Summary
La visualización de los datos experimentales se ha convertido en un elemento clave en la presentación de resultados a la comunidad científica. Generación de grabación a intervalos regulares en vivo de embriones en crecimiento contribuye a la mejor presentación y la comprensión de los procesos de desarrollo complejos. Este protocolo es una guía paso a paso para el etiquetado de células a través de la proteína fotoconversión Kaede en el pez cebra.
Abstract
Palatogénesis vertebrado es un proceso de desarrollo altamente coreografía y complejo, que implica la migración de la cresta neural craneal (CNC) las células, la convergencia y la extensión de prominencias faciales, y la maduración del esqueleto craneofacial. Para estudiar la contribución de la cresta neural craneal a regiones específicas del paladar pez cebra un SOX10: Línea de pez cebra transgénico Kaede se generó. Sox10 proporciona restricción linaje de la proteína indicadora Kaede a la cresta neural, con lo que la célula etiquetado de un proceso más preciso que el tinte tradicional o reportero de la inyección de ARNm. Kaede es una proteína de la foto convertible que cambia de verde a rojo después de la activación de la foto y hace posible seguir con precisión las células. Los SOX10: Línea transgénica Kaede se utilizó para realizar el análisis de linaje para delinear las poblaciones de células CNC que dan lugar a maxilar contra elementos mandibulares e ilustran la homología de las prominencias faciales para amniotas. Este protocolo describe el pasos para generar un video time-lapse en vivo de un SOX10: embrión de pez cebra Kaede. Desarrollo de la placa etmoidal servirá como un ejemplo práctico. Este protocolo se puede aplicar a realizar una grabación confocal de lapso de tiempo de cualquier Kaede o proteína reportera fotoconvertible similar en el pez cebra transgénico. Además, puede ser utilizado para capturar no sólo normal, pero también anormal desarrollo de estructuras craneofaciales en los mutantes de pez cebra.
Introduction
Hendiduras orofaciales representan la deformidad craneofacial más frecuente, con 1/700-1, 000 entregas afectadas 1. La interrupción del desarrollo temprano embriológico craneofacial puede conducir a la formación de labio leporino y paladar hendido (CL / P). Si bien las causas de hendidura sindrómica se ha demostrado en gran parte, aún deben ser descubiertos 2-4 las bases genéticas y epigenéticas de las formas no sindrómicas de hendidura orofacial. Con el fin de entender la etiología y la patogénesis de estas malformaciones, es necesario aclarar el desarrollo de estructuras craneofaciales sobre una base celular.
En todas las especies de vertebrados células de la cresta neural craneal (CNCC) migran desde el tubo neural dorsal para rellenar los arcos faríngeos, lo que contribuirá a la formación de las estructuras orofaciales. La interrupción del desarrollo temprano de la cresta neural embrionaria puede conducir a la formación de las malformaciones craneofaciales, incluyendo CL / P 5-7.
En anunciocondición a las similitudes estructurales entre el pez cebra y el desarrollo craneofacial mamíferos (CNCCs residen en regiones homólogas), la red de regulación de genes es altamente conservada. También se ha demostrado que CNCCs desarrollar de la misma manera entre las especies amniote y pez cebra 8, haciendo que el pez cebra un organismo de gran alcance para el estudio de la base del desarrollo y genética de CL / P. Tiene muchas ventajas, incluyendo tamaño pequeño, rápido y ex utero desarrollo embrionario, y las altas tasas de reproducción. Por otra parte, el embrión es ópticamente transparente, por lo que es susceptible a la observación de eventos de desarrollo complejos bajo el microscopio 9. Es un modelo animal ideal para el estudio de la migración y la diferenciación de células de la cresta neural craneal.
Ampliando previamente publicado trabajos 8, 10, 11, el patrón migratorio de CNCC se describió en detalle el uso de los SOX10: Kaede modelo transgénico 5. Kaede es una proteína de la foto convertible que turns de verde a rojo después de la activación de fotos y hace que sea posible rastrear CNCCs precisión. Durante esta transformación la cadena principal del péptido se escinde, lo que sugiere que la conversión es estable, es decir, las células pueden ser rastreados a su destino final 12. Las líneas transgénicas marcados con Kaede bajo el control transcripcional de SOX10 mostraron que el paladar amniota y la placa etmoidal de pez cebra se forman de manera homóloga por la fusión de las prominencias maxilares bilaterales (MXP) con la prominencia frontonasal (FNP) y que la costura de fusión en forma de Y es análoga entre especies.
