Summary
Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.
Abstract
Hücrelerin içinde protein-protein etkileşimleri incelemek için yöntemler arasında, Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) oldukça basit ve hassastır. BiFC bir floresan protein olmayan iki floresan parçalarının (venüs, bir sarı floresan protein varyantı, burada kullanılan) kullanılarak floresan üretimi esas alınmaktadır. Floresan olmayan Venüs parçaları (VN ve VC) bağlı VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 etkileşim ve fonksiyonel bir floresan protein oluşumu için floresan verecek şekilde iki etkileşen proteinleri (bu durumda, AKAP-Lbc ve PDE4D3) kaynaşmıştır hücrelerin içinde.
BiFC protein komplekslerinin hücre altı konumlanması ve floresan yoğunluğuna dayalı protein etkileşimleri gücü hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, protein-protein etkileşimi kuvvetini ölçmek için mikroskopi kullanılarak BiFC analizi zaman alıcı ve protein ekspresyonu ve etkileşim içinde heterojenite nedeniyle biraz görecelidir. Sitometrik akış kaplinBiFC metodolojisi ile analizi, floresan BiFC protein-protein etkileşimi sinyalini doğru olarak kısa bir süre içinde hücrelerin büyük bir miktar için ölçülebilir. Burada, AKAP-Lbc ile etkileşim için gerekli olan PDE4D3 bölgeleri eşleştirmek için bu metodolojinin bir uygulama göstermektedir. Bu yüksek kapasiteli yöntem, protein-protein etkileşimleri düzenleyen tarama faktörlere uygulanabilir.
Introduction
650.000 protein-protein etkileşimleri, normal hücre fonksiyonlarını 1,2 korunmasında kritik rol oynayan, insan interactome var olduğu tahmin edilmektedir. Ortak immunoprecipitation yanı sıra (eş-IP), altın standart (PCA) hücreleri 3 içinde protein-protein etkileşimleri tespit duyarlılığını artırmak için geliştirilmiştir, hücre lizat birkaç protein parçası tamamlama deneyleri protein-protein etkileşimleri incelemek için. Teknikleri Förster rezonans enerji transferi (FRET), Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (BRET) ve Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) 4,5 içerir. Her potansiyel bir etkileşim protein ortağı (bu örnekte biz AKAP-Lbc ve PDE4D3 kullanın) sigortalarla, BiFC bir floresan protein iki parça (bir YFP varyant burada Venüs kullanın) kolaylaştırdı dernek dayanmaktadır. F tarafından görüntülenmiştir olabilir fonksiyonel floresan hücreleri sonuçları içinde ilgi iki protein, etkileşimiCanlı veya sabit hücreleri 6,7,8 kullanarak luorescence mikroskobu. Diğer PCA ile karşılaştırıldığında, BiFC canlı hücrelerde hücresel yerleşimi çalışma potansiyeli olan, duyarlı ve daha az teknik zordur. Bu tekniğin büyük bir dezavantajı, ancak bir kere oluştuktan sonra, floresan protein kompleksi geri alınamaz olmasıdır. Bu nedenle dinamik protein-protein etkileşimleri incelemek için iyi bir yöntem değildir. Bu yazıda, Venüs floresan yoğunlukları izleyerek AKAP-Lbc ile PDE4D3 etkileşimi siteleri eşleştirmek için BiFC kullanın. (Otomatik yüksek kapasiteli makineler kullanılarak gerçekleştirilmiştir değilse) zaman alıcı ve emek-yoğun floresan mikroskobu kullanarak geleneksel analizi ile karşılaştırıldığında, akım sitometri, kısa bir süre 9 üzerinde heterojen nüfus hücrelerin binlerce basit bir kantitatif analiz sağlar 10. Burada, akış sitometrik-BiFC analizi ve ortak IP geleneksel bir yan-yana karşılaştırma yaparak, biz göstermek bu iki methods karşılaştırılabilir veri sağlamak, ancak, akış sitometrik BiFC analizi zaman alıcı az ve ilgi hücreleri sınırlı zaman daha yararlı olabilir daha az malzeme kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre transfeksiyonu
- Transfeksiyon önce plaka hücreleri gün, immünofloresan için daha az hücre kaplama.
- Immunofloresan için: 6-plaka, kat cam kapak fişleri içinde (1 de başına) en az 4 saat süreyle 37 ° C de% 0.02 jelatin ile, orta ile bir kez yıkayın ve her bir kuyu için, plaka 1 x 10 5 HEK 293T 2 ml tam Hücreler büyüme ortamı içinde [Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) artı% 10 FBS].
- Akış sitometrik ve Western blot analizi için: levha 1,2 5 HEK 293T hücre / oyuk 6-plaka (24-çukurlu plaka başına 0,5 ml tam büyüme ortamı içinde 0.3 x 10 5 HEK 293T hücreleri içinde 2 ml tam büyüme ortamı x 10 .)
