Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi
Summary
Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.
Abstract
Hücrelerin içinde protein-protein etkileşimleri incelemek için yöntemler arasında, Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) oldukça basit ve hassastır. BiFC bir floresan protein olmayan iki floresan parçalarının (venüs, bir sarı floresan protein varyantı, burada kullanılan) kullanılarak floresan üretimi esas alınmaktadır. Floresan olmayan Venüs parçaları (VN ve VC) bağlı VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 etkileşim ve fonksiyonel bir floresan protein oluşumu için floresan verecek şekilde iki etkileşen proteinleri (bu durumda, AKAP-Lbc ve PDE4D3) kaynaşmıştır hücrelerin içinde.
BiFC protein komplekslerinin hücre altı konumlanması ve floresan yoğunluğuna dayalı protein etkileşimleri gücü hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, protein-protein etkileşimi kuvvetini ölçmek için mikroskopi kullanılarak BiFC analizi zaman alıcı ve protein ekspresyonu ve etkileşim içinde heterojenite nedeniyle biraz görecelidir. Sitometrik akış kaplinBiFC metodolojisi ile analizi, floresan BiFC protein-protein etkileşimi sinyalini doğru olarak kısa bir süre içinde hücrelerin büyük bir miktar için ölçülebilir. Burada, AKAP-Lbc ile etkileşim için gerekli olan PDE4D3 bölgeleri eşleştirmek için bu metodolojinin bir uygulama göstermektedir. Bu yüksek kapasiteli yöntem, protein-protein etkileşimleri düzenleyen tarama faktörlere uygulanabilir.
Introduction
650.000 protein-protein etkileşimleri, normal hücre fonksiyonlarını 1,2 korunmasında kritik rol oynayan, insan interactome var olduğu tahmin edilmektedir. Ortak immunoprecipitation yanı sıra (eş-IP), altın standart (PCA) hücreleri 3 içinde protein-protein etkileşimleri tespit duyarlılığını artırmak için geliştirilmiştir, hücre lizat birkaç protein parçası tamamlama deneyleri protein-protein etkileşimleri incelemek için. Teknikleri Förster rezonans enerji transferi (FRET), Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (BRET) ve Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) 4,5 içerir. Her potansiyel bir etkileşim protein ortağı (bu örnekte biz AKAP-Lbc ve PDE4D3 kullanın) sigortalarla, BiFC bir floresan protein iki parça (bir YFP varyant burada Venüs kullanın) kolaylaştırdı dernek dayanmaktadır. F tarafından görüntülenmiştir olabilir fonksiyonel floresan hücreleri sonuçları içinde ilgi iki protein, etkileşimiCanlı veya sabit hücreleri 6,7,8 kullanarak luorescence mikroskobu. Diğer PCA ile karşılaştırıldığında, BiFC canlı hücrelerde hücresel yerleşimi çalışma potansiyeli olan, duyarlı ve daha az teknik zordur. Bu tekniğin büyük bir dezavantajı, ancak bir kere oluştuktan sonra, floresan protein kompleksi geri alınamaz olmasıdır. Bu nedenle dinamik protein-protein etkileşimleri incelemek için iyi bir yöntem değildir. Bu yazıda, Venüs floresan yoğunlukları izleyerek AKAP-Lbc ile PDE4D3 etkileşimi siteleri eşleştirmek için BiFC kullanın. (Otomatik yüksek kapasiteli makineler kullanılarak gerçekleştirilmiştir değilse) zaman alıcı ve emek-yoğun floresan mikroskobu kullanarak geleneksel analizi ile karşılaştırıldığında, akım sitometri, kısa bir süre 9 üzerinde heterojen nüfus hücrelerin binlerce basit bir kantitatif analiz sağlar 10. Burada, akış sitometrik-BiFC analizi ve ortak IP geleneksel bir yan-yana karşılaştırma yaparak, biz göstermek bu iki methods karşılaştırılabilir veri sağlamak, ancak, akış sitometrik BiFC analizi zaman alıcı az ve ilgi hücreleri sınırlı zaman daha yararlı olabilir daha az malzeme kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC protein-protein etkileşimleri incelemek için basit ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, yeni bir protein-protein etkileşimleri tanımlamak için kullanılamaz, ancak, bu hücre içinde, protein-protein etkileşimi teyit etmek için ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için özellikle uygundur, örneğin protein-protein etkileşimi siteleri eşleme protein kompleksleri hücre altı konumlanması olarak, ve protein-protein etkileşimi modüle eden küçük moleküller / peptitlerin taranması için. VN ve VC …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz eleştirel deneysel değerlendirme ve tartışma için UIC de O'Bryan laboratuvar teşekkür ederim. Klinik ve Translasyonel Bilimler Hibe UL1TR000050 için UIC Merkezi – Bu çalışma Translational Bilim ilerlemek için GKC ve Ulusal Merkezi Amerikan Kalp Derneği Hibe 11SDG5230003 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O’Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
