Summary
ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.
Abstract
בין שיטות ללימוד אינטראקציה בין חלבונים בתוך תאים, שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא יחסית פשוטה ורגישה. BiFC מבוסס על הייצור של הקרינה באמצעות שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי (ונוס, גרסת חלבון פלואורסצנטי צהובה, משמש כאן). ברי ונוס ללא ניאון (VN והון סיכון) הם התמזגו לשני חלבוני אינטראקציה (במקרה זה, AKAP-LBC וPDE4D3), מניב הקרינה עקב אינטראקציה VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 וההיווצרות של חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי בתוך תאים.
BiFC מספק מידע על לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים ואת כוחו של אינטראקציות חלבון המבוססות על עוצמת הקרינה. עם זאת, ניתוח BiFC באמצעות מיקרוסקופ כדי לכמת את כוחו של האינטראקציה בין חלבונים הוא זמן רב ומעט סובייקטיבית בשל ההטרוגניות בביטוי חלבון ואינטראקציה. על ידי צימוד זרימת cytometricניתוח עם מתודולוגיה BiFC, אות ניאון BiFC האינטראקציה בין חלבונים ניתן למדוד במדויק לכמות גדולה של תאים בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים יישום של מתודולוגיה זו כדי למפות אזורים בPDE4D3 הנדרשים לאינטראקציה עם AKAP-LBC. המתודולוגיה תפוקה גבוהה זה יכול להיות מיושם על גורמים המווסתים את הקרנת האינטראקציה בין חלבונים.
Introduction
650,000 אינטראקציות בין חלבונים מוערכות להתקיים בinteractome האנושי, ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על 1,2 פונקציות רגילה של תא. חוץ משיתוף immunoprecipitation (שיתוף ה-IP), את תקן הזהב ללמוד אינטראקציה בין חלבונים מlysate התא, כמה מבחני שלמת בר חלבון (PCA) פותחו כדי לשפר את הרגישות באיתור חלבונים אינטראקציה בתוך תאים 3. טכניקות כוללות העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג), תהודת העברת אנרגיה פליטת אור (ברט), ושלמת הקרינה bimolecular (BiFC) 4,5. BiFC מבוסס על עמותת הנחייתם של שני שברי חלבון פלואורסצנטי (כאן אנו משתמשים ונוס; גרסת YFP), כי הם כל התמזגו לשותף חלבון אינטראקציה פוטנציאלי (בדוגמה זו אנו משתמשים AKAP-LBC וPDE4D3). אינטראקציה של שני החלבונים של עניין בתוך תוצאות תאים בקרינה פונקציונלית, אשר ניתן דמיינו ידי Fמיקרוסקופיה luorescence או באמצעות תאי חיים או קבועים 6,7,8. בהשוואה לPCAs אחר, BiFC הוא רגיש ופחות מאתגר מבחינה טכנית, עם פוטנציאל ללמוד לוקליזציה הסלולר בתאים חיים. חסרון עיקרי של שיטה זו הוא שיצר עם זאת פעם אחת, לא יכול להיות הפוך מורכב חלבון פלואורסצנטי. לכן זה לא שיטה טובה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים דינמיים. במאמר זה, אנו משתמשים BiFC למפות את האתרים של האינטראקציה עם PDE4D3 AKAP-LBC על ידי ניטור את עוצמות הקרינה של ונוס. בהשוואה לניתוח מסורתי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שהוא גוזל זמן והעבודה אינטנסיבי (אם לא מתבצע באמצעות מכונות אוטומטיות תפוקה גבוהה), cytometry הזרימה מספק ניתוח הכמותי פשוט של אלפי תאים באוכלוסייה הטרוגנית על פני זמן קצר 9, 10. כאן, על ידי ביצוע השוואת Side-by-צד של זרימת ניתוח ושיתוף IP מסורתי cytometric-BiFC, אנו מדגימים כי שתיים מ 'ethods לספק נתונים דומים, עם זאת, ניתוח תזרים cytometric BiFC הוא פחות זמן רב ומשתמש בפחות חומר שעשויה להיות שימושיות יותר כאשר תאים של עניין מוגבלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfection הסלולרי
- פלייט תאי היום לפני transfection, תאי ציפוי פחות עבור immunofluorescence.
