Summary
이분자 형광 보완의 유세포 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법을 제공합니다. 이 방법은 매핑 단백질 결합 부위와 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 선별 적용 할 수 있습니다.
Abstract
세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 방법 중, 이분자 형광 보완 (BiFC)은 비교적 간단하고 민감합니다. BiFC는 형광 단백질의 두 가지 비 형광 조각을 (금성, 노란색 형광 단백질의 변형은, 여기에 사용되는)를 사용하여 형광의 생산을 기반으로합니다. 비 형광 비너스 조각은 (VN 및 VC) 때문에 VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 상호 작용과 기능 형광 단백질의 형성에 형광 항복, 두 개의 상호 작용하는 단백질 (이 경우, AKAP-LBC 및 PDE4D3)에 융합 세포 내부.
BiFC 단백질 복합체의 세포 내 형광 강도에 따라 단백질 상호 작용의 강도에 대한 정보를 제공합니다. 그러나 단백질 - 단백질 상호 작용의 강도를 정량화하기 위해 현미경을 사용하여 BiFC 분석은 시간과 단백질 발현 및 상호 작용의 이질성으로 인해 다소 주관적이다. 유세포 흐름을 결합하여BiFC 방법론과 분석은 형광 BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용 신호는 정확하게 짧은 시간에 세포의 대량을 위해 측정 할 수 있습니다. 여기, 우리는 AKAP-LBC와의 상호 작용에 필요한 PDE4D3의 영역을 매핑하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이러한 높은 처리량 방법은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절 심사 요소에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
650,000 단백질 - 단백질 상호 작용은 정상 세포의 기능 1,2을 유지하는 중요한 역할을 놀고, 인간 interactome에 존재하는 것으로 추정된다. 공동 immunoprecipitation의 외에 (CO-IP), 금 표준 (PCA) 세포 안쪽으로 단백질 - 단백질 상호 작용 검출의 감도를 개선하기 위해 개발되었습니다, 세포 파쇄물에서 여러 단백질 조각 보완 분석 실험 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구한다. 기술은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET), 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 및 이분자 형광 보완 (BiFC) 4,5 (가) 있습니다. 각각의 잠재적 인 상호 작용 단백질 파트너 (이 예에서 우리는 AKAP-LBC 및 PDE4D3 사용)에 융합되어, BiFC는 형광 단백질의 두 조각 (YFP 변형 여기에서 우리는 비너스를 사용한다)의 촉진 협회를 기반으로합니다. F로 시각화 할 수 있습니다 기능 형광 세포 결과 안에 관심의 두 단백질의 상호 작용라이브 또는 고정 세포 6,7,8 중 하나를 사용하여 luorescence 현미경. 다른 PCA는 비교 BiFC는 살아있는 세포에서 세포 지방화를 공부하는 잠재력에 민감하고 덜 기술적 도전이다. 이 기술의 주요 단점은 있지만 한 번 형성된 형광 단백질 복합체가 반전 될 수 있다는 것입니다. 따라서 동적 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 좋은 방법은 아닙니다. 본 논문에서, 우리는 금성의 형광 강도를 모니터링하여 AKAP-LBC와 PDE4D3의 상호 작용 사이트를 매핑하는 BiFC 사용합니다. (자동 높은 처리량 기계를 사용하여 수행되지 않은 경우) 시간과 노동 집약적 형광 현미경을 사용하여 기존 분석에 비해 유동 세포 계측법은 짧은 시간 9을 통해 이기종 인구 세포의 수천의 간단한 정량 분석을 제공합니다 10. 여기 유세포-BiFC 분석 및 공동 IP 전통의 나란히 비교를 실시함으로써, 우리는 보여 그 이methods는 비교 데이터를 제공하지만, 유세포 BiFC 분석은 시간을 덜 소모하고 그 세포가 제한 될 때 더 유용 할 수 있습니다 적은 재료를 사용하고 있습니다.
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Protocol
1. 세포 형질
- 형질 전에 플레이트 세포는 하루 면역에 대한 적은 세포를 도금.
- 면역 경우 : 6 잘 플레이트, 코팅 유리 커버 전표에서 (1도 기준) 적어도 4 시간 동안 37 ° C에서 0.02 % 젤라틴으로, 중간에 한 번 씻고, 각 웰에 대한 접시, 1 × 10 5 HEK 293T 2 ㎖ 완전한 성장 배지에서 세포 [Dulbecco의 수정 이글의 미디어 (DMEM)에 10 % FBS].