Entre otras aplicaciones, los SOX10: Kaede modelo de pez cebra transgénico se utilizó para generar videos de embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo para mostrar la formación de estructuras craneofaciales normales y anormales. Fotoconversión de grupos específicos de células hace posible el seguimiento de su desarrollo. Con este método, un enfoque para crear imágenes en vivo del desarrollo de craniofacestructuras ial en el pez cebra se introduce, por lo que es fácil de demostrar visualmente este complejo proceso de desarrollo.
Este protocolo tiene como objetivo compartir la experiencia de la generación de estos vídeos con el desarrollo normal de la placa etmoidal en SOX10: pez cebra transgénico Kaede como ejemplo. Este protocolo adicional se puede aplicar a la realización de vídeos time-lapse de cualquier estructura derivada de células de la cresta neural craneal en el pez cebra.
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Protocol
1. Embrión Collection para Fotoconversión
- Establecer un mínimo de diez pares de SOX10: pez cebra transgénico Kaede entre el 5 y 6 de la tarde.
- A la mañana siguiente, tire divisores y recoger los huevos alrededor del mediodía. Transferirlos a placas de Petri y ponerlas en 28,5 ° C incubadora.
- Alrededor de las 24 h después de la fecundación, limpie las placas de Petri eliminando embriones muertos. Compruebe el estado de desarrollo de los embriones de 13 utilizando microscopía de campo de luz y el microscopio de fluorescencia con mayor proteína verde fluorescente (EGFP) de filtro. Kaede será visible a través de este filtro.
- Cuando los embriones llegan a 60 HPF transferencia de cinco embriones fluorescentes brillantes en una placa de Petri y dechorionate separada si es necesario.
2. El montaje de los embriones para Fotoconversión
- Montar el embrión utilizando un microscopio fluorescente normal. Montaje de los embriones en el microscopio confocal es extremadamente difícil.
- Utilice soporteagua ard E3 o preparar E3 fresca con la siguiente receta:
Agregue la siguiente por un litro de agua destilada dH 2 O añadir lo siguiente para hacer 1x E3L:
0,292 g de NaCl 5,0 mM
0.013 g KCl 0,17 mm
0,044 g de CaCl 2 0,33 mm (desecante, 96%, reactivo ACS)
0,081 g 0,33 mM de MgSO4 (anhidra)
Opcional: añadir 200 l de 0,05% de azul de metileno para 1X E3 como fungicida y revuelva.
Medio mantiene a temperatura ambiente durante 1 semana. - Utilice tricaína estándar o preparar tricaína usando siguiente receta:
Para 5 L de 0,2% tricaína mezclar los siguientes ingredientes:
45 ml de Tris-Cl (1M pH 9,5)
5 LH 2 O
10 g tricaína - Preparar 'jugo de película' (50 ml E3, solución tricaína 0,015%), mediante la adición de 3,75 ml de 0,2% de tricaína a 46,25 ml de E3.
- Preparar agarosa mezclando 46,25 ml de agua E3 con 46,35 mg de bajo punto de fusión (LMP) de agarosa en un matraz de vidrio de 50 ml y disolver las partículas sólidas en el microondas. A continuación, agregue3,73 ml 0,2% tricaína a agarosa y poner matraz de vidrio con agarosa en 50 ° C baño de agua hasta que el uso.
3. Preparación y montaje de Embriones
- Anestesie embriones con solución tricaína E3/0.015% hecho en el paso 1.1.2 y la transferencia de embriones a la diapositiva cámara.
- Disfrute todo el exceso de E3 con un pañuelo de papel y la opción de venta de agarosa en embrión.
- Posición embrión dorsal perfectamente con consejos Microloader. Asegúrese de que todo el embrión no flota en la parte superior de la agarosa, pero empujar todo el cuerpo hacia abajo. A continuación, vierta la solución tricaína E3/0.015% sobre embrión agarosa incrustada hasta la cámara está totalmente llena de líquido.
4. Ajuste de la configuración de software en Microscopio Confocal
- Utilice 20X objetivo aire sumergible (apertura numérica 0.75, el tamaño del agujero de alfiler 20) para enfocar el embrión. A continuación, pulse el botón de luz L100 en el microscopio y seleccionar los canales de software. Controls/A1settings abrir la vista de iconos / adquisición y click el botón de configuración confocal. Siguiente, haga clic en 'auto' y seleccionar los canales siguientes antes de cerrar la ventana de nuevo:
Ch1: DAPI canal 403.4 nm (longitud de onda entre 350-410 nm se pueden utilizar)
Ch2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Fotoconversión
- Apague Ch1 y 3 y encienda Ch2 antes de pulsar el botón de eliminación de bloqueo y escaneo.
