该<em>在OVO</em>绒毛尿囊膜(CAM)接枝源性肉瘤的新鲜肿瘤组织中,其单细胞悬液,并永久和瞬态荧光标记的建立肉瘤细胞株。该模型用于研究移植(活力,Ki67的增殖指数,坏死,浸润)和主机(成纤维细胞浸润,血管长入)的行为。
肉瘤是一种非常罕见的疾病,在本质上是异质的,都阻碍了发展的新疗法。肉瘤患者的理想人选后分层的个性化医学,解释目前在开发这种疾病的一个重现性好,成本低的异种移植模型的兴趣。鸡胚绒毛尿囊膜,是一种天然的免疫缺陷宿主能够维持嫁接的组织和细胞,没有种属特异性的限制。此外,它很容易访问,操纵和使用光学和荧光立体显微镜成像。组织学进一步允许异型细胞相互作用的详细分析。
该协议详细描述了OVO绒毛尿囊膜移植肉瘤派生的新鲜肿瘤组织,其单细胞悬液,和永久和瞬态荧光标记的建立肉瘤细胞株(系Saos-2和SW1353)。小鸡存活大鼠上课是高达75%。该模型用于研究移植(活力,Ki67的增殖指数,坏死,浸润)和主机(成纤维细胞浸润,血管长入)的行为。对于单细胞悬液的本地化嫁接,ECM凝胶提供了显着的优势,在惰性容器材料。 Ki67增殖指数的距离的凸轮表面的细胞和CAM上,后者确定的治疗产品的另外的时间框架中的应用的持续时间有关。
肉瘤是一种罕见的肿瘤治疗抵抗1,2由于死亡率高的结缔组织。患者的生存率进展受阻低的年发病,其广泛的多样性,以及肉瘤细胞的事实,据报道, 在体外难以培养3,4。
使用培养细胞的临床前治疗评价已经表明,新的,显然是在体外的活性分子并不总是反映在临床上的结果。此外,揭示了基因表达阵列的基因畸变并不总是与个别病人5-7的肿瘤行为特征。为了试图解决这些问题,已经获得了个性化医疗的重要性,这也反映在增加搜索异种移植模型8-12。
在体内试验中的一种反映复杂的相互作用的优点是与c的相关关系在固体肿瘤细胞与宿主组织环境,必要的癌细胞增殖和侵袭13。目前,我们研究使用绒毛膜尿囊膜法(CAM法)作为一个可重复的异种移植物模型肉瘤14,15。本试剂盒被广泛用于肿瘤血管生成的研究16,17。然而,在文献中,我们已经发现这个实验的不同的协议,而其他的研究观察到的生长或血管生成的显着性差异,根据不同的协议18,19。
在这篇文章中,我们探讨不同的CAM检测条件对细胞行为的肿瘤移植,肿瘤来源的单细胞悬液和既定的肉瘤细胞培养的效果。
接种和收获的时间
时序进行SAOS2天接种ECM凝胶(36的CAM)和胚胎发育天5和10之间变化。
孵化前9天,CAM是不能持续大到足以支持我们采用ECM凝胶。收获时,肿瘤细胞有时不得不从更深的CAM检索,并在蛋白或CAM一些ECM凝胶样品躺在松动。在第5和第6天,这是很难避免把小鸡畸形或死亡,导致肿瘤细胞鸡胚。从第9天,在CAM被完全覆盖的大部分鸡蛋的窗口下面的表?…
The authors have nothing to disclose.
从SW1353软骨肉瘤细胞系细胞恳请教授的PCW Hogendoorn博士,荷兰莱顿大学教授J.博维。我们感谢的J. Mestach和G. Wagemans优秀的技术援助,G.德Bruyne专业绘图概述我们的协议。
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
DMSO | Sigma | D8418 |
Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
G418 | Invitrogen | 11811031 |
Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
PBS | Invitrogen | 20012019 |
PBSD | Invitrogen | 14040083 |
peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
Name of Equipment | Company | Catalog Number |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |