Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes
Summary
Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene<em> Agrobacterium tumefaciens</em> En plantas para la expresión transitoria de proteínas.
Abstract
Cultivo de células de mamíferos es la plataforma importante para la producción comercial de vacunas humanas y proteínas terapéuticas. Sin embargo, no puede satisfacer la creciente demanda mundial de productos farmacéuticos, debido a su limitada capacidad de ampliación y alto costo. Las plantas han demostrado ser una de las plataformas de producción farmacéuticas alternativas más prometedoras que son robustas, escalable, de bajo coste y seguro. El reciente desarrollo de vectores basados en virus ha permitido la expresión transitoria rápida y de alto nivel de proteínas recombinantes en plantas. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, se demuestra una metodología simple, eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en tejido de la planta en este estudio. Nuestros resultados indican que tanto agroinfiltración con jeringa de vacío y métodos han dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas y de producción robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed. Por otra parte,demostramos las ventajas únicas que ofrece por ambos métodos. Infiltración de jeringa es simple y no necesita un equipo costoso. También permite la flexibilidad para infiltrarse ya sea toda la licencia con un solo gen diana, o para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. Por lo tanto, se puede utilizar para la expresión a escala de laboratorio de proteínas recombinantes, así como para la comparación de diferentes proteínas o vectores de rendimiento o expresión cinética. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también sugiere su utilidad en la escuela secundaria y la educación universitaria para el tema de la biotecnología. Por el contrario, la infiltración de vacío es más robusto y puede ser mayor escala para la fabricación comercial de proteínas farmacéuticas. También ofrece la ventaja de ser capaz de agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa como la lechuga y Arabidopsis. En general, la combinación de jeringa y agroinfiltración de vacío proporciona a los investigadores y educadores un simple, eficiente y robustometodología para la expresión de proteína transitoria. Además, facilitará en gran medida el desarrollo de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.
Introduction
Desde la década de 1970, las plantas han sido explorados como alternativas a los cultivos de células de mamíferos, insectos, y bacteriana para la producción comercial de proteínas recombinantes y proteínas terapéuticas 1. Sistemas a base de plantas para la expresión de los productos biofarmacéuticos han demostrado ser prometedores en los últimos años varios nuevos tratamientos para enfermedades, como la enfermedad de Gaucher 2, y la gripe aviar H5N1 3, han demostrado tener éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo de mecanismos competentes para la expresión de proteínas recombinantes en plantas en las décadas desde los primeros experimentos se ha creado el potencial para los sistemas basados en plantas para alterar el paradigma actual de la producción de proteínas por tres razones principales. En primer lugar, hay una disminución notable en coste como biorreactores de mamíferos, insectos, y bacteriana requieren considerables costos de inicio, medios de cultivo costosos, complicados y procesos para la purificación aguas abajo 4. La creación de plantas transgénicas estableslíneas también les permite superan la escalabilidad de otros sistemas de expresión como las plantas que expresan proteínas podrían ser cultivados y cosechados a escala agrícola 5. En segundo lugar, los sistemas de expresión basados en plantas reducen significativamente el riesgo de transmitir un patógeno humano o animal desde el host expresan la proteína a los seres humanos, lo que demuestra la superioridad en la seguridad pública 6. Por último, las plantas utilizan un sistema de endomembranas eucariota que es similar a las células de mamíferos, lo que permite apropiada modificación post-traduccional de proteínas, incluyendo glicosilación y el ensamblaje de las proteínas de la subunidad múltiple 7. Esta capacidad pone los sistemas a base de plantas por delante de los basados en sistemas procariotas, tales como bacterias, ya que un número más amplio de proteínas farmacéuticas recombinantes, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb), tienen una estructura más complicada y requerir extensas modificaciones posteriores a la traducción o de montaje 8.
