Summary
L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.
Abstract
Tra i metodi per studiare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule, bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è relativamente semplice e sensibile. BiFC è basato sulla produzione di fluorescenza con due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente (Venere, una variante Proteina Fluorescente Giallo, è usato qui). Non fluorescenti frammenti Venus (VN e VC) sono fusi a due proteine interagenti (in questo caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), cedendo fluorescenza dovuto all'interazione VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e la formazione di una proteina fluorescente funzionale all'interno delle cellule.
BiFC fornisce informazioni sulla localizzazione subcellulare di complessi proteici e la forza delle interazioni proteina basati sull'intensità di fluorescenza. Tuttavia, l'analisi BiFC utilizzando microscopia a quantificare la forza di interazione proteina-proteina è lunga e alquanto soggettiva causa di eterogeneità nell'espressione della proteina e di interazione. Con flusso citometria accoppiamentoanalisi con metodologia BiFC, il segnale di interazione proteina-proteina fluorescente BiFC può essere misurata con precisione per una grande quantità di cellule in breve tempo. Qui, dimostriamo una applicazione di questa metodologia per mappare le regioni in PDE4D3 che sono necessari per l'interazione con AKAP-Lbc. Questa metodologia throughput elevato può essere applicata a fattori di screening che regolano l'interazione proteina-proteina.
Introduction
650.000 interazioni proteina-proteina sono stimati ad esistere nel interattoma umano, gioca un ruolo critico nel mantenimento della normale funzionalità delle cellule 1,2. Oltre co-immunoprecipitazione (co-IP), il gold standard per studiare l'interazione proteina-proteina dal lisato cellulare, parecchi frammenti proteici saggi di complementazione (PCA) sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nella rilevazione di interazione proteina-proteina all'interno delle cellule 3. Le tecniche includono Förster Resonance Energy Transfer (FRET), bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), e bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) 4,5. BiFC si basa sull'associazione facilitato dei due frammenti di una proteina fluorescente (qui usiamo Venere; una variante YFP) che sono ognuno fuso ad un potenziale partner proteine interagenti (in questo esempio si usa AKAP-Lbc e PDE4D3). Interazione dei due proteine di interesse all'interno di cellule risultati nella fluorescenza funzionali, che possono essere visualizzati da fmicroscopia luorescence utilizzando sia cellule vive o fissa 6,7,8. Rispetto ad altri APC, BiFC è sensibile e tecnicamente meno impegnativo, con la possibilità di studiare la localizzazione cellulare in cellule vive. Un grave inconveniente di questa tecnica tuttavia è che una volta formato, il complesso proteina fluorescente non può essere invertito. Quindi non è un buon metodo per studiare l'interazione proteina-proteina dinamico. In questo lavoro, si usa BiFC per mappare i siti di interazione di PDE4D3 con AKAP-Lbc monitorando le intensità di fluorescenza di Venere. Rispetto ai tradizionali analisi mediante microscopia a fluorescenza, che richiede tempo e manodopera (se non effettuata con macchine ad alta velocità automatizzato), citometria a flusso fornisce un'analisi quantitativa diretto di migliaia di cellule in una popolazione eterogenea in un breve tempo 9, 10. Qui, effettuando un confronto side-by-side di analisi citofluorimetrica-BiFC e co-IP tradizionale, dimostriamo che i due metodi forniscono dati comparabili, tuttavia, il flusso di analisi BiFC citometria richiede meno tempo e utilizza meno materiale che potrebbe essere più utile quando le cellule di interesse sono limitati.
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Protocol
1. Trasfezione delle cellule
- Cellule piastra il giorno prima della transfezione, placcatura meno cellule per immunofluorescenza.
- Per immunofluorescenza: in un 6-pozzetti, cappotto di vetro coprioggetto (1 per bene) con il 0,02% di gelatina a 37 ° C per almeno 4 ore, lavare una volta con il mezzo, e per ogni bene, piastra 1 x 10 5 HEK 293T cellule in 2 ml di mezzo di crescita completo [mezzi di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) più 10% FBS].