- Centrarse en las células de interés para fotoconversión, que es mejor hacerlo partiendo de tensión 1frame/sec y alto (HV) 200 y luego subir en el cuadros / seg y bajar el HV en consecuencia hasta llegar a 1/32 imágenes / seg y HV alrededor 100-120, dependiendo del ruido de fondo.
- Cuando el embrión está en el foco, mira en el borde derecho de la pantalla, tome el borde verde y reducir su tamaño para que quepa en el área de interés para fotoconversión y haga clic derecho con el ratón. Más pequeño es mejor porque el fotoconversión es irreversible.
- Gire cuadros / seg a 1 y HV a 200 y pulseescanear. Una imagen ampliada en el área de fotoconversión es ahora visible.
- Células Photoconvert girando sobre Ch1 (403,4 nm). La exposicion al láser photoconverting cualquier lugar 5-60 segundos, dependiendo del tamaño de la región hasta Kaede verde como se ve a través del canal de GFP está casi ausente.
- Cuando la señal de Kaede verde es casi ausente, gire Ch1 apagado. Gire Ch2 y 3 en. Luego, haga clic a la derecha en la ventana en A1 campo de área de exploración y pulsa 'retorno a tamaño original' para comprobar si se photoconverted células deseadas.
6. Haciendo una pila Z
- Busque el icono "captura de la serie Z 'en la barra de menú y ajuste los límites superior e inferior de la Z-stack antes de iniciarlo. Establecer LUT.
7. Software-Configuración de Time-lapse
- Ir a la caja A1Simple GUI y marque siguientes ajustes:
1/32 cuadros / seg
tamaño de 1024
promedio de 4 u 8 veces, dependiendo del número de Z-pilas que tiene que ser tomada en un bucle - Ir a:controles de la vista / adquisición / ND adquisición secuencia y marco de tiempo establecido (8-30min), haga clic en continuo y haga clic en Z-stack. Establecer fronteras como probado antes y comenzar la película.
- Mantenga la adición E3/0.015% solución tricaína diapositiva cámara durante todo el día. Por la noche, se llenan la cámara completamente. Que durará hasta la mañana siguiente.
- A la mañana siguiente, vuelva a llenar solución tricaína E3/0.015% y comprobar si el embrión está todavía vivo. La pérdida de fluorescencia indica la muerte. Continuar recambios y controles durante el día.
- Cuando la estructura se ha terminado la formación o el embrión ha muerto, terminar la película.
8. Procesamiento post-producción
- Haga clic en "mostrar proyección máxima intensidad" en la barra de herramientas, a continuación, haga clic derecho sobre la imagen y crear nuevo documento. El vídeo se puede ver en la mejor calidad posible. Vamos a eliminar los marcos que no son necesarios y ajustar LUT. Finalmente guardar como. Avi. Este formato estará bien para Windows. Para Mac software de descarga to convertir. mov o. wmv.
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Representative Results
En el SOX10: CNCCs línea transgénica Kaede, migratorias y post migratorios están etiquetados con fluorescencia verde. Las células CNCC marcados con Kaede verde fluorescente recapitular endógena mRNA SOX10 expresión 5.
Entre otras aplicaciones, se utilizó este modelo animal para visualizar mejor el desarrollo de las estructuras craneofaciales dependientes CNCC. El desarrollo normal de las estructuras específicas y también el desarrollo patológico de las malformaciones craneofaciales, labio leporino y paladar hendido en especial han sido capturados. Se ha generado una serie de vídeos time-lapse en directo de pez cebra en diferentes momentos del desarrollo.
A modo de ejemplo, los embriones a los 60 HPF, se seleccionaron una etapa en la que las trabéculas emparejados se han reunido para formar la placa etmoidal,. Se realizó la fotoconversión dirigida unilateral resultante en el etiquetado rojo de la porción más anterior de las células en la placa de etmoides. Primero, la extensión normal y la formación de the placa etmoidal se observó en el tipo salvaje Tubinga pez cebra (ver Figura 1 y Vídeo 1). Con una comprensión del desarrollo normal de la placa etmoidal, se aplica entonces esta referencia de tipo salvaje para comparar la migración de CNCCs en embriones de los que la expresión del gen normal se ha perturbado.