- לimmunofluorescence: בצלחת, מכסה מחליק זכוכית מעיל 6 גם (1 לכל טוב) עם 0.02% ג'לטין על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות, לשטוף פעם עם מדיום, וגם לכל אחד, צלחת 1 x 10 5 HEK 293T 2 תאים במדיום גידול מ"ל מלא [התקשורת השונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% FBS].
- למנתח כתם זרימת cytometric והמערבי: צלחת 1.2 x 10 5 תאי HEK 293T / גם במדיום גידול 2 מ"ל שלם בצלחת 6 היטב (0.3 10 293T תאי x 5 HEK ב0.5 מדיום גידול שלם מ"ל לכל טוב בצלחת 24 גם ).
- הכן את ה-DNA לtransfection פי הפרוטוקול של הייצור: Effectene (Qiagen) משמש לimmunofluorescence. Transit-LT1 (Mirus) משמש למנתח כתם זרימת cytometric והמערבי. כמות ה-DNA משמש היא מפורטת להלן.
Transfection באמצעות Effectene (6 היטב):צלחת 24 גם (נ"ג) צלחת 6 היטב (נ"ג) CFP וקטור 10 50 VN N-AKAP-LBC 200 1000 N-VC PDE4D3-FL (באורך מלא PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC-N-PDE4D3 UCR1 (שבר PDE4D3 N-מסוף המכיל תחום UCR1) 100 VC-N-PDE4D3 UCR2 + חתול (שבר בטרמינל C-PDE4D3 המכיל את תחומי UCR2 וקטליטי) 100 - הוסף סכום המצוין של פלסמיד דנ"א + 4 משפר μl עד 100 μl החיץ EC, לערבב, ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 5 Effectene μl, לערבב, ודגירה במשך 10 דקות בשעהטמפרטורת חדר. הוסף טיפה חכמה לתאים.
- הוסף סכום המצוין של ה-DNA פלסמיד ל250 μl/50 μl של מדיום סרום ללא Opti-ממ אני בצינור סטרילי.
- הוסף מגיב Transit-LT1 לתערובת ה-DNA בדילול מלא ופיפטה בעדינות לתערובת. (Transit-LT1 מגיב: יחס ה-DNA הוא 3 μl של-LT1 מעבר למגיב 1 מיקרוגרם של ה-DNA).
- דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר ולהוסיף טיפה חכמה לתאים.
2. הכנת תא לcytometry זרימה, כתם מערבי, וImmunofluorescence
- 24 שעות לאחר transfection, לבדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescence לפני קצירת תאים.
- הכנת תא לניתוח תזרים cytometric:
- שטוף תאים עם 0.5 מ"ל / 2 מ"ל קר כקרח PBS עבור צלחות 24-well/6-well.
- ניתוק תאים באמצעות 50 0.05% טריפסין μl μl/250.
- לנטרל טריפסין עם 200 μl / בינוני 1 מיליליטר DMEM.
- שיתוף250 תאי μl llect (גם בצלחת 24 גם ו6 היטב) על ידי צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות, השתמשו בתאים הנותרים (1 מ"ל) לניתוח כתם מערבי.
- Resuspend תאים ב250 חיץ FACS μl [PBS + 0.5% (w / v) BSA + 2 מ"מ EDTA], לאחסן על קרח לניתוח תזרים cytometric. יכולים גם להיות קבועים בתאי 1% paraformaldehyde (PBS), אם ניתוח תזרים cytometry לא יהיה מיידי.
- הכנת תא לניתוח כתם מערבי: מתבצעת במקביל להכנת תא לניתוח cytometry זרימה.
