Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study
Summary
Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.
Abstract
Unter den Verfahren zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen zu studieren, ist Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC) relativ einfach und empfindlich. BiFC ist auf die Erzeugung von Fluoreszenz mit zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (Venus, gelb fluoreszierendes Protein Variante wird hier verwendet werden). Nicht fluoreszierende Venus Fragmente (VN und VC) mit zwei interagierende Proteine (in diesem Fall AKAP-Lbc und PDE4D3) fusioniert, wodurch Fluoreszenz aufgrund VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 Interaktion und der Bildung eines funktionellen fluoreszierendes Protein innerhalb der Zellen.
BiFC liefert Informationen über die subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen und der Stärke der Protein-Wechselwirkungen auf Fluoreszenzintensität. Allerdings ist BiFC Analyse unter Verwendung der Mikroskopie, die Stärke der Protein-Protein-Interaktion zu quantifizieren zeitaufwendig und etwas subjektiv durch Heterogenität in der Proteinexpression und Interaktion. Durch die Kopplung durchflusszytometrischenAnalyse BiFC Methodik kann die fluoreszierende BiFC Protein-Protein-Wechselwirkung Signal genau für eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeit gemessen werden. Hier zeigen wir eine Anwendung dieser Methode auf Regionen in PDE4D3, die für die Interaktion mit AKAP-Lbc erforderlich sind, abzubilden. Dieser hohe Durchsatz-Screening Methode können Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.
Introduction
650.000 Protein-Protein-Wechselwirkungen werden geschätzt, um in den menschlichen interactome existieren, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen 1,2. Neben Co-Immunopräzipitation (Co-IP), der Goldstandard Protein-Protein-Interaktion von Zelllysat studieren, mehrere Proteinfragments Komplementierungsassays (PCA) wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit bei der Erkennung von Protein-Protein-Interaktion innerhalb der Zellen 3 verbessern. Techniken umfassen Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) und Fluoreszenz-Komplementation Bimolekulare (BiFC) 4,5. , Die jeweils zu einem potenziellen Partner interagierende Protein (in diesem Beispiel verwenden wir AKAP-Lbc und PDE4D3) verschmolzen sind; BiFC auf dem erleichtert Assoziation von zwei Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (YFP eine Variante hier benutzen wir Venus) basiert. Wechselwirkung der beiden Proteine von Interesse in den Zellen führt zu Funktionsstörungen Fluoreszenz, die sichtbar gemacht werden kann fluorescence Mikroskopie mit entweder live oder fixierten Zellen 6,7,8. Im Vergleich zu anderen PKA ist BiFC empfindlicher und weniger technisch anspruchsvoll, mit Potenzial, die zelluläre Lokalisation in lebenden Zellen zu studieren. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß einmal gebildet, das fluoreszierende Protein-Komplex kann nicht rückgängig gemacht werden. Daher ist es nicht eine gute Methode, um dynamische Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. In diesem Papier, verwenden wir, um die Interaktion BiFC Websites von PDE4D3 mit AKAP-Lbc Karte durch die Überwachung der Fluoreszenz-Intensitäten der Venus. Im Vergleich zu herkömmlichen Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie, die zeitaufwendig und arbeitsintensiv (falls nicht mit automatisierten Hochdurchsatz-Maschinen durchgeführt) ist, bietet die Durchflusszytometrie eine einfache quantitative Analyse von Tausenden von Zellen in einer heterogenen Population über eine kurze Zeit 9, 10. Hier wird durch die Durchführung einer Side-by-Side-Vergleich der Durchflusszytometrie-Analyse und BiFC traditionellen Ko-IP, zeigen wir, dass die beiden methoden vergleichbare Daten ist jedoch durchflusszytometrische Analyse BiFC weniger zeitaufwendig und benötigt weniger Material, das nützlicher sein kann, wenn die Zellen von Interesse sind begrenzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC ist eine einfache und sensitive Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um neue Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren, ist es jedoch besonders günstig, um Protein-Protein-Wechselwirkung innerhalb der Zellen zu bestätigen und funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, wie subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen, die Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkung Sites und für das Screening von kleinen Molekülen / Peptide, die Modulation vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der O'Bryan Labor an UIC für kritische experimentelle Evaluation und Diskussion. UIC Zentrum für Klinische und Translational Sciences Zuschuss UL1TR000050 – Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Zuschuss 11SDG5230003 zu GKC und National Center for Advancing Translationale Wissenschaft unterstützt.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
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