- Imalatçının protokolüne göre transfeksiyon için DNA hazırlayın: Effectene (Qiagen) immünofloresan için kullanılır. Transit-LT1 (Mirus) akım sitometrik ve Western Blot analizleri için kullanılır. Kullanılan DNA miktarı aşağıda listelenmiştir.
Transfeksiyon Effectene (6-de) kullanılarak:24 oyuklu plaka (ng) 6-plaka (ng) CFP-vektör 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1.000 VC N-PDE4D3-FL (tam boy PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-UCR1 (UCR1 etki alanı içeren bir PDE4D3 N-terminal parçası) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (UCR2 ve katalitik etki içeren bir PDE4D3 C-terminal parçası) 100 - Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca belirtilen plazmid DNA + miktarı 4 ul artırıcı 100 ul tampon EM için, karışım, ve inkübe ekleyin.
- 10 dakika boyunca 5 ul Effectene, karışım, ve inkübe eklemeoda sıcaklığı. Ekle hücrelere bırak-bilge.
- Bir steril tüp içine Opti-MEM I serumsuz ortamda 250 μl/50 ul plasmid DNA Belirtilen miktarlarda ekleyin.
- Seyreltilmiş DNA karışıma Transit-LT1 reaktif ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetle. (Transit-LT1 Reaktif: DNA oranı DNA 1 mikrogram başına Transit-LT1 reaktif 3 ul).
- Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir ve hücreleri damla damla ilave edin.
2. Sitometrisi, Western Blot, ve İmmünofloresan için Hücre Hazırlık
- 24 saat sonrası transfeksiyon, hücreler hasat öncesi Epifloresans mikroskop altında floresan kontrol edin.
- Akım sitometri analizi için hücre hazırlama:
- 24-well/6-well plakaları ile, 0.5 ml / 2 ml buz gibi soğuk PBS ile bir hücreleri yıkayın.
- 50 μl/250 ul% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak.
- 200 ul / 1 ml DMEM ortamı ile nötralize tripsin.
- Co5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile llect 250 ul hücreleri (her ikisi de 24 oyuklu ve 6-delikli plaka için), Western blot analizi için geriye kalan hücreler (1 mi) kullanın.
- 250 ul FACS buffer içinde yeniden süspanse hücreleri [PBS +% 0.5 (w / v) BSA, 2 mM EDTA +] akış sitometri analizi için buz üzerinde depolar. Akım sitometri analizi hemen olmayacak eğer hücreler (PBS içinde)% 1 paraformaldehid sabitlenebilir.
- Western Blot analizi için hücre hazırlama: akım sitometri analizi için hücre hazırlama paralel olarak gerçekleştirdi.
- 2 ml buz gibi soğuk PBS ile yıkayın 1x hücreleri, hücre parçalama tamponu 100 ul [10 mM sodyum fosfat tamponu, pH 6.95, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA,% 1 Triton X-100] eklenerek hücre parçalandığı .
- 4 de 21.000 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücre lizatı toplamak ° C
- , Bradford protein testi ile protein konsantrasyonu ölçmek SDS-PAGE için şerit başına protein eşit miktarda yük ve immün için nitroselüloz transfer.
- Immünofloresan için hücre hazırlama.
- 2 ml PBS ile durulayın 3x hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehid (PBS) 1 ml hücre düzeltmek için, daha sonra 5 dakika boyunca 2 ml PBS ile 3 kez yıka.
- Montaj orta kullanarak, bir cam slayt üzerinde kayma kapağı monte edin. Gerekirse oje kullanarak lamel kenarları mühür.
- Muayene ° C önce 4 de slaytlar saklayın.
3. Akım Sitometri ve İmmünofloresan Mikroskopi
- Flow sitometri bir Beckman Coulter Mavi 488 nm ile donatılmış ADP, 405 nm ve 642 nm katı hal lazerleri kullanılarak yapılır. Zirve yazılım satın alma ve analiz için kullanılır.
- Standart boncuklar kullanarak akış sitometresinin kalibre.
- Yolluk canlı hücre popülasyonu için doğrusal bir ölçekte Arsa İleri dağılım (FSC) / yana dağılım (SSC).
- Yolluk olmayan toplu canlı hücre popülasyonu için arsa gerilim / FSC darbe genişliği.
- Arsa count/FL6 (OBP fluorescencyolluk olmayan toplu canlı CFP-pozitif hücreler için bir günlük ölçekte e, 405 nm).
- BiFC yoğunluğu için bir günlük ölçekte Arsa count/FL1 (YFP floresan, 488 nm).
- FSC, SSC, FL1 ve FL6 fotoğraf çoğaltıcı tüp (PMT) Her bir sinyal için eşik ayarlamak için voltaj ayarlamak, YFP-CFP-çift negatif örnekleri çalıştırın.
- Run (hem YFP + ve CFP +) için örnekler gelecek off-line tazminat pozitif ve tek
- Analiz için en azından 10,000 kapılı olayları (olmayan toplanan canlı CFP + hücreleri) elde edin.