- 유세포 및 서양 얼룩 분석을위한 : 판 1.2 5 HEK 293T 세포 / 잘 6 잘 플레이트 (24 - 웰 플레이트에 잘 당 0.5 ML 전체 성장 매체에서 0.3 X 10 5 HEK 293T 세포에 2 ㎖ 전체 성장 매체에서 x 10 ).
- 제조의 프로토콜에 따라 형질에 대한 DNA를 준비 Effectene는 (Qiagen의) 면역에 사용됩니다. 대중 교통 LT1 (마이 러스)는 유세포과 서양 얼룩 분석에 사용됩니다. 사용되는 DNA의 양이 아래에 나열되어 있습니다.
형질 Effectene (6 자)를 사용하여 :24 - 웰 플레이트 (NG) 6 잘 플레이트 (NG) CFP - 벡터 10 50 VN N-AKAP-LBC 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (전체 길이 PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-UCR1 (UCR1 도메인을 포함하는 PDE4D3 N-말단 단편) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (UCR2 및 촉매 도메인을 포함하는 PDE4D3 C-말단 단편) 100 - 상온에서 5 분 동안 표시된 플라스미드 DNA의 양을 + 4 μL 향상제 100 μL 버퍼 EC로, 혼합 및 부화를 추가합니다.
- 10 분 동안 5 μL Effectene, 혼합과 부화를 추가실내 온도. 추가 셀에 드롭 현명.
- 멸균 튜브 옵티-MEM I 혈청이없는 배지 250 μl/50 μL에 플라스미드 DNA의 지정된 금액을 추가합니다.
- 희석 된 DNA 혼합물에 대중 교통 LT1 시약을 추가하고 섞어 부드럽게 피펫. (대중 교통 LT1 시약 : DNA 비율은 DNA 1 μg 당 대중 교통 LT1 시약 3 μL)입니다.
- 실온에서 30 분 동안 배양 및 세포 드롭 현명한 추가 할 수 있습니다.
2. 유동 세포 계측법, 서쪽 오점, 그리고 면역 형광에 대한 세포의 준비
- 24 시간 게시물 형질 세포를 수확하기 전에 epifluorescence에 현미경으로 형광을 확인합니다.
- 유세포 분석을위한 세포의 준비 :
- 24-well/6-well 플레이트 0.5 ML / 2 ML 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 50 μl/250 μL 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다.
- 200 μL / 1 ML DMEM 매체와 트립신을 중화.
- 공동5 분 500 XG에서 원심 분리하여 llect 250 μl의 세포 (모두 24 잘 6 잘 플레이트), 웨스턴 블롯 분석을위한 나머지 셀 (1 ML)을 사용합니다.
- 250 μL FACS 버퍼에 세포를 resuspend을 [PBS + 0.5 % (W / V) BSA + 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] 유세포 분석을위한 얼음, 저장. 유동 세포 계측법 분석을 즉시하지 않을 경우 전지도 (PBS)에 1 % 파라 포름 알데히드에 고정 할 수 있습니다.
- 서양 얼룩 분석을위한 세포의 준비 : 유동 세포 계측법 분석을위한 세포의 준비와 병행 실시했다.
- 2 ML 얼음처럼 차가운 PBS와 1X 세포를 씻으, 세포 용해 버퍼 100 μL [10 MM 나트륨 인산염 완충액, pH가 6.95, 150 mM의 NaCl을 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 mM의 EGTA, 1 % 트리톤 X-100]을 추가하여 세포를 용해 .
- 4에서 21,000 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파쇄물을 수집 ° C.
- , 브래드 포드 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 정량화 SDS-PAGE 레인 당 단백질의 동등한 양을로드하고 immunoblotting을위한 니트로 셀룰로오스로 전송할 수 있습니다.
- 면역에 대한 세포의 준비.
- 2 ML PBS로 3 배 세포를 씻어 상온에서 10 분 동안 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PBS)에 1 ㎖의 세포를 수정 후, 5 분 동안 2 ML PBS로 3 배 씻는다.
- 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 슬립 커버 장착합니다. 필요한 경우 매니큐어를 사용하여 coverslip에 가장자리를 밀봉.