- Per le analisi di citometria a flusso e Western Blot: piatto 1,2 x 10 5 HEK 293T cellule / pozzetto in 2 ml di terreno di coltura completo in 6 pozzetti (0,3 x 10 5 HEK 293T cellule in 0,5 ml di mezzo di coltura completo per pozzetto in piastra da 24 pozzetti ).
- Preparare DNA per trasfezione secondo il protocollo di produzione: Effectene (Qiagen) viene utilizzato per l'immunofluorescenza. Transit-LT1 (Mirus) è utilizzato per le analisi di flusso citometria e Western Blot. Quantità di DNA utilizzato è elencato di seguito.
Trasfezione usando Effectene (6 pozzetti):24-pozzetti (ng) 6 pozzetti (ng) CFP-vettore 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC-N-PDE4D3 UCR1 (un frammento N-terminale PDE4D3 contenente il dominio UCR1) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (un frammento C-terminale PDE4D3 contenente i domini UCR2 e catalitici) 100 - Aggiungi quantità indicata di DNA plasmidico + 4 pl enhancer a 100 microlitri di buffer CE, mescolare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 5 Effectene ml, mescolare e incubare per 10 minuti atemperatura ambiente. Aggiungere goccia a goccia per le cellule.
- Aggiungere quantità indicata di DNA plasmidico a 250 μl/50 pl di Opti-MEM I mezzo privo di siero in una provetta sterile.
- Aggiungere il reagente Transit-LT1 alla miscela di DNA diluito e pipettare delicatamente per mescolare. (Transito-LT1 reagente: rapporto di DNA è di 3 ml di transito LT1-reagente per 1 mg di DNA).
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente ed aggiungere goccia a goccia alle cellule.
2. Preparazione delle cellule per la citometria a flusso, Western Blot, e immunofluorescenza
- 24 ore dopo la trasfezione, controllare la fluorescenza sotto microscopio a epifluorescenza prima che le cellule raccolta.
- Preparazione delle cellule per l'analisi di citometria a flusso:
- Lavare le cellule con 0,5 ml / 2 ml PBS freddo per lastre 24-well/6-well.
- Staccare le cellule utilizzano 50 μl/250 microlitri 0,05% tripsina.
- Neutralizzare la tripsina con 200 pl / 1 ml di DMEM.
- Collect 250 cellule microlitri (sia per piastra da 24 pozzetti e 6 pozzetti) per centrifugazione a 500 xg per 5 min, utilizzare i restanti cellule (1 ml) per l'analisi Western blot.
- Risospendere le cellule in 250 microlitri tampone FACS [PBS + 0,5% (w / v) di BSA + 2 mM EDTA], negozio su ghiaccio per analisi citofluorimetrica. Le celle possono anche essere fissati in paraformaldeide 1% (in PBS) se l'analisi di citometria a flusso non sarà immediata.
- Preparazione delle cellule per l'analisi Western Blot: condotta in parallelo con la preparazione delle cellule per l'analisi di citometria a flusso.
- Lavare le cellule 1x con 2 ml di PBS ghiacciato, lisare cellule aggiungendo 100 pl di tampone di lisi cellulare [10 mM tampone fosfato di sodio, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
- Raccogliere lisato cellulare mediante centrifugazione per 10 min a 21.000 xga 4 ° C.
- Quantificare la concentrazione di proteine mediante test proteina Bradford, caricare la stessa quantità di proteine per ogni corsia per SDS-PAGE, e trasferimento in nitrocellulosa per immunoblotting.
- Preparazione delle cellule per immunofluorescenza.
- Risciacquare cellule 3x con 2 ml di PBS, fissare le cellule in 1 ml di 3,7% paraformaldeide (in PBS) per 10 min a temperatura ambiente, poi lavare 3x con 2 ml di PBS per 5 min.