Hay dos grandes aprodolores de la expresión de proteínas recombinantes en plantas. El primero es el desarrollo de una línea transgénica de manera estable, donde el ADN que codifica para la proteína diana se clona en un casete de expresión y se introduce a cualquiera de los genomas nucleares o de cloroplastos. De este modo, el ADN extraño se convierte en heredables a través de las generaciones sucesivas y permite enormemente mejorado escalabilidad, mucho más allá de la de otros sistemas de expresión 1. La introducción de ADN exógeno al genoma nuclear se logra por lo general por la infección de Agrobacterium tumefaciens del tejido de la planta o, con menos frecuencia, por bombardeo con microproyectiles de los tejidos 9. Las hormonas vegetales se utilizan entonces para inducir la diferenciación y el crecimiento de tejido de la planta transgénica, tales como raíces y hojas. La transformación del genoma del cloroplasto no se puede lograr con A. tumefaciens, pero depende enteramente de oro o tungsteno recubiertas con ADN dispararon balísticamente en las células vegetales. El segundo método de expresión de recombinaciónproteína nt de plantas es a través de la expresión transitoria 10. En este escenario, los vectores derivados de virus que albergan el gen de interés se entregan a través de A. tumefaciens a plantas completamente desarrolladas a través de un proceso llamado agroinfiltration. En lugar de integrarse en el genoma de la planta, la construcción del gen entregado entonces comenzará a dirigir la producción transitoria de la proteína deseada, que se puede recoger y aislado después de un corto período de incubación. Expresión transitoria de genes ofrece la ventaja de una mayor acumulación de proteínas en general, así como una mejora del tiempo de producción de proteínas, como las plantas estarán listas para la cosecha de aproximadamente 1-2 semanas después de la agroinfiltración 11. Esto es significativamente más rápido que los procesos de generación, selección, y la confirmación de líneas estables de plantas transgénicas, que pueden tardar varios meses a un año. Sin embargo, esta es también la limitación del sistema de expresión transitoria, ya que no dará lugar a la planta genéticamente estable lines que se pueden utilizar para generar un banco de semillas para la producción comercial a gran escala. A pesar de esto, se han desarrollado enfoques para mejorar la expresión transitoria a gran escala. Aquí se demuestra un método de generación de proteínas que expresan plantas de Nicotiana benthamiana transitorios usando vectores virales deconstruidos entregados por A. tumefaciens.
Dos métodos principales se están desarrollando para la entrega de A. tumefaciens en el tejido vegetal: Banco infiltración escala mediante una jeringa y la infiltración a gran escala a través de la cámara de vacío. Ambos protocolos se describen aquí usando N. benthamiana, que está estrechamente relacionado con la planta de tabaco común, ya que la planta huésped para la expresión transitoria de dos proteínas fluorescentes: la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria y la proteína fluorescente roja de Discosoma de coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana es la planta huésped más común paraproteína recombinante, ya que es susceptible de transformación genética, puede producir grandes cantidades de biomasa con rapidez, y es un prolífico productor de semillas para la producción de ampliación 14. Otra ventaja de la utilización de N. benthamiana como huéspedes para la expresión de la proteína es la disponibilidad de una variedad de vectores de expresión de 2,5. En este estudio, dos vectores virales deconstruido, uno basado en un virus del mosaico del tabaco (TMV) ARN replicón sistema (vectores magnICON) y la otra derivada del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) sistema de replicón de ADN (vectores geminiviral) 4,11, 15-18, se utilizan para llevar el gen GFP y DsRed y entregarlos en N. células benthamiana mediante A. tumefaciens. Tres construcciones de ADN serán utilizados para GFP o expresión DsRed con vectores magnICON. Ellos incluyen 'módulo (pICH15879) que contiene el promotor y otros elementos genéticos para la conducción de la expresión del gen diana, el 3' del módulo 5 que contiene el gen de interés (PICH-GFP o Pich-DsRed), y el módulo de la integrasa (pICH14011) que codifica para una enzima que integra el 5 'y 3' módulos juntos tras la expresión 8,15. También se necesitan tres construcciones de ADN para la expresión con vectores geminiviral. Además de los vectores que contienen el replicón del gen diana (pBYGFP o pBYDsRed), se requiere un vector que codifica para la proteína de replicación (pREP110) para la amplificación de la diana replicón 11,14,16. Por otra parte, se desea la inclusión de un vector que codifica la p19 supresor de silenciamiento del virus del enanismo ramificado del tomate para la expresión del gen diana de alto nivel de 11,16.
En general, existen tres pasos principales para la introducción de genes de proteínas recombinantes en células de plantas por agroinfiltration incluyendo el crecimiento de la planta, A. preparación de cultivo tumefaciens, y la infiltración. Se ofrece como cada paso es fundamental para el éxito final de este procedimiento, por lo tanto, una descripción detallada de cadatanto para la infiltración de jeringa y la infiltración al vacío a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La creciente demanda de productos farmacéuticos basados en proteínas en todo el mundo requieren de nuevas plataformas de producción que son robustas, escalables y de bajo costo y seguro. Las plantas han demostrado ser uno de los sistemas de producción alternativas más prometedoras para la producción de la proteína farmacéutica. En los últimos años, el desarrollo de vectores basados en virus deconstruido ha permitido la expresión transitoria de proteínas en plantas, lo que mejora en gran medida la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a R. Sun y otros estudiantes de laboratorio de Chen por su contribución a la generación de plantar material. También agradecemos al Dr. D. Green por su apoyo a la investigación universitaria en la Facultad de Tecnología e Innovación (CTI). Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones del NIH U01 AI075549 y 1R21AI101329 al P. Chen, y una donación de SSE de CTI, de la Universidad del Estado de Arizona a Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado y J. Stahnke son estudiantes universitarios apoyados por la concesión SSE.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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