- 시험에 ° C 이전 4시에 슬라이드를 저장합니다.
3. 유동 세포 계측법 및 면역 형광 현미경
- 유동 세포 계측법은 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 시안 488 nm의 장착 ADP, 405 nm의 및 642 nm의 고체 레이저를 사용하여 수행됩니다. 정상 회담 소프트웨어는 수집 및 분석에 사용됩니다.
- 표준 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에를 보정합니다.
- 게이트 라이브 셀 인구 리니어 스케일에 플롯 앞으로 분산 형 (FSC) / 옆으로 분산 (SSC).
- 게이트 집계되지 않은 살아있는 세포 인구 플롯 전압 / FSC 펄스 폭.
- 플롯 count/FL6 (CFP fluorescenc게이팅 비 집계 라이브 CFP-양성 세포에 대한 로그 스케일 E, 405 NM).
- BiFC 강도에 대한 로그 스케일로 플롯 count/FL1 (YFP 형광, 488 nm의).
- FSC, SSC, FL1과 FL6 사진 배율 튜브 (PMT) 각 신호에 대한 임계 값을 설정하는 전압을 조정, YFP - CFP 더블 부정적인 샘플을 실행합니다.
- 실행 (두 YFP +와 CFP +)에 대한 샘플 향후 오프라인 보상을 양성 하나
- 분석을위한 최소 10,000 게이트 이벤트 (비 집계 라이브 CFP + 세포) 취득.
- . 면역 형광 현미경 자이스 혈구 LSM 510 공 촛점 현미경 참고를 사용하여 수행됩니다 : 그것은 모든 설정을 사이에 일관성 (예 : 줌, 핀홀, 검출기 이득 증폭기 오프셋, 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 평균 및 레이저 파워)를 유지하는 것이 중요합니다 모든 데이터의 적절한 비교를위한 샘플입니다.
4. 데이터 분석 (정상 소프트웨어를 사용하여 수행)
- acquisit에 대한 것과 비슷한 분석 프로토콜을 설정적절한 게이팅 이온 :
살아있는 세포에 대한 FSC / SSC 도트 플롯 문 1.
집계되지 않은 살아있는 세포에 대한 게이트 1 FSC / 펄스 폭 문 2.
비 집계 CFP + 라이브 세포 게이트 3 수 / CFP의 문 3. - YFP와 YFP +와 CFP + 싱글 양성 세포를 사용하여 CFP 신호를 보상한다.
- CFP / YFP 양성 세포를 다시 확인 커트 오프 라인.
- 수출 YFP는 CFP의 형광 강도 (MFI) + 데이터 플롯 Excel로 세포를 의미한다.
- AKAP-LBC, PDE4D3의 발현에 YFP MFI을 정상화하고, 서양 얼룩에 의해 결정, α-tubulin에 컨트롤을로드.
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Representative Results
AKAP-LBC 및 PDE4D3 구조 (그림 1B)는 각각 VN 및 VC 조각에 융합되었다. AKAP-LBC 및 기능 YFP 형광 (그림 1A)의 PDE4D3 결과의 상호 작용. 여기에서 우리는 PDE4D3의지도 AKAP-LBC-결합 부위에 BiFC 메서드를 사용합니다. 상류 보전 지역 1 (UCR1), 상류 보전 지역이 (UCR2)와 촉매 영역 (CAT) PDE4D3의 바인딩 사이트를 선별 사용 하였다 따라서 전체 길이 (FL), UCR1 및 UCR2 플러스 CAT, PDE4 가족 단백질 사이에 보존됩니다 AKAP-LBC합니다. 다른 강도 (그림 1C)와 함께 VN-AKAP-LBC 및 형광 HEK 293T 세포 결과에 VC-PDE4D3 - 단편 식입니다. BiFC는 UCR1과 UCR2 모두 + CAT AKAP-LBC와 PDE4D3의 상호 작용에 기여하는 것을 나타냅니다. AKAP-LBC-UCR1 상호 작용으로 인한 큰 형광 강도는 AKAP-LBC-UCR2 + CAT에 비해, PDE-UCR1는 PDE-UCR2 + CAT보다 AKAP-LBC에 바인딩을 나타냅니다.
