтому, подробное описание для каждого предусмотрендля инфильтрации шприц и вакуумной инфильтрации ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растущие требования к основе белка во всем мире фармацевтическая требуют новых добывающих платформ, которые являются надежной, масштабируемой, недорогой и безопасный. Растения показано, что одним из наиболее перспективных альтернативных производственных систем для фармацевтическо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Р. ВС и другими студентами Лаборатории Чэня за их вклад в растительный материал поколения. Мы также благодарим доктора Д. Грин за поддержку исследований студентов в колледже технологии и инноваций (CTI). Это исследование было частично поддержана грантами NIH U01 AI075549 и 1R21AI101329 к Q. Chen, и SSE грант от CTI из Университета штата Аризона в Q. Chen. Leuzinger К., М. Дент, J. Уртадо, Дж. Stahnke являются студенты поддерживают SSE гранта.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