- שטפו תאי 1x עם 2 מ"ל קר כקרח PBS, lyse תאים על ידי הוספת 100 μl של חיץ תמוגה תא [10 מ"מ חיץ נתרן פוספט, pH 6.95, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 5 מ"מ EGTA, 1% טריטון X-100] .
- לאסוף lysate תא על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 21,000 XG ב 4 ° C.
- לכמת ריכוז חלבון על ידי assay החלבון ברדפורד, טען כמויות שווה של חלבון לכל נתיב ל- SDS, ולהעביר לnitrocellulose לimmunoblotting.
- הכנת תא לimmunofluorescence.
- יש לשטוף את תאי 3x עם 2 מ"ל PBS, לתקן את התאים ב 1 מ"ל של paraformaldehyde 3.7% (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף 3x עם 2 מ"ל PBS במשך 5 דקות.
- הר לכסות להחליק על שקופיות זכוכית, באמצעות הרכבה בינונית. לאטום את קצות coverslip באמצעות לק במידת צורך.
- אחסן את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס לפני הבדיקה.
3. Cytometry זרימה ומיקרוסקופיה immunofluorescence
- cytometry הזרימה מתבצע באמצעות Beckman Coulter ציאן ADP, המצויד ב488 ננומטר, 405 ננומטר, ו642 לייזרים של מצב מוצק ננומטר. תוכנת פסגה משמשת לרכישה וניתוח.
- לכייל cytometer זרימה באמצעות חרוזים סטנדרטיים.
- פיזור עלילה קדימה (FSC) / פיזור צידה (SSC) בקנה מידה ליניארי לאוכלוסיית תא חי gating.
- רוחב הפולס FSC / מתח מגרש לאוכלוסיית תא חי שאינם מצטבר gating.
- עלילת count/FL6 (CFP fluorescencE, 405 ננומטר) בקנה מידת יומן לתאי חיים שאינם מצטברים gating CFP-חיוביים.
- העלילה count/FL1 (YFP הקרינה, 488 ננומטר) בקנה מידה לעוצמת יומן BiFC.
- הפעל דגימות שליליות YFP-CFP כפול, להתאים FSC, SSC, FL1 וFL6 צינור מכפיל תמונה (PMT) מתח כדי לקבוע את הסף לכל אות.
- הפעלה אחת חיובי (גם YFP + +) וCFP פיצוי לא מחובר לעתיד הדגימות
- לרכוש לפחות 10,000 אירועים מגודרים (CFP + תאי חיים שאינם מצטברים) לניתוח.
- מיקרוסקופיה immunofluorescence מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal 510 Zeiss LSM. הערה: חשוב לשמור על כל ההגדרות (כמו זום, חריר, עלייה בגלאי, מגבר קיזוז, גודל מסגרת, מהירות סריקה, סריקת ממוצע, וכוח לייזר) עקבי בין דוגמאות להשוואה נכונה של כל הנתונים.
4. ניתוח נתונים (שבוצע באמצעות תוכנות פסגה)
- להגדיר את פרוטוקול הניתוח הדומה לזה לacquisitיון עם gating התקין:
שער 1 בעלילת FSC / SSC נקודה לתאים חיים.
שער 2 ברוחב FSC / דופק של שער 1 לתאי חיים שאינם מצטברים.
שער 3 בספירה / CFP של שער 3 לCFP אינו מצטבר + תאי חיים. - לפצות YFP ואות CFP באמצעות YFP + + וCFP תאים חיוביים יחידים.
- Re-קובעים קווים חתוכים לתאי CFP / YFP-חיובי.
- יצוא YFP מתכוון עוצמת הקרינה (MFI) של תאי CFP + ל-Excel לנתונים ההתוויה.