- Montare coprire scivolare su un vetrino, con mezzo di montaggio. Sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie, se necessario.
- Conservare i vetrini a 4 ° C prima dell'esame.
3. Citometria a flusso e microscopia di immunofluorescenza
- Citometria di flusso viene eseguita usando un Beckman Coulter Ciano ADP, dotato di 488 nm, 405 nm e 642 nm laser allo stato solido. Software Summit è utilizzato per l'acquisizione e l'analisi.
- Calibrare citofluorimetro utilizzando perline standard.
- Diagramma a dispersione in avanti (FSC) / Orientabilità scatter (SSC) su una scala lineare per gating popolazione di cellule vive.
- Trama larghezza di impulso FSC / tensione di gating non aggregata popolazione di cellule vive.
- Trama count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) su scala logaritmica per gating non aggregati cellule CFP-positive vivi.
- Trama count/FL1 (YFP fluorescenza, 488 nm) su una scala logaritmica per l'intensità BiFC.
- Esegui campioni YFP-CFP-Double Negative, regolare FSC, SSC, FL1 e FL6 tubo foto moltiplicatore (PMT) per impostare la tensione di soglia per ogni segnale.
- Esegui unico positivo (entrambi + + YFP e CFP) i campioni per il futuro di compensazione off-line
- Acquisire almeno 10.000 eventi recintata (+ cellule PCP vivo non aggregati) per l'analisi.
- Microscopia ad immunofluorescenza viene eseguita utilizzando un Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Nota: è importante mantenere tutte le impostazioni (come ad esempio lo zoom, foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset, dimensione del frame, velocità di scansione, scansione media, e la potenza del laser) coerente tra campioni per una corretta comparazione di tutti i dati.
4. Analisi dei dati (effettuata utilizzando il software Summit)
- Impostare il protocollo di analisi simile a quella per Acquisizione con una corretta gating:
Gate 1 in FSC / SSC dot plot per le cellule vive.
Gate 2 in FSC / larghezza di impulso di Gate 1 per le cellule vive non aggregati.
Gate 3 nel conteggio / CFP di Gate 3 per CFP non aggregata + cellule vive. - Compensare YFP e CFP segnale usando + e + PCP cellule positive singole YFP.
- Rideterminare le linee di taglio per le cellule CFP / YFP-positivo.
- Export YFP fluorescenza media (MFI) di PCP + celle in Excel per i dati-stampa.
- Normalizzare YFP IFM ai livelli di espressione di AKAP-LBC PDE4D3, e il caricamento di controllo α-tubulina, come determinato da Western Blot.
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Representative Results
AKAP-Lbc e PDE4D3 costrutti (Figura 1B) sono state fuse a VN e frammenti VC, rispettivamente. Interazione di AKAP-Lbc e PDE4D3 risultati in funzionale YFP fluorescenza (Figura 1A). Qui usiamo il metodo BiFC per mappare i siti AKAP-LBC-vincolanti in PDE4D3. Regione a monte conservata 1 (UCR1), regione a monte conservato 2 (UCR2) e regione catalitica (CAT) sono conservati tra PDE4 proteine della famiglia, quindi, tutta la lunghezza (FL), UCR1 e UCR2 più CAT sono stati utilizzati per lo screening del sito di legame di PDE4D3 a AKAP-Lbc. L'espressione di VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3-frammenti in HEK 293T risultati cellule nella fluorescenza con intensità diversa (Figura 1C). BiFC dimostrano che sia UCR1 e UCR2 + CAT contribuiscono alla interazione di PDE4D3 con AKAP-Lbc. Una maggiore intensità di fluorescenza risultante dalla interazione AKAP-LBC-UCR1, rispetto al AKAP-LBC-UCR2 + CAT, indica che PDE-UCR1 lega a AKAP-Lbc meglio di PDE-UCR2 + CAT.