- . İmmünofloresan mikroskobu bir Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop Not kullanılarak yapılır: tüm ayarlar arasında tutarlı (örneğin, zum, iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, çerçeve boyutu, tarama hızı, tarama ortalama ve lazer güç olarak) tutmak önemlidir tüm verilerin uygun bir karşılaştırma için örnekler.
4. Veri Analizi (Summit Yazılımı kullanarak Yapılan)
- Acquisit için olana benzer bir analiz protokolü ayarlamauygun yolluk ile iyon:
Canlı hücreler için FSC / SSC nokta arsa Gate 1.
Olmayan toplu canlı hücreler için Gate 1 FSC / darbe genişliği Kapısı 2.
Olmayan toplu OBP + canlı hücreler için Gate 3 sayısı / CFP Gate 3. - YFP ve YFP + ve OBP + tek pozitif hücreleri kullanarak OBP sinyal telafi.
- CFP / YFP pozitif hücreler için yeniden belirlemek kesme hatları.
- İhracat YFP CFP floresan yoğunluğu (MFI) + veri komplo için Excel'e hücreler anlamına gelir.
- AKAP-Lbc, PDE4D3 ifade seviyelerine YFP MFI Normale ve Western blot tarafından belirlenen, α-tubulin yükleme kontrolü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AKAP-Lbc ve PDE4D3 yapıları (Şekil 1B) sırasıyla, VN ve VC parçaları erimiş edildi. AKAP-Lbc ve fonksiyonel YFP floresan (Şekil 1A) içinde PDE4D3 sonuç etkileşimi. Burada PDE4D3 içinde haritası AKAP-Lbc bağlayıcı sitelere BiFC yöntemini kullanın. Memba korunmuş bölge 1 (UCR1), yukarı korunmuş bölge 2 (UCR2) ve katalitik bölgesi (CAT) PDE4D3 bağlama sitesi tarama için kullanılan bu nedenle, tam boy (FL), UCR1 ve UCR2 artı CAT, PDE4 aile proteinler arasında korunur AKAP-Lbc için. Farklı yoğunluk (Şekil 1C) VN-AKAP-Lbc ve floresan HEK 293T hücreleri içindeki VC-PDE4D3-fragmanlarının ifadesi. BiFC UCR1 ve UCR2 hem + CAT AKAP-Lbc ile PDE4D3 etkileşimi katkıda gösterir. AKAP-Lbc-UCR1 etkileşim sonucunda daha fazla floresan, AKAP-Lbc-UCR2 + CAT göre, PDE-UCR1 PDE-UCR2 + CAT daha iyi AKAP-Lbc bağlar gösterir.
(Şekil 2A) ve hücre agrega SSC vs Darbe Genişliği çift nokta (Şekil 2B) kullanılarak alınmadı kullanarak değerlendirmeye alınmadı. Tek başına BiFC sinyal ya da OBP ifade ile hücreleri u vardısed tazminat belirlemek ve floresan (Şekil 2C-2F) olmayan hücreler için-kesmek. CFP BiFC vektör yapıları ve CFP ifade başarılı transfeksiyon belirtmek için pozitif bir marker olarak kullanılmıştır ile ko-transfekte edilmiştir. Sadece CFP + hücreleri BiFC floresan ölçümü için kullanılmıştır. CFP sinyali (Şekil 3B) değişmedi PDE4D3 artan miktarda transfeksiyonu, artan Venüs (YFP) BiFC sinyali (Şekil 3A) ile sonuçlanmıştır. VN-AKAP-Lbc ve VC-PDE4D3 artan miktarda ifade Western Blot (Şekil 3C) ile teyit edilmiştir. Genel olarak, artan PDE ifade PDE ifade seviyeleri (Şekil 3B) ile bağıntılı BiFC floresan doğrusal bir artış ile sonuçlanmıştır. Bu sonuçlar BiFC ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ölçerek AKAP-Lbc-PDE4D3 etkileşimi ölçmek için akım sitometri kullanımı onaylanmıştır. Bu nedenle PDE4D içinde haritası AKAP-Lbc bağlayıcı siteleri için bu yöntem kullanılan3 VN-AKAP-Lbc ve VC-PDE4D3 yapıları kullanarak. VC-PDE4D3-FL ve VC-PDE4D3-UCR1 (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında, Şekil 1C, VN-AKAP-Lbc ve VC-PDE4D3-UCR2 ifadesinde gözlemlerimiz ile tutarlıdır + CAT alt BiFC sinyali ile sonuçlanmıştır. Benzer Protein ifadesi, akım örnekleri (Şekil 4C) gözlendi ve floresan AKAP-Lbc, PDE4D3 ve α-tubulin bağıl ifade seviyelerinin normalize ortalama edildi. Bu nedenle, normalize BiFC MFI AKAP-Lbc-PDE4D3-FL ve AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR1 arasındaki floresan açısından bir fark olduğunu gösterir, ancak AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR2 + CAT etkileşim (Şekil 4A için çok daha düşük sinyal .) Bu sonuçlar AKAP-Lbc etkileşim PDE4D3 birden fazla bölge olduğunu göstermektedir, ve PDE4