Summary
Visualisering av eksperimentelle data har blitt et sentralt element i å presentere resultatene til det vitenskapelige samfunn. Generering av levende intervallopptak av voksende embryo bidrar til bedre presentasjon og forståelse av komplekse utviklingsprosesser. Denne protokollen er en steg-for-steg guide til celle merking via photoconversion av kaede protein i sebrafisk.
Abstract
Virveldyr palatogenesis er en svært koreograferte og komplekse utviklingsprosess, som innebærer flytting av kranie neural crest (CNC) celler, konvergens og utvidelse av ansikts prominenser, og modning av kraniofaciale skjelettet. Å studere bidraget fra kranie neural crest til spesifikke regioner av sebrafisk ganen en sox10: kaede transgen sebrafisk linjen ble generert. Sox10 gir lineage begrensning av kaede rapportørprotein til neural crest, og dermed gjøre cellen merking en mer nøyaktig måte enn ved tradisjonell fargestoff eller reporter mRNA injeksjon. Kaede er en foto-konvertible protein som svinger fra grønt til rødt etter bilde aktivering og gjør det mulig å følge celler presist. De sox10: kaede transgene linjer ble brukt til å utføre avstamning analyse for å avgrense CNC celle populasjoner som gir opphav til overkjevens versus underkjevens elementer og illustrerer homologi av ansikts prominenser til amniotes. Denne protokollen beskriver trinns for å generere en live time-lapse video av en sox10: kaede sebrafisk embryo. Utvikling av ethmoid plate vil fungere som et praktisk eksempel. Denne protokollen kan brukes til å lage en time-lapse confocal opptak av noen kaede eller lignende photoconvertible reporter protein i transgen sebrafisk. Videre kan den brukes til å fange opp ikke bare normalt, men også unormal utvikling av craniofacial strukturer i sebrafisk mutanter.
Introduction
Orofacial kløfter representerer den mest utbredte kraniofaciale misdannelse, med 1/700-1, 000 leveranser påvirket en. Forstyrrelse av tidlig embryologisk kraniofaciale utvikling kan føre til dannelse av leppe-og ganespalte (CL / P). Mens årsaker til syndrom kløft har vært i stor grad vist, genetiske og epigenetiske baser av nonsyndromic former for orofacial clefting fortsatt trenger å bli avdekket 2-4. For å forstå den etiologi og patogenese av disse deformasjoner, er det nødvendig å klargjøre utvikling av craniofacial strukturer på cellebasis.
I alle virveldyr arter hjerne neural crest cellene (CNCC) migrere fra dorsal nevralrøret å fylle svelg buer, som vil bidra til dannelsen av orofacial strukturer. Forstyrrelse av tidlig embryologisk neural crest utvikling kan føre til dannelse av kraniofaciale misdannelser inkludert CL / P 5-7.
I annonsendition til strukturelle likheter mellom sebrafisk og pattedyr kraniofaciale utvikling (CNCCs bor i homologe regioner), er genet regulatoriske nettverk svært konservert. Det har også blitt vist at CNCCs utvikles på samme måte mellom amniote arter og sebrafisk 8, noe som gjør en kraftig sebrafisk organisme for studiet av utviklings-og genetiske basis av CL / P. Det har mange fordeler, blant annet liten størrelse, rask og ex-utero embryoutvikling, og høye reproduksjons. Videre er embryo optisk transparent, slik at det er mottagelig for observasjon av komplekse utviklingshendelser i mikroskop 9.. Det er en ideell dyremodell for studiet av migrasjon og differensiering av kranie neural crest cellene.
Utvider på tidligere publiserte arbeider 8, 10, 11, den vandrende mønster av CNCC ble beskrevet i detalj ved hjelp av sox10: kaede transgen modell 5. Kaede er en foto-konvertible protein som tuRNS fra grønt til rødt etter fotoaktivering og gjør det mulig å spore CNCCs presist. I løpet av denne transformasjonen peptid ryggrad spaltes, noe som tyder på at konverteringen er stabil, noe som betyr at cellene kan spores til sin endelige destinasjon 12. Transgene linjer merket med kaede henhold transcriptional kontroll av sox10 viste at amniote gane og ethmoid plate av sebrafisk er dannet homologously ved fusjon av bilaterale overkjevens prominenser (MXP) med frontonasal prominens (FNP) og at Y-formet fusjon søm er analogt mellom arter.