(그림 2A) 및 세포 집합체 SSC 대 펄스 폭 두 점 (그림 2B)를 사용하여 제외되었다를 사용하여 분석에서 제외 하였다. 혼자 BiFC 신호 또는 CFP 식 세포는 U 있었다SED는 보상을 결정하고 형광 (그림 2C-2F)없이 셀의 컷 - 오프한다. CFP 벡터 BiFC 구조와 CFP 식을 성공적으로 형질을 나타내는 긍정적 인 마커로 사용되었다와 공동 형질 전환 하였다. 만 CFP + 세포 BiFC 형광의 측정에 사용 하였다. CFP 신호 (그림 3B) 그대로 남아있는 동안 PDE4D3의 양을 증가 형질이 증가 금성 (YFP) BiFC 신호 (그림 3A)의 결과. VN-AKAP-LBC 및 VC-PDE4D3의 양을 증가의 표현은 서양 얼룩 (그림 3C)에 의해 확인되었다. 전반적으로 증가 PDE 식 PDE 발현 수준 (그림 3D)에 상관 BiFC 형광의 선형 증가의 결과. 이러한 결과는 BiFC의 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하여 AKAP-LBC-PDE4D3 상호 작용을 정량화하는 유동 세포 계측법의 사용을 확인. 따라서 우리는 PDE4D에서지도 AKAP-LBC 결합 부위에이 방법을 사용3 VN-AKAP-LBC 및 VC-PDE4D3 구문을 사용하여. VC-PDE4D3-FL 및 VC-PDE4D3-UCR1 (그림 4B)에 비해 그림 1C, VN-AKAP-LBC 및 VC-PDE4D3-UCR2의 표현에서 우리의 관찰과 일치는 + CAT 낮은 BiFC 신호 발생. 유사 단백질 발현은 모든 흐름 샘플 (그림 4C)에서 관찰과 형광 AKAP-LBC, PDE4D3 및 α-tubulin의의 상대적 발현 수준으로 정규화 된 의미 하였다. 따라서 정규화 BiFC MFI는 AKAP-LBC-PDE4D3-FL와 AKAP-LBC-PDE4D3-UCR1 사이의 형광 강도에 차이가 없음을 나타냅니다 만, AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 + CAT 상호 작용 (그림 4A가 훨씬 낮은 신호 ). 이러한 결과는 AKAP-LBC와 상호 작용 PDE4D3의 여러 영역이 있다는 것을 제안하고, PDE4D3-UCR1는 AKAP-LBC와의 상호 작용의 기본 영역입니다. 이 결과는 단백질 - 단백질 상호 작용을위한 황금 표준 (그림 5), 공동 IP에 의해 확인되었다.
그림 1. 면역 형광 현미경으로 AKAP-LBC-PDE4D3 - 조각의 상호 작용 BiFC 분석. 이분자 형광 보완의 A) 도식 대표 (BiFC). 비너스 조각, VN 및 VC는 각각 AKAP-LBC 및 PDE4D3에 융합된다. 기능 YFP의 형광 AKAP-LBC-PDE4D3 상호 작용이 발생합니다. 매핑에 사용 PDE4D3 구조의 B) 구조 다이어그램입니다. C) 형질 전환 HEK 293T 세포의 대표 BiFC 신호. 세포 VN-AKAP-LBC와 BiFC 분석을위한 VC-PDE4D3 구조 (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT)와 공동 형질 전환 하였다. CFP - 벡터는 형질 마커로 공동 형질 전환 하였다. 24 시간 후 형질 세포는 이미징 수정되었습니다. 녹색 CFP가 병합 그림에 사색 빨간색으로 표시되어있는 BiFC 신호가 표시됩니다. 9/50529fig1large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 게이트 및 FACS 분석을위한 보상의 결정. 보상. D 전에 CFP (CFP + 세포)를 표현하는) FSC 대 SSC 점 게이트 살아있는 세포에 플롯과 파편과 죽은 세포를 제외 할 수 있습니다. B) 사이드 분산 형 대 펄스 폭 도트 플롯 게이트 단일 세포와에 집계를 제외한다. C) 세포 YFP 보정 후 CFP (CFP + 세포)를 표현) 세포. YFP 식으로 셀의 컷 - 오프 라인을 다시 측정 하였다. E)를 보상. F 전 BiFC 신호 (YFP + 세포)의 세포) CFP 보정 후 BiFC 신호 (YFP + 세포)의 세포. CFP 식으로 셀의 컷 - 오프 라인을 다시 측정 하였다.대상 = "_blank"> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. PDE4D3 표현의 양을 조절하여 BiFC - 유동 세포 계측법을 사용하여 AKAP-LBC-PDE4D3 상호 작용의 분석. A)는 VC-PDE4D3의 양을 증가 형질 전환 CFP + 세포 내부 BiFC 신호를 증가. 세포 CFP (10 NG), VN-AKAP-LBC (200 NG) 및 VC-PDE4D3의 양을 증가 (2.5 NG 80 NG)로 형질 전환 하였다. 