(Figura 2A), e aggregati di cellule sono stati esclusi mediante SSC vs Pulse Width doppio punto (Figura 2B). Cellule con segnale BiFC o espressione CFP solo erano used per determinare il compenso e cut-off per le cellule senza fluorescenza (Figure 2C-2F). CFP vettoriale è stato co-trasfettate con costrutti BiFC ed espressione della PCP è stato utilizzato come indicatore positivo per indicare trasfezione di successo. Solo + cellule della PCP sono stati utilizzati per la misurazione della fluorescenza BiFC. Trasfezione di quantità crescenti di PDE4D3 conseguenza di aggravare Venere (YFP) BiFC segnale (Figura 3A), mentre il segnale CFP rimasto invariato (Figura 3B). Espressione di VN-AKAP-Lbc e quantità crescenti di VC-PDE4D3 è stata confermata mediante Western blot (Figura 3C). Nel complesso, una maggiore espressione PDE ha determinato un aumento lineare di BiFC fluorescenza correlare i livelli di espressione di PDE (Figura 3D). Questi risultati convalidato l'uso di citometria a flusso per quantificare l'interazione AKAP-LBC-PDE4D3 misurando l'intensità di fluorescenza media (MFI) di BiFC. Abbiamo quindi utilizzato questa metodologia di mappa AKAP-Lbc siti di legame all'interno PDE4D3 usando VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3 costrutti. Coerentemente con le nostre osservazioni in figura 1C, espressione di VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3-UCR2 + CAT comportato segnale BiFC inferiore rispetto a VC-PDE4D3-FL e VC-PDE4D3-UCR1 (Figura 4B). Espressione della proteina simile è stato osservato in tutti i campioni di flusso (Figura 4C) e la media di fluorescenza è stata normalizzata per i relativi livelli di espressione di AKAP-LBC PDE4D3, e α-tubulina. Pertanto, normalizzato BiFC IFM indica che non vi è alcuna differenza di intensità di fluorescenza tra AKAP-LBC-PDE4D3-FL e AKAP-LBC-PDE4D3-UCR1, ma segnale molto più basso per AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 + interazione CAT (Figura 4A ). Questi risultati suggeriscono che non ci sono più le regioni PDE4D3 che interagiscono con AKAP-Lbc, e che PDE4D3-UCR1 è la regione principale di interazione con AKAP-Lbc. Questo risultato è stato confermato anche da co-IP, il gold standard per l'interazione proteina-proteina (Figura 5).
Figura 1. Analisi BiFC di interazione AKAP-LBC-PDE4D3-frammento di immunofluorescenza. A) Schema rappresentativo di bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC). Frammenti di Venere; VN e VC sono fusi a AKAP-Lbc e PDE4D3 rispettivamente. AKAP-LBC-PDE4D3 risultati interazione funzionale a fluorescenza YFP. B) Schema di PDE4D3 costrutti utilizzati per la mappatura. C) Segnali BiFC rappresentativi di cellule HEK 293T transfettate. Le cellule sono state co-trasfettate con VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3 costrutti (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT) per l'analisi BiFC. CFP-vettoriale è stato anche co-trasfettate come marcatore trasfezione. 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state fissate per l'imaging. Segnale BiFC viene evidenziato in verde e CFP è mostrato in falsi colori rosso nelle figure unite. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Determinazione delle porte e dei risarcimenti per le analisi FACS. A) FSC vs SSC dot plot per cancello cellule vive e di escludere detriti e cellule morte. B) Side Scatter vs larghezza di impulso dot plot per cancello singole cellule e di escludere aggregati. C) Le cellule che esprimono CFP (+ cellule PCP) prima della compensazione. D ) Le cellule che esprimono CFP (+ cellule PCP) dopo la compensazione YFP. La linea di demarcazione per le cellule con espressione YFP è stato rideterminato. E) cellule con segnale BiFC (+ cellule YFP) prima di indennizzo. F) cellule con segnale BiFC (+ cellule YFP) dopo la compensazione CFP. La linea di demarcazione per le cellule con espressione CFP è stato rideterminato.target = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Analisi di interazione AKAP-LBC-PDE4D3 utilizzando