Blant andre programmer, de sox10: ble kaede transgen sebrafisk modell brukes til å generere videoer av sebrafisk embryo på ulike utviklingsstadier vise dannelsen av normale og unormale kraniofaciale strukturer. Photoconversion av spesifikke grupper av celler gjør det mulig å følge utviklingen av disse. Med denne metoden en tilnærming for å skape levende avbildning av å utvikle craniofacial strukturer i sebrafisk er innført, noe som gjør det enkelt å visuelt demonstrere dette komplekset utviklingsprosess.
Denne protokollen er rettet mot å dele opplevelsen av å generere disse videoene ved hjelp av den normale utviklingen av ethmoid plate i sox10: kaede transgen sebrafisk som et eksempel. Denne protokollen kan videre brukes til å lage time-lapse videoer av noen struktur avledet fra kranie neural crest cellene i sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Embryo Collection for Photoconversion
- Sett opp minst ti par sox10: kaede transgen sebrafisk mellom 5 og 18:00 i kveld.
- Den neste morgen, trekke skillevegger og samle egg utpå formiddagen. Overfør dem til petriskåler og sette dem inn 28.5 ° C inkubator.
- På rundt 24 timer etter befruktning, rengjøre petriskåler ved å fjerne døde embryoer. Sjekk utviklingsstadiet av embryoer 13 ved hjelp av lys felt mikroskopi og fluorescerende mikroskop med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) filter. Kaede vil være synlig gjennom dette filteret.
- Når embryo nå 60 HPF overføring fem brightly fluorescerende embryoer i en egen petriskål og dechorionate dem om nødvendig.
2. Montering av Embryo for Photoconversion
- Monter embryo med en vanlig fluorescerende mikroskop. Montering av embryoer på konfokalmikroskop er ekstremt utfordrende.
- Bruk stativard E3 vann eller forberede fersk E3 bruke følgende oppskrift:
Legg til følgende per én liter destillert vann dH 2 O legge følgende for å være 1x E3L:
0.292 g 5,0 mM NaCl
0.013 g 0.17mM KCl
0,044 g 0.33mM CaCl 2 (tørkemiddel, 96%, ACS reagens)
0.081 g .33 mM MgSo4 (anhydrert)
Valgfritt: legge 200 mL av 0,05% metylenblått til 1X E3 som en soppdreper og røre.
Medium beholder ved romtemperatur i en uke. - Bruk standard Tricaine eller forberede Tricaine bruker følgende oppskrift:
For 5 L av 0,2% Tricaine blande de følgende bestanddeler:
45 ml tris-Cl (1M pH9.5)
5 LH 2 O
10 g Tricaine - Forbered 'film juice' (50 ml E3, 0,015% Tricaine løsning), ved å legge til 3,75 ml 0,2% Tricaine til 46,25 ml E3.
- Forbered agarose ved å blande 46,25 ml E3 vann med 46,35 mg lavt smeltepunkt (LMP) agarose i en 50 ml glasskolbe, og oppløse faste partikler ved mikrobølgeovnen. Deretter legger3,73 ml 0,2% Tricaine til agarose og sette glasskolbe med agarose i 50 ° C vannbad inntil bruk.
Tre. Utarbeidelse og montering av Embryo
- Anesthetize embryoer med E3/0.015% Tricaine løsning laget i trinn 1.1.2 og overføring embryo til kammer lysbilde.
- Suge opp all overflødig E3 med papir vev og put agarose på embryo.
- Posisjon embryo perfekt dorsal med microloader tips. Kontroller at hele embryoet ikke flyter ikke på toppen av agarose, men presse hele legemet nedover. Hell så E3/0.015% Tricaine løsning over agarose innebygd embryo til kammeret er fullt fylt med væske.
4. Justere programvareinnstilling på konfokalmikroskop
- Bruk 20X luft immersible objektiv (numerisk apertur 0,75; pinhole størrelse 20) for å fokusere embryoet. Trykk deretter på L100 lys knappen på mikroskopet og velge kanaler i programvaren. Åpne ikonene vise / oppkjøps controls/A1settings og click confocal setup-knappen. Neste klikk "auto" og velg følgende kanaler før du lukker vinduet igjen:
CH1: DAPI kanal-403,4 nm (bølgelengder mellom 350-410 nm kan brukes)
Ch2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Photoconversion
- Slå av kanal 1 og 3 og slå på Ch2 før du klikker på Fjern sperreknappen og skanning.