- לנרמל YFP MFI לרמות ביטוי של AKAP-LBC, PDE4D3, וטעינת שליטת α-טובולין, כפי שנקבע על ידי כתם מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDE4D3 מבנים (איור 1) AKAP-LBC והיו התמזגו לVN ושברי הון סיכון, בהתאמה. אינטראקציה של PDE4D3 תוצאות תפקודית YFP הקרינה (איור 1 א) AKAP-LBC ו. כאן אנו משתמשים בשיטת BiFC לאתרי AKAP-LBC מחייבים המפה בPDE4D3. אזור נשמרים במעלה הזרם 1 (UCR1), באזור נשמרים במעלה הזרם 2 (UCR2) ואזור קטליטי (CAT) הם נשמרים בין PDE4 חלבוני משפחה, ולכן, באורך מלא (פלורידה), וUCR1 UCR2 תוספת CAT שמשו לסינון אתר הקישור של PDE4D3 לAKAP-LBC. הביטוי של VC-PDE4D3-ברים בתוצאות תאי 293T HEK בקרינת VN-AKAP-LBC ובעצמה שונה (איור 1 ג). BiFC מצביע על כך שגם UCR1 וUCR2 + CAT תורמים לאינטראקציה של PDE4D3 עם AKAP-LBC. עוצמת הקרינה גדולה יותר כתוצאה מאינטראקציה AKAP-LBC-UCR1, בהשוואה לAKAP-LBC-UCR2 + CAT, מצביעה על כך שPDE-UCR1 נקשר AKAP-LBC טוב יותר מאשר PDE-UCR2 + CAT.
= "Jove_content"> הביטוי הטרוגני של מבני BiFC וCFP בתא transfected דורש ניתוח של מספר גדול של תאים לפרשנות מדויקת של תוצאות. עם זאת, ניתוח מסורתי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא עתיר עבודה וסובייקטיבי. זה מונע מאתנו לנצל cytometry הזרימה, לפתח שיטה לנתח את האינטראקציה בין חלבונים באוכלוסיית מדגם גדול במהירות. בתחילה, בצענו ניסויים כדי לאשר BiFC שניתן להשתמש בו כדי לכמת את עוצמת AKAP-LBC והאינטראקציה PDE4D3. תאי 293T HEK היו transfected עם כמות נמוכה של CFP (10 ng), VN-AKAP-LBC (200 NG), והגדלת כמויות של VC-PDE4D3 (2.5 ננוגרם, 5 ng, 10 נג, 20 ng, 40 נג, 80 ng). תאים מתים ותא פסולת הוצאו מניתוח באמצעות FSC לעומת SSC כפול נקודה (איור 2 א), ואגרגטים תא הוצאו באמצעות SSC לעומת רוחב פולס כפולה נקודה (איור 2). תאים עם אות BiFC או ביטוי CFP לבד היו uSED כדי לקבוע את הפיצוי וחתוך לתאים ללא הקרינה (איורים 2C-2F). CFP וקטור היה שותף transfected עם בונה BiFC וביטוי CFP שימש כסמן חיובי כדי לציין transfection המוצלחת. רק CFP + תאים ששימשו למדידת הקרינה BiFC. Transfection של הגדלת כמויות של PDE4D3 הביא גדלה ונוס (YFP) BiFC אות (איור 3 א), ואילו אות CFP נותר ללא שינוי (איור 3). ביטוי לכמויות הולכות וגדלות של VC-PDE4D3 VN-AKAP-LBC ואושר על ידי כתם מערבי (איור 3 ג). בסך הכל, עלה ביטוי PDE הביא לעלייה ליניארית של BiFC הקרינה correlating לרמות ביטוי PDE (איור 3D). תוצאות אלו תוקף את השימוש בcytometry הזרימה לכמת אינטראקציה AKAP-LBC-PDE4D3 על ידי מדידת עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של BiFC. לפיכך, אנו משמשים במתודולוגיה זו לאתרי קישור AKAP-LBC המפה בתוך PDE4D3 באמצעות בונה VC-PDE4D3 VN-AKAP-LBC ו. עולה בקנה אחד עם התצפיות שלנו באיור 1 ג, ביטוי של VN-AKAP-LBC וVC-PDE4D3-UCR2 + CAT הביא אות BiFC נמוכה יותר בהשוואה לVC-PDE4D3-FL וVC-PDE4D3-UCR1 (איור 4). ביטוי דומה חלבון מתבטא בכל דגימות הזרימה (איור 4C) ומתכוון לקרינה הייתה מנורמלת לרמות הביטוי היחסיות של AKAP-LBC, PDE4D3, וα-טובולין. לכן, מנורמל BiFC MFI עולה כי אין הבדל בעוצמת הקרינה בין AKAP-LBC-PDE4D3-FL וAKAP-LBC-PDE4D3-UCR1, אבל אות נמוכה בהרבה ל+ האינטראקציה CAT (איור 4 א AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 ). תוצאות אלו מצביעות על כך שיש אזורים רבים בPDE4D3 כי אינטראקציה עם AKAP-LBC, וכי PDE4D3-UCR1 היא האזור העיקרי של אינטראקציה עם AKAP-LBC. גם תוצאה זו אושרה על ידי שיתוף ה-IP, את תקן הזהב לאינטראקציה בין חלבונים (איור 5).