Citometria BiFC-Flow variando la quantità di PDE4D3 espressione. A) Aumento del segnale BiFC dentro + cellule PCP trasfettate con quantità crescenti di VC-PDE4D3. Le cellule sono state transfettate con CFP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) e quantità crescenti di VC-PDE4D3 (2,5 ng a 80 ng). Cellule CFP + Live non aggregati sono stati gated e YFP fluorescenza è mostrato come YFP vs Forward Scatter doppio dot plot. + Cellule YFP sono visualizzati in verde. Dati indicativi di 5 ng, 20 ng, e 80 ng VC-PDE4D3 è mostrato. B) CFP fluorescenza in cellule vive è indicato come PCP vs Forward Scatter doppio dot plot, indicando coerente fluorescenza PCP tra tutti i campioni. C) Analisi Western blot dimostrano aumentando PDE4D3 expression con espressione coerente di AKAP-Lbc e α-tubulina (usato come controllo di carico). D) Venere (YFP) Media intensità di fluorescenza (MFI) di PCP + cellule è correlato con VC-PDE4D3 espressione. Fold change di entrambi YFP MFI da + cellule della PCP è tracciata con CFP MFI piega cambiamento da cellule vive non aggregati. Livelli di espressione relativi di VC-PDE4D3 determinati da Immagine J analisi di Western blot sono anche tracciate. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Analisi BiFC di interazione AKAP-Lbc con PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT mediante citometria a flusso. A) Interazione AKAP-LBC-PDE4D3-frammento è stato quantificato da Venere-IFM normalizzato per l'espressione della proteina (AKAP-LBC PDE4D3 frammenti e carico di controllo α-tubulina). Differenza in segnale BiFC sono stati esaminati da una analisi della varianza (ANOVA) Un valore di p <0.01 è considerato molto significativo (**), mentre un valore di p <0.05 è considerato non significativo. B) Rappresentante segnale BiFC (ns) in transfettate HEK 293T cellule. Cellule HEK 293T sono state co-trasfettate con CFP, VN-AKAP-Lbc e VC-PDE4D3 costrutti (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). + Cellule CFP vivo non aggregati erano gated, e la loro fluorescenza BiFC è mostrato in YFP vs Forward Scatter doppio dot plot. C) Western Blot indicando espressione comparabile di AKAP-Lbc e PDE4D3-frammenti. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Conferma di analisi di citometria a flusso di co-immunoprecipitazione. HEK cellule 293T sono state co-trasfettateper l'espressione di V5-AKAP-Lbc e GFP-PDE4D3 costrutti (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). 48 ore dopo la trasfezione, AKAP-Lbc stata immunoprecipitata usando V5-agarosio. Il legame di PDE4D3-FL, UCR1 e UCR2 + CAT è stata rilevata mediante SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi anti-GFP anticorpo primario. La corrispondente PDE4D3 ingresso utilizzato per immunoprecipitazione è anche mostrato, indicando espressione simile per tutti PDE4D3-frammenti.
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Discussion
BiFC è un metodo semplice e sensibile per studiare l'interazione proteina-proteina. Questo metodo non può essere usato per identificare nuove interazioni proteina-proteina, tuttavia, è particolarmente conveniente per confermare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule e per studiare le proprietà funzionali, quali localizzazione subcellulare dei complessi proteici, mappatura dei siti di interazione proteina-proteina, e per lo screening di piccole molecole / peptidi che possono modulare l'interazione proteina-proteina. Perché VN e VC frammenti sono non fluorescente, fluorescenza di fondo è basso, favorendo in tal modo la sensibilità di questo test. Ora è necessario per maturare / stabilizzare l'interazione proteina-VN-VC-proteina, quindi non vi è ritardo per visualizzare l'interazione proteina-proteina, e ottimale punti temporali può pertanto essere determinata empiricamente. Va inoltre notato che l'interazione proteina-VN-VC-proteina non è reversibile, quindi purtroppo con corrente Venus BiFC costruisce questo dosaggio non è adatto to Studio cinetica dinamiche di interazione proteina-proteina.