- Fokus på celler av interesse for photoconversion, noe som gjøres best ved å starte med 1frame/sec og høyspent (HV) 200, og deretter gå opp i bilder / sek og senke HV tilsvarende inntil nå 1/32 bilder / sek og HV rundt 100 til 120, avhengig av bakgrunnsstøy.
- Når fosteret er i fokus, se på høyre kant av skjermen, ta tak i grønn rim og gjøre det mindre slik at den passer område av interesse for photoconversion og høyreklikk med musen. Mindre er bedre fordi photoconversion er irreversible.
- Slå bilder / sek til 1 og HV til 200 og traffskanne. En zoomet inn bilde av området photoconversion er nå synlig.
- Photoconvert celler ved å skru på kanal 1 (403,4 nm). Utsett til photoconverting laser hvor som helst 5-60 sekunder, avhengig av størrelsen på regionen til grønn kaede sett gjennom GFP kanalen er nesten fraværende.
- Når den grønne kaede signalet er nesten fraværende, slår Ch1 av. Slå Ch2 og tre på. Klikk deretter til høyre inn vinduet på A1 skanneområde feltet og trykker "tilbake til opprinnelig størrelse for å sjekke om ønskede celler ble photoconverted.
6. Å gjøre en Z-stack
- Finn ikonet 'capture Z-serien' i menylinjen og sette øvre og nedre grense for Z-stack før du starter den. Sett LUTs.
7. Programvareinnstillinger Time-lapse
- Gå til A1Simple GUI boksen og kryss følgende innstillinger:
1/32 bilder / sek
størrelse 1024
gjennomsnittlig 4 eller 8X, avhengig av antall Z-stabler som må tas i en sløyfe - Gå til:view / oppkjøps kontroller / ND sekvens oppkjøp og satt tidsramme (8-30min), klikk kontinuerlig og klikk Z-stack. Sett grenser som testet før og starte filmen.
- Hold legge E3/0.015% Tricaine løsning kammer lysbilde hele dagen. Om natten, fylle opp kammeret helt. Det vil vare frem til neste morgen.
- Den neste morgen, fylle E3/0.015% Tricaine løsning og se om fosteret er fortsatt i live. Tap av fluorescens indikerer død. Fortsett påfyll og sjekker hele dagen.
- Når strukturen er ferdig forming, eller fosteret har dødd, ferdig filmen.
8. Post-produksjon Processing
- Klikk "vis maksimal intensitet projeksjon 'på verktøylinjen, deretter høyreklikke på bildet og lage nytt dokument. Videoen er nå synlig i best mulig kvalitet. Gå på å slette rammer som ikke er nødvendig og justere LUTs. Deretter lagres som. Avi. Dette formatet vil være fint for Windows. For Mac laste ned programvare to konvertere til. mov eller. wmv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I sox10: kaede transgen linje, trekkende og etter trekkende CNCCs er merket fluorescerende grønne. CNCC celler merket med grønt fluorescerende kaede rekapitulere endogen sox10 mRNA uttrykk fem.
Blant andre programmer, ble denne dyremodell som brukes for å bedre visualisere utviklingen av CNCC avhengige kraniofaciale strukturer. Normal utvikling av konkrete strukturer og også patologisk utvikling av kraniofaciale misdannelser, spesielt leppe og gane har blitt fanget. En rekke live-time-lapse videoer av sebrafisk på ulike utviklings tidspunkt har blitt generert.
Som et eksempel, embryoer ved 60 HPF, et punkt hvor de sammenkoblede trabeculae er oppfylt for å danne den ethmoid plate, ble valgt ut. Unilateral målrettet photoconversion resulterer i rødt merking av de fremre del av cellene i det ethmoid plate ble utført. For det første den normale utvidelse og dannelse av the ethmoid plate ble observert i vill type Tübingen sebrafisk (se figur 1 og Video 1). Med en forståelse av normal utvikling av ethmoid plate, ble denne villtype referansen deretter brukt til å sammenligne migrasjon av CNCCs i embryoer hvor normal genuttrykk har blitt perturbed.
