二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法
Summary
二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析は、タンパク質 – タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量方法を提供するものである。この方法は、マッピング·タンパク質結合部位およびタンパク質 – タンパク質相互作用を調節する因子をスクリーニングするために適用することができる。
Abstract
細胞内のタンパク質 – タンパク質相互作用を研究するための方法のうち、二分子蛍光相補（BIFC）は比較的簡単と小文字が区別されます。 BIFCは、蛍光タンパク質の二非蛍光フラグメント（金星、黄色蛍光タンパク質の変異体は、ここで使用されている）を使用した蛍光の生産に基づいている。非蛍光金星断片（VNとVC）が原因でVN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3相互作用と機能的蛍光タンパク質の形成に蛍光降伏、2相互作用するタンパク質（この場合は、AKAP-LBC及びPDE4D3）に融合されている細胞内。
BIFCは、タンパク質複合体の細胞内局在と蛍光強度に基づいてタンパク質相互作用の強さについての情報を提供します。しかしながら、タンパク質 – タンパク質相互作用の強さを定量化するために顕微鏡を用いBIFC解析には時間がかかり、タンパク質発現と相互作用における不均一性に起因幾分主観的である。フローサイトメトリーを結合することによってBIFC方法論分析は、蛍光BIFCタンパク質 – タンパク質相互作用信号は、正確に短時間で細胞の大量のために測定することができる。ここでは、AKAP-LBCとの相互作用に必要とされるPDE4D3でマップ地域にこの方法論の適用を実証する。このハイスループット法は、タンパク質 – タンパク質相互作用を調節する因子のスクリーニングに適用することができる。
Introduction
65万タンパク質-タンパク質相互作用は、正常な細胞機能1,2を維持するために重要な役割を果たし、ヒトインタラクに存在することが推定される。他にも共免疫沈降（共IP）、細胞溶解物からのタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための金本位、いくつかのタンパク質断片相補アッセイ（PCA）は、セル3の内部タンパク質-タンパク質相互作用の検出感度を向上させるために開発されてきた。技術はフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）、および二分子蛍光相補（BIFC）4,5が含まれています。それぞれの潜在的な相互作用タンパク質パートナー（この例では、我々はAKAP-LBC及びPDE4D3を使用してください）に融合されています。BIFCは蛍光タンパク質（YFP変異体ここでは金星を使用します）の二つの断片の促進協会に基づいています。 fで可視化することができる機能的な蛍光の細胞結果内部の関心の二つのタンパク質の相互作用ライブまたは固定された細胞の6,7,8を使用luorescence顕微鏡。他のPCAに比べ、BIFCは、生きた細胞で細胞内局在を検討する可能性のある、高感度かつ少ない技術的に困難である。この技術の主な欠点は、しかしながら、一度形成された蛍光タンパク質複合体が逆転することができないことである。したがって、動的なタンパク質 – タンパク質相互作用を研究するための優れた方法ではない。本稿では、金星の蛍光強度をモニターすることによってAKAP-LBCでPDE4D3の相互作用部位をマッピングするBIFC使用。 （自動ハイスループット機械を用いて行われていない場合）、時間がかかり、労働集約的である蛍光顕微鏡を用いた従来の分析と比較して、フローサイトメトリーは、短時間9上で不均一な集団における細胞の数千の簡単な定量的な分析を提供10。ここで、フローサイトメトリー分析 – BIFCおよび共IP伝統的なサイドバイサイドの比較を行うことにより、我々は、2メートル示すethodsは、比較可能なデータを提供するが、フローサイトメトリー分析は、BIFC少ない時間がかかり、目的の細胞に限られている場合に、より有用であり得る少ない材料を使用する。
Protocol
Representative Results
Discussion
BIFCは、タンパク質 – タンパク質相互作用を研究するためのシンプルかつ高感度な方法である。この方法は、新しいタンパク質 – タンパク質相互作用を識別するために使用することができない、しかし、それは細胞内タンパク質 – タンパク質相互作用を確認することと機能的特性を研究するために特に便利である等のタンパク質複合体の細胞内局在として、タンパク質 – タンパク質相互作用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、重要な実験的な評価と議論のためUICでオブライアンラボに感謝します。臨床およびトランスレーショナルサイエンスグラントUL1TR000050ためのUICセンター – この作品は、トランスレーショナル研究を進めるためのGKCとナショナルセンターに米国心臓協会グラント11SDG5230003によってサポートされていました。
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
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