비 집계 CFP + 라이브 세포 게이트되었고 YFP 형광은 앞으로 YFP 대 분산 형 이중 도트 플롯으로 표시됩니다. YFP + 세포는 녹색으로 표시됩니다. 시연 5 NG 20 NG, 80 NG VC-PDE4D3에서 대표 데이터. B) 살아있는 세포에서 CFP 형광이 모든 샘플에 일관되게 CFP 형광을 나타내는 CFP 대 앞으로 분산 형 이중 도트 플롯으로 표시됩니다 표시됩니다. C)는 서양 얼룩 분석 PDE4D3 expressio 증가N AKAP-LBC와 α-tubulin의 (부하 제어로 사용)의 일관된 표정으로. D) 금성 (YFP)는 CFP의 형광 강도 (MFI)을 평균 + 세포 VC-PDE4D3 식으로 상관 관계가있다. CFP + 세포 YFP MFI 모두 배 변화는 집계되지 않은 살아있는 세포에서 CFP MFI 배 변화와 함께 그려집니다. 서양 얼룩의 이미지 J 분석에 의해 결정 VC-PDE4D3의 상대 발현도 그려집니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT는 유동 세포 계측법를 사용하여 AKAP-LBC 상호 작용의 BiFC 분석. A) AKAP-LBC-PDE4D3 - 단편 상호 작용은 단백질 발현 (AKAP-LBC, PDE4D3 조각과로드 제어 α-tubulin의)에 대한 정규화 된 금성 MFI에 의해 정량 하였다. 디BiFC 신호의 ifference는 분산 편도 분석 (ANOVA)으로 분석 하였다 P 값이 0.05 형질 전환 HEK 293T의 뜻 깊은 (NS). B) 대표 BiFC 신호로 간주됩니다 <AP 값이 동안 0.01 (**) 매우 중요한 것으로 간주됩니다>이 세포. HEK 293T 세포는 CFP, VN-AKAP-LBC 및 VC-PDE4D3 구조 (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT)와 공동 형질 전환 하였다. 비 집계 라이브 CFP + 세포는 문이고, 그 BiFC 형광 앞으로 YFP 대에 분산 더블 도트 플롯을 보여줍니다. C) AKAP-LBC와 PDE4D3 - 단편 유사한 표현을 나타내는 서양 얼룩. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 공동 면역 침강 유동 세포 계측법 분석의 확인. HEK 293T 세포 공동 형질 전환 하였다V5-AKAP-LBC과 GFP-PDE4D3 구조 (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT)의 표현. 48 시간 후 형질은 AKAP-LBC는 V5 - 아가로 오스 비즈를 사용하여 immunoprecipitated되었다. PDE4D3-FL의 바인딩 UCR1 및 UCR2 + CAT는 안티 GFP 일차 항체를 사용하여 SDS-PAGE와 서양 얼룩에 의해 발견되었습니다. 면역 침전에 사용되는 해당 PDE4D3 입력은 또한 모든 PDE4D3 - 단편에 대해 비슷한 표현을 나타내는 표시됩니다.
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Discussion
BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 간단하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 새로운 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 없습니다, 그러나, 그것은 세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하고 기능적 특성을 연구하는 것이 특히 편리하다; 같은 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트의 매핑 단백질 복합체의 세포 내, 등, 그리고 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절 수있는 작은 분자 / 펩타이드의 선별합니다. VN 및 VC 조각이 아닌 형광 때문에, 배경 형광 따라서이 분석의 감도를 돕고, 낮은 것입니다. 시간이 VN-단백질 VC-단백질 상호 작용을 성숙 / 안정하는 데 필요한, 따라서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하는 지연이, 최적의 시간 점 따라서 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. 그것은 VN-단백질 VC-단백질 상호 작용은 되돌릴 수 없습니다 것 또한 주목해야한다, 그러므로 유감스럽게도 현재의 금성 BiFC으로이 분석은 t 적합하지 않습니다 생성단백질 - 단백질 상호 작용의 오 연구 동적 반응 속도.
