تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين
Summary
تحليل تدفق cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء يوفر طريقة الكمية الإنتاجية العالية لدراسة التفاعل البروتين البروتين. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لرسم الخرائط مواقع الربط البروتين ولفحص العوامل التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.
Abstract
بين أساليب لدراسة التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا، التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) هو بسيط نسبيا وحساسة. ويستند BiFC على إنتاج مضان باستخدام اثنين من شظايا غير فلوري من بروتين فلوري (يتم استخدام فينوس، أصفر نيون البديل البروتين، هنا). وتنصهر شظايا فينوس غير الفلورسنت (VN وVC) لاثنين من البروتينات المتفاعلة (في هذه الحالة، AKAP-LBC وPDE4D3)، مما أسفر عن مضان بسبب التفاعل VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 وتشكيل بروتين فلوري وظيفية داخل الخلايا.
يوفر BiFC المعلومات على توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين وقوة تفاعلات البروتين على أساس كثافة مضان. ومع ذلك، تحليل BiFC باستخدام المجهر لقياس قوة التفاعل البروتين البروتين هو مضيعة للوقت وغير موضوعي إلى حد ما بسبب عدم التجانس في تعبير البروتين والتفاعل. بواسطة اقتران تدفق cytometricتحليل مع منهجية BiFC، وفلوري BiFC البروتين البروتين إشارة التفاعل يمكن قياسها بدقة للحصول على كمية كبيرة من الخلايا في وقت قصير. هنا، علينا أن نظهر تطبيق هذه المنهجية لرسم خريطة المناطق في PDE4D3 التي مطلوبة من أجل التفاعل مع AKAP-LBC. ويمكن تطبيق هذه المنهجية إنتاجية عالية لعوامل الفرز التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.
Introduction
وتقدر 650،000 البروتين البروتين التفاعلات في الوجود في interactome الإنسان، ولعب أدوارا حاسمة في الحفاظ على وظائف الخلية العادية 1،2. وبالاضافة الى المشارك مناعي (CO-IP)، المعيار الذهبي لدراسة التفاعل البروتين البروتين من الخلايا المحللة، العديد من البروتين شظية المقايسات تكامل (PCA) تم تطويرها لتحسين حساسية في الكشف عن تفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا 3. وتشمل تقنيات الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق)، تلألؤ بيولوجي بالرنين نقل الطاقة (BRET)، والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) 4،5. ويستند BiFC على جمعية تيسير اثنين من أجزاء من بروتين فلوري (هنا نستخدم فينوس؛ البديل YFP) التي تنصهر فيها كل لإمكانات شريك البروتين التفاعلي (في هذا المثال نستخدم AKAP-LBC وPDE4D3). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام داخل خلايا النتائج في مضان وظيفية، والتي يمكن أن تصور كتبها fالمجهر luorescence باستخدام خلايا حية أو الثابتة 6،7،8. مقارنة PCAs أخرى، BiFC حساس وأقل تحديا من الناحية التقنية، مع القدرة على دراسة توطين الخلوية في الخلايا الحية. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب ولكن هو أنه بمجرد تشكيل، مجمع بروتين فلوري لا يمكن عكسها. ولذلك فإنه ليس طريقة جيدة لدراسة ديناميكية التفاعل البروتين البروتين. في هذه الورقة، ونحن نستخدم BiFC لرسم خريطة للمواقع التفاعل من PDE4D3 مع AKAP-LBC خلال رصد كثافة مضان من كوكب الزهرة. بالمقارنة مع التحليل التقليدي باستخدام المجهر مضان، التي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة (إذا لم تنفذ باستخدام آلات مؤتمتة عالية الإنتاجية)، ويوفر التدفق الخلوي تحليل كمي مباشرة الآلاف من الخلايا في السكان غير متجانسة على مدى فترة زمنية قصيرة 9، 10. هنا، من خلال تنفيذ مقارنة جنبا إلى جنب من تحليل تدفق cytometric-BiFC والتقليدية المشارك IP، علينا أن نظهر أن اثنين من مethods توفير بيانات قابلة للمقارنة، ومع ذلك، تدفق تحليل BiFC cytometric هو أقل استهلاكا للوقت ويستخدم أقل من المواد التي قد تكون أكثر فائدة عندما يتم خلايا الفائدة محدودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC هو وسيلة بسيطة وحساسة لدراسة التفاعل البروتين البروتين. هذا الأسلوب لا يمكن أن تستخدم لتحديد البروتين البروتين التفاعلات الجديدة، ومع ذلك، وأنها مريحة خاصة لتأكيد التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا ودراسة الخصائص الفنية؛ مثل توطين التحت خلوية من المجمعات ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المختبر O'Bryan في UIC للتقييم التجريبي النقدي والمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 11SDG5230003 إلى مركز GKC والوطنية للنهوض بالحركة العلوم – مركز UIC للعلوم السريرية وبالحركة المنح UL1TR000050.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O’Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