איור 1. ניתוח של האינטראקציה BiFC AKAP-LBC-PDE4D3-שבר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. א) נציג סכמטי של שלמת הקרינה bimolecular (BiFC). ברי ונוס; VN וVC הם התמזגו לAKAP-LBC וPDE4D3 בהתאמה. תוצאות האינטראקציה AKAP-LBC-PDE4D3 בקרינת YFP פונקציונלית. ב ') תרשים סכמטי של מבנים המשמשים לPDE4D3 מיפוי. ג) אותות BiFC נציג של תאי 293T HEK transfected. תאים היו שיתוף transfected עם בונה-VC (PDE4D3-FL, CAT-UCR1 +,-UCR2) לניתוח BiFC VN-AKAP-LBC ו. CFP וקטור היה גם שיתוף transfected כסמן transfection. 24 שעות לאחר transfection, תאים היו קבועים להדמיה. אות BiFC מוצגת בירוק וCFP מוצג בpseudocolor האדום בנתוני הממוזגים. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. קביעת שערים והפיצוי לניתוח FACS. א) עלילת FSC לעומת SSC הנקודה לתאים חיים שער ולהוציא פסולת ותאים מתים. ב ') עלילת צד פיזור לעומת דופק רוחב נקודה לתאים בודדים שער ולהוציא אגרגטים. C) תאים להביע CFP (CFP + תאים) לפני פיצוי. D תאים להביע CFP) (CFP + תאים) לאחר פיצוי YFP. קו החתך לתאים עם ביטוי YFP היה מחדש נקבע. ה) תאים עם BiFC אות (YFP + תאים) לפני פיצוי. F) תאים עם BiFC אות (YFP + תאים) לאחר פיצוי CFP. קו החתך לתאים עם ביטוי CFP היה מחדש נקבע.target = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. ניתוח של האינטראקציה AKAP-LBC-PDE4D3 באמצעות cytometry BiFC-זרימה על ידי שינוי כמות PDE4D3 הביטוי. א) הגברת BiFC אות בתוך CFP + תאי transfected עם כמויות הולכות וגדלות של VC-PDE4D3. תאים היו transfected עם CFP (10 ng), VN-AKAP-LBC (200 ng) וכמויות הולכות וגדלות של VC-PDE4D3 (2.5 ננוגרם ל80 ng). תאי CFP + חיות שאינם מצטברים היו מגודר וקרינת YFP מוצגת כYFP לעומת קדימה עלילת נקודת פיזור כפולה. YFP + תאים מוצגים בצבע ירוק. נציגי נתונים מ 5 ng, 20 ng, ו80 ng VC-PDE4D3 מוצגים. ב ') הקרינה CFP בתאים חיים מוצגת כעלילת CFP לעומת קדימה פיזור כפולה נקודה, המציין הקרינה CFP עקבית בין כל הדגימות. C) ניתוח כתם מערבי מפגין הגדלת PDE4D3 expression עם ביטוי עקבי של AKAP-LBC וα-טובולין (ששמש כביקורת טעינה). ד ') ונוס (YFP) ממוצע עוצמת הקרינה (MFI) של CFP + תאים מתואמים עם ביטוי VC-PDE4D3. שינוי הקיפול של שניהם MFI YFP מCFP + תאים הוא להתוות יחד עם שינוי קיפול CFP MFI מתאי חיים שאינם מצטברים. רמות ביטוי יחסיות של VC-PDE4D3 נקבעו על ידי ניתוח J תמונה של כתם מערבי גם הם זממו. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. ניתוח של האינטראקציה BiFC AKAP-LBC עם PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT באמצעות cytometry זרימה. א) אינטראקציה AKAP-LBC-PDE4D3-בר הייתה לכמת ידי ונוס-MFI המנורמל לביטוי חלבון (AKAP-LBC, PDE4D3 ברים ובקרת טעינת α-טובולין). Difference באות BiFC נבדקו על ידי ניתוח אחד בדרך שונה (ANOVA) עמ 'ערך <0.01 נחשב מאוד משמעותיות (**) ואילו AP ערך> 0.05 לא נחשב. ב') אות משמעותית (NS) נציג BiFC בtransfected HEK 293T תאים. תאי 293T HEK היו שיתוף transfected עם CFP, VN-AKAP-LBC ומבני VC-PDE4D3 (-FL,-UCR1, UCR2-+ חתול). CFP + תאי חיים שאינם מצטברים היו מגודרות, וקרינת BiFC מוצגת בYFP לעומת קדימה עלילת נקודת פיזור כפולה. C) כתם מערבי מצביע על ביטוי מקביל PDE4D3-ברי AKAP-LBC ו. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. אישור לניתוח cytometry זרימה על ידי שיתוף immunoprecipitation. תאי 293T HEK היו שיתוף transfectedלביטוי של מבני GFP-PDE4D3 (-FL,-UCR1, UCR2-+ CAT) V5-AKAP-LBC ו. 48 שעות לאחר transfection, AKAP-LBC היה immunoprecipitated באמצעות חרוזים V5-agarose. עקידת PDE4D3-FL, UCR1 וUCR2 + חתול היה זוהה על ידי-SDS וכתם מערבי באמצעות נוגדן ראשוני אנטי-GFP. קלט PDE4D3 המקביל המשמש לimmunoprecipitation מוצג גם, מה שמצביע ביטוי דומה לכל PDE4D3-הברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC הוא שיטה פשוטה ורגישה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. שיטה זו אינה יכולה לשמש כדי לזהות חלבונים אינטראקציות חדשות, לעומת זאת, זה נוח במיוחד כדי לאשר את חלבונים האינטראקציה בתוך תאים וללמוד מאפיינים תפקודיים; כגון לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים, מיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים, ו להקרנה של מולקולות קטנות / פפטידים שיכולים לווסת את האינטראקציה בין חלבונים. בגלל שברי VN והון הסיכון הם לא פלורסנט, הקרינה רקע היא נמוכה, ובכך מסייע לרגישות של assay זה. הוא זקוק לזמן כדי להבשיל / לייצב את האינטראקציה VN-חלבון-VC-החלבון, ובכך יש עיכוב ללדמיין את האינטראקציה בין חלבונים, וטיפול אופטימליים בנקודות לכן עשויות צריכים להיקבע באופן אמפירי. צריך גם לציין שאינטראקצית VN-חלבון-VC-חלבון אינה הפיכה, ולכן, לצערנו, ונוס הנוכחי BiFC בונה assay זה אינו מתאים לאקינטיקה דינמית לימוד o של אינטראקציה בין חלבונים.