A morfolino specc1lb desmontables embrión de pez cebra fue elegido como un ejemplo representativo. SPECC1L es el primer gen implicado en el desarrollo de la hendidura facial oblicua rara pero grave. Caída basada en Morpholino de SPECC1L specc1lb homólogo en los resultados de pez cebra en la hendidura facial bilateral en la placa etmoidal. Se seleccionaron embriones en 60 hpf embriones que habían sido inyectados con specc1lb antisentido morfolino y la porción más anterior de células de la placa etmoidales se photoconverted unilateralmente. En contraste con el desarrollo normal de la placa etmoidal, el fracaso de la fusión entre células de la placa etmoidales medianay células de la placa etmoidales laterales podrían ser observados. Esto se asemeja a la patogénesis del desarrollo ObFC en los seres humanos, donde el fracaso de la fusión entre el proceso nasal lateral y prominencia maxilar ocurre (ver video 2).
Figura 1. SOX10:. fotoconversión Kaede vista A. ventral de 60 HPF SOX10: pez cebra transgénico Kaede. La estructura de la etiqueta verde en el diagrama y la imagen real en vivo correspondiente se asemeja a la placa etmoidal. Después de la exposición a la luz UV (a 403,4 nm) bajo el microscopio confocal, el Kaede proteína fluorescente se photoconverted de verde a rojo. B. El photoconverted células se pueden seguir, como se muestra en el Panel B.
Película 1. Time lapse vídeo 60 etapa HPF wildtype Tubinga embrión de pez cebra.La formación normal de la placa etmoidal. Vista ventral. Registraron cada 30 minutos a partir 60 a 72 HPF. Haga clic aquí para ver la película .
Película 2. Embrión video Time lapse 60 HPF etapa specc1lb morpholino inyectado. Fracaso de la fusión entre la mediana células de la placa etmoidal y células de la placa etmoidal laterales se pueden observar. Vista ventral. Registraron cada 30 minutos a partir 60 a 72 HPF. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
Aquí se muestra un nuevo método para la visualización del desarrollo craneofacial en el modelo de pez cebra. Los SOX10: Kaede línea de pez cebra transgénico se ha utilizado con éxito para describir el patrón migratorio de CNCC en detalle se utiliza como un organismo modelo 5.
Estudios previos han utilizado puntos de referencia brutos como el ojo a las células diana y se han basado en la inyección de ARNm Kaede, ensayos fotoconversión o dextrano fluoresceína enjaulado para fotoconversión 10, 11, 14, 15 El sox:. 10 Kaede línea transgénica tiene muchas ventajas en comparación con éstos métodos. Con las células de la cresta neural ya etiquetados con Kaede y conforme a una distribución muy particular, se pueden utilizar puntos de referencia más precisos para establecer regiones para el mapeo de destino. Además, la proteína que tiene Kaede expresa de forma endógena bajo el control del promotor SOX10 asegura que sólo las células de la cresta neural se photoconverted y que sólo derivados serán etiquetados en una etapa posterior, dearrugar el potencial de fondo 5.
Con esta técnica, la formación de cualquier célula de la cresta neural derivada estructura craneofacial en el pez cebra puede demostrar con éxito. El desarrollo de embriones de pez cebra de tipo salvaje normales puede ser seguido y esta referencia de tipo salvaje puede ser comparado con los embriones donde la expresión del gen normal se ha perturbado.
Modificaciones potenciales incluyen el uso de un contenedor diferente para fijar el embrión durante la visualización. Esto puede ser una placa de Petri, o cualquier otra bandeja translúcida.
Si la imagen no es correcta, esto es probablemente debido a errores en la configuración del software. Lea el manual del usuario del microscopio y mantenimiento antes de lapso de tiempo en directo.
Mientras formación de imágenes, es crítico para centrarse en el plano derecho del embrión y para establecer los bordes de Z-pila precisamente. Además, los parámetros de calidad de imagen, tales como cuadros / seg, promedio y LUTs se tienen que establecer en la mejor way posible con el fin de obtener resultados de alta calidad.
Una posible limitación de esta técnica es, que se trata de un reto técnico para las células de la etiqueta sobre una base de una sola célula, como el tejido circundante también se expone a la luz UV. Además, si la proliferación celular es rápida, el etiquetado rojo se pierde a través de la dilución después de la división celular.
Además, Kaede es tetramérica y tiene una tendencia a formar agregados cuando se fusionan con otras proteínas. Esto limita su uso en la mayoría de las aplicaciones de fusión de imágenes de células vivas.
Imágenes en vivo de lapso de tiempo es una herramienta importante para que los datos experimentales de desarrollo complejos sean más accesibles a la comunidad científica y el público en general.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Robert Kelsh por compartir amablemente el reactivo de pez cebra promotor SOX10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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