적절한 컨트롤 BiFC 분석을 위해 중요하다. 적절한 대조군이 아닌 상호 작용하는 단백질이나 관련 BiFC 벡터의 비 특정 펩티드, 또는 가능하면, 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해 돌연변이를 포함한다. 가 아닌 특정 높은 배경 형광 결과로 빈 BiFC 벡터를 잘 조절되지 않습니다. BiFC 두 개의 상호 작용하는 단백질에서 관찰되지 않은 경우, 표현을 분석해야한다. 또한, BiFC 신호는 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트에 따라 다를 수 있습니다. 그것은 VN 및 VC 상호 작용의 공간 변조는 형광 강도에 영향을 미칠 수 있다는 것을 주목해야한다 따라서는 C-말단과 N-말단 VN / VC 식 구조를 모두 사용하여 BiFC 실험을 수행하는 초기에 중요합니다. 예를 들어, BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용을 차단 비너스 조각을 다시 연결하면 발생하지 않을 수 있습니다. 따라서, VN 및 VC의 여러 조합 말아야을 구성(C와 N 단자 단백질 융합을 모두 즉) 테스트 할 거라고.
BiFC의 형광 강도가 강한 상호 작용과 약한 상호 작용을 제안하는 낮은 형광 강도를 나타내는 높은 BiFC 강도, 단백질 - 단백질 상호 작용의 강도에 비례한다. BiFC MFI 따라서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 지표로 사용된다. BiFC에 의해 단백질 - 단백질 상호 작용의 정확한 분석을 위해, 서양 얼룩 분석이 더 단백질 분해는 올바른 분석을 방해 할 수있는, 발생하지 않은 다른 구조의 동일한 표현을 보장하기 위해 수행하는 것을 매우 중요하다. 같은 샘플에서 해물 따라서 분석 모든 샘플과 유사한 단백질 발현을 결정하는 서양 얼룩 분석을 위해 선호된다. 또한, 선형 표현과 단백질의 상호 작용을 보장하기 위해 형질에 대한 플라스미드의 적절한 양을 결정하는 것이 중요하며,이 범위 사이에서, 단백질의 상호 작용은 위스콘신의 상관 관계BiFC 신호의 회 형광 강도.
플라스미드 CFP의 낮은 양이 너무 만 CFP 양성 세포가 여기에 분석 하였다 성공적으로 형질 전환을위한 마커로 사용됩니다. 같은 RFP와 같은 다른 형광 단백질이 비쳐 최소화하기 위해 색상 11 사이에 사용할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 단일 양성 세포는 보상을 포함 할 필요가 있습니다. 가능하면 최소 10,000 CFP 양성 세포는 좋은 샘플 크기를 확인하기 위해 계산됩니다.
요약하자면, 우리가 유세포 분석과 결합 BiFC 방법론은 세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용의 좋은 지표로 사용될 수 있음을 보여줍니다. 면역 형광 현미경을 사용하여 BiFC의 전통적인 분석 시간이 소요됩니다, 샘플 크기는 유세포 분석을 흐르게하는 그 대응보다 훨씬 낮습니다. 형질 전환 효율이 낮을 때, 따라서 BiFC와 유동 세포 계측법을 결합하여 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을위한 유리한 수 있습니다. 이에보고서, 우리는 AKAP-LBC에 바인딩 PDE4D3의 상호 작용 사이트를 매핑 할 BiFC - 유동 세포 계측법을 이용했다. 이 기술은 분자 또는 약물 발견 12, 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하거나 향상시킬 수 있습니다 펩티드 화면으로 확장 할 수 있습니다. 이 방법은 또한 GPCR의 13의 리간드에 의한 국제화와 같은 특정 생리 이벤트를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 중요한 실험 평가와 토론을 UIC에서 오브라이언 실험실 감사합니다. 임상 및 번역 과학 그랜트 UL1TR000050에 대한 UIC 센터 -이 작품은 번역 과학의 발전에 대한 GKC 및 국립 센터 미국 심장 협회 부여 11SDG5230003에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
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