בקרות נאותות חשובות לניתוח BiFC. שליטה מתאימה שלילית כוללת חלבונים שאינם אינטראקציה או פפטידים שאינם ספציפיים בוקטור BiFC הרלוונטי, או אם זה אפשרי, מוטציה שמשבשת את האינטראקציה בין חלבונים. וקטור BiFC ריק הוא לא שליטה טובה כפי שהוא גורם לקרינת רקע גבוהה שאינם ספציפית. אם BiFC לא נצפה בשני חלבוני אינטראקציה, יש לנתח ביטוי. כמו כן, אות BiFC עשויה להשתנות בהתאם לאתרי האינטראקציה בין חלבונים. יצוין כי אפנון המרחבי של VN וVC אינטראקציה עשוי להשפיע גם על עוצמת הקרינה, ולכן זה חשוב בתחילה לבצע את ניסויי BiFC באמצעות שניהם בונה ביטוי N-מסוף VN / VC C-מסוף ו. לדוגמה, BiFC לא יכול להתרחש אם בלוקים אינטראקציה בין חלבונים מחדש איגוד את שברי ונוס. לכן, שילובים מרובים של VN וVC בונה שאולד להיבדק (כלומר שניהם fusions חלבון מסוף N C ו).
עוצמת הקרינה של BiFC היא פרופורציונלית לכוחה של אינטראקציה בין חלבונים, בעוצמה גבוהה המעידה BiFC אינטראקציה חזקה יותר ועוצמת הקרינה נמוכה יותר מצביעה על אינטראקציה חלשה יותר. BiFC MFI משמש אפוא כאינדיקציה לאינטראקציה בין חלבונים. לניתוח מדויק של אינטראקציה בין חלבונים על ידי BiFC, זה מאוד חשוב שניתוח הכתם מערבי מבוצע כדי להבטיח ביטוי שווה של מבנים שונים, וכי אין פירוק חלבונים מתרחש, מה שעלול להפריע לניתוח נכון. Lysate מהדגימות אותו ולכן הוא העדיף לניתוח כתם מערבי כדי לקבוע ביטוי דומה חלבון לכל הדגימות נותחו. בנוסף, הוא קריטי כדי לקבוע כמות מתאימה של פלסמידים לtransfection כדי להבטיח ביטוי ואינטראקציה של חלבונים ליניארי, ובין טווח זה, את האינטראקציה של חלבון קושר wiעוצמת הקרינה ה אות BiFC.
כמות נמוכה של CFP פלסמיד משמשת כסמן לtransfection המוצלחת, תאים חיוביים כל כך CFP רק נותחו כאן. חלבון פלואורסצנטי שונה, כגון RFP יכול לשמש כדי למזער את לדמם דרך בין הצבעים 11. עבור cytometry זרימה, תאים חיוביים יחידים דרושים כדי להיכלל בפיצוי. במידת האפשר, לפחות 10,000 תאים חיוביים CFP נספרים כדי להבטיח גודל מדגם טוב.
לסיכום, כאן אנו מראים כי המתודולוגיה BiFC צימוד עם ניתוח תזרים cytometric יכולה לשמש כמדד טוב לחלבוני אינטראקציה בתוך תאים. הניתוח מסורתי של BiFC באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence זמן רב, וגודל מדגם הוא נמוך בהרבה מזה המקבילה לזרום ניתוח cytometric. לפיכך, צימוד cytometry זרימה עם BiFC עשוי להיות יתרון לניתוח של אינטראקציה בין חלבונים כאשר יעילות transfection היא נמוכה. בזהדו"ח, שנצלנו Cytometry BiFC-Flow למפות את אתרי האינטראקציה בPDE4D3 לקשירת AKAP-LBC. טכניקה זו גם יכולה להיות מורחבת למסך למולקולות או פפטידים שעלולים לשבש או לשפר את האינטראקציה בין חלבונים, לתרופת 12 גילוי. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד אירועים פיסיולוגיים מסוימים, כמו הפנמת יגנד-Induced של 13 של GPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים למעבדת O'Bryan בUIC להערכה ניסויית ביקורתית ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט 11SDG5230003 למרכז GKC והלאומי לקידום מדע Translational - מרכז UIC למדעים קליניים translational גרנט UL1TR000050.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
