Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.
Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2), bir serin-tireonin kinaz, kompleks protein etki alanının bir Ras (ROC), ROC etki (COR) bir C-terminali dahil olmak üzere, benzer bir etki organizasyon paylaşan paraloglarıdır ve lösin bakımından zengin ve N-terminalinde ankirin-benzeri tekrarlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri LRRK2 Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde implike ise ancak LRRK1, 1,2 sinyal tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, aydınlatılamamıştır henüz. Bu raporda, bu şekilde, bu hücreler 2 proteinlerin genel fosforilasyon seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan, 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 proteinleri etiketlemek için bir protokol mevcut. Kısacası, afinite LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sonra hücreler tarafından asimile sadece bir kaçinkübasyon süresi ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri, bu şekilde radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi ile (3xflag) LRRK proteinlerin immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerinden izole edilmiştir. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir. Protokol kolayca hücrelerinde ifade edilir ve immüno-çökeltme ile izole edilebilir herhangi bir başka proteinin fosforilasyonunu izlemek için adapte edilebilir.
Lösin zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) benzer bir etki organizasyon paylaşan multidomain paraloglarıdır. Her iki protein de etkili ROCO protein ailesine 5,6 proteinleri de sınıflandırma, GTPases (Complex Proteinlerin Ras veya ROC) Ras ailesi, hem de etki ROC (COR) bir C-terminaline yakın bir GTPaz dizisini kodlar. Sadece LRRK2 İlave armadillo Domein 6-8 kodlayan ise ROC-COR etki tandem N-terminal, her iki proteinin de, bir lösin-zengini tekrar etki hem de ankirin benzeri alanı kodlar. Sadece LRRK2 C-terminal bölgesinde 8, içinde bir WD40 alanını şifreleyen ise ROC-COR C-terminal, her iki proteinin de, bir serin-tireonin kinaz etki alanını paylaşırlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri ancak LRRK1 1,2 işaret tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, henüz aydınlatılamamıştır varken Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde LRRK2 için bir role genetik kanıtlar.
<pclass = "jove_content"> proteinlerin fosforilasyonu hücrelerinde ortak düzenleyici mekanizmadır. Örneğin, fosforilasyon enzim aktivasyonu için bir sinyal ya da kompleksine protein alımı için gerekli olabilir. LRRK2 hücresel fosforilasyonu yaygın olarak karakterize edilmiştir ve phosphosite eşleme ankirin tekrar ve lösin açısından zengin tekrar etki 9-11 arasında bir küme meydana geldiği hücre fosforilasyon bir çoğunluğu göstermiştir. LRRK1 hücre fosforilasyon siteleri eşlenmesi için henüz rağmen, COS7 hücrelerinden imüno LRRK1 protein lekelerinin fosfoprotein boyaması kullanılarak çalışmalar göstermiştir LRRK1 protein hücrelerinde fosforile 12 olduğunu göstermektedir.Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK prote etiketlendiins 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi (3xflag), daha sonra, immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerden LRRK proteinleri izole etmek için kullanılır. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir.
Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece rad…
The authors have nothing to disclose.
Biz de bu çalışmayı destekleyen Michael J. Fox Vakfı'na müteşekkiriz. Flanders FWO (FWO proje G.0666.09, JMT kıdemli araştırmacı bursu), IWT SBO/80020 proje Nöro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A ve IOF-KP/07 / 001) – Biz Araştırma Vakfı'na teşekkür verdikleri destek için. Bu araştırma aynı zamanda JMT için King Baudouin Vakfı tarafından yönetilen Fon Druwé-Eerdekens tarafından kısmen desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 |