Controlli adeguati sono importanti per l'analisi BiFC. Un controllo negativo adatto comprende proteine non interagenti o peptidi non-specifici nel vettore BiFC nocivi, oppure, se possibile, un mutante che sconvolge l'interazione proteina-proteina. Vettore vuoto BiFC non è un buon controllo quanto esso determina non specifico elevata fluorescenza di fondo. Se BiFC non è osservata in due proteine interagenti, espressione dovrebbe essere analizzato. Inoltre, il segnale BiFC può variare a seconda dei siti di interazione proteina-proteina. Va notato che la modulazione spaziale della interazione VN e VC può anche influenzare l'intensità di fluorescenza, quindi inizialmente è importante effettuare esperimenti BiFC utilizzando sia C-terminale e N-terminale VN / VC costrutti di espressione. Per esempio, BiFC non può verificare se interazione proteina-proteina blocca la riassociazione dei frammenti Venus. Pertanto, molteplici combinazioni di VN e VC costruisce spallad essere testato (cioè sia in C e N terminali fusioni proteiche).
Intensità di fluorescenza di BiFC è proporzionale alla forza di interazione proteina-proteina, con una maggiore intensità BiFC indicando forte interazione e una intensità di fluorescenza inferiore suggerendo interazione debole. BiFC MFI è quindi utilizzato come indicatore per l'interazione proteina-proteina. Per precisa analisi di interazione proteina-proteina mediante BiFC, è molto importante che l'analisi Western blot è effettuata per assicurare parità espressione di costrutti diversi e che nessuna degradazione delle proteine sta avvenendo, che possono interferire con l'analisi corretta. Lisato dagli stessi campioni è quindi preferibile per l'analisi Western blot per determinare l'espressione della proteina simile per tutti i campioni analizzati. Inoltre, è fondamentale per determinare la quantità adatta di plasmidi per la trasfezione di garantire un'espressione lineare e l'interazione di proteine, e fra questo intervallo, l'interazione della proteina correla with intensità di fluorescenza di segnale BiFC.
Bassa quantità di CFP plasmide viene utilizzato come marcatore per la trasfezione di successo, in modo che solo le cellule positive PCP sono state analizzate qui. Una proteina fluorescente differente, come RFP può essere usato per ridurre gli sanguinare-through tra colori 11. Per la citometria a flusso, sono necessarie singole cellule positive da includere per il risarcimento. Se possibile, almeno 10.000 cellule positive della PCP vengono conteggiate al fine di garantire una buona dimensione del campione.
In sintesi, qui dimostriamo che l'accoppiamento metodologia BiFC con analisi citofluorimetrica può essere usato come un buon indicatore di interazione proteina-proteina all'interno delle cellule. Tradizionale analisi di BiFC utilizzando microscopio immunofluorescenza richiede molto tempo, e la dimensione del campione è molto inferiore a quello corrispondente alle mediante citometria a flusso. Così, accoppiamento citofluorimetria con BiFC può essere vantaggioso per l'analisi di interazione proteina-proteina quando l'efficienza di trasfezione è bassa. In questorapporto, abbiamo approfittato di Citometria BiFC-Flow per mappare i siti di interazione in PDE4D3 per il legame al AKAP-Lbc. Questa tecnica può anche essere esteso per schermo per molecole o peptidi che possono disturbare o migliorare l'interazione proteina-proteina, per la scoperta 12. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare alcuni eventi fisiologici, come internalizzazione ligando-indotta del 13 di GPCR.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo il laboratorio O'Bryan a UIC per la valutazione sperimentale critica e discussione. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association Concessione 11SDG5230003 di GKC e National Center for Advancing Science Translational - Centro UIC per Scienze Cliniche e traslazionale sovvenzione UL1TR000050.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
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