En specc1lb morpholino knockdown sebrafisk embryo ble valgt som et representativt eksempel. SPECC1L er den første genet innblandet i utviklingen av den sjeldne, men alvorlige skrå ansikts kløft. Morpholino-baserte knockdown av SPECC1L homolog specc1lb i sebrafisk resultater i bilaterale ansikts clefting i ethmoid plate. Embryoer ved 60 HPF embryoer som hadde blitt injisert med specc1lb anti morfolinogruppe ble valgt og den mest fremre delen av ethmoid plateceller ble photoconverted ensidig. I motsetning til normal utvikling av ethmoid plate, svikt i fusjon mellom median ethmoid platecellerog lateral ethmoid plateceller kunne observeres. Dette ligner patogenesen av ObFC utvikling hos mennesker, hvor svikt i fusjon mellom den laterale nasal prosessen og maxillary prominence oppstår (se video 2).
Figur 1. sox10:. kaede photoconversion A. Ventralt visning av 60 HPF sox10: kaede transgen sebrafisk. Strukturen merket grønt i diagrammet, og den tilsvarende virkelige levende bildet ligner på ethmoid plate. Etter eksponering for UV-lys (ved 403,4 nm) under confocal mikroskop, blir det fluorescerende protein kaede photoconverted fra grønt til rødt. B. photoconverted celler kan bli fulgt, som vist i panel B.
Movie en. Time lapse video 60 HPF scenen villtype Tübingen sebrafisk embryo.Normal dannelse av ethmoid plate. Ventral view. Registrert hvert 30 min starter 60-72 HPF. Klikk her for å se filmen .
Movie 2. Time lapse video 60 HPF scenen specc1lb morpholino injisert embryo. Unnlatelse av fusjon mellom median ethmoid plateceller og laterale ethmoid plate celler kan observeres. Ventral view. Registrert hvert 30 min starter 60-72 HPF. Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her en ny metode for visualisering av kraniofaciale utvikling i sebrafisk-modellen vises. De sox10: kaede transgen sebrafisk linje har blitt brukt for å beskrive den vandrende mønster av CNCC i detalj er brukt som modellorganisme fem.
Tidligere studier har brukt brutto landemerker som øyet å målrette celler og har stolt på kaede mRNA injeksjon, photoconversion analyser eller bur fluorescein dekstran for photoconversion 10, 11, 14, 15 Sox:. 10 kaede transgen linje har mange fordeler i forhold til disse metoder. Med neural crest cellene allerede merket med kaede og i samsvar med et meget bestemt fordeling, kan mer presise landemerker for å etablere regioner for skjebnen kartlegging brukes. I tillegg har kaede protein uttrykkes endogent under kontroll av promoteren sox10 sikrer at bare neural crest-celler photoconverted og at bare derivater vil bli merket på et senere stadium, DEbretter potensialet bakgrunn fem.
Med denne teknikken, kan dannelsen av noen neural crest celle derivert craniofacial struktur i sebrafisk bli vist hell. Utviklingen av normale sebrafisk villtype embryoer kan følges, og dette villtype referanse kan sammenlignes med embryoer hvor normal genekspresjon er perturbed.
Potensielle modifikasjoner inkluderer bruk av en annen beholder for å fikse embryo under visualisering. Dette kan være en petriskål, eller hvilken som helst annen gjennomskinnelig skuffen.
Hvis bildebehandling er ikke vellykket, er dette trolig på grunn av feil i programvare innstillinger. Les brukermanualen av mikroskopet nøye før du starter live tid forfalle.
Mens avbildning, er det avgjørende å fokusere på høyre planet av embryo og å sette Z-stack grenser nøyaktig. Videre bildekvalitetsparametre som bilder / sek, gjennomsnitt og LUTs må settes i best way er mulig for å oppnå høy kvalitet.
En potensiell begrensning med denne teknikken er at det er teknisk utfordrende å merke celler i en enkelt celle basis, som omkringliggende vev er også eksponert for UV lys. Videre, hvis celleproliferasjon er hurtig, er den røde merking tapt gjennom fortynning etter celledeling.
I tillegg er kaede tetramer, og har en tendens til å danne aggregater når smeltet til andre proteiner. Dette begrenser bruken i de fleste fusion applikasjoner i levende celle bildebehandling.
Live-time-lapse bildebehandling er et viktig verktøy for å lage komplekse utviklings eksperimentelle data mer tilgjengelig for det vitenskapelige miljøet og et bredere publikum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Robert Kelsh for vennlig deling sebrafisk sox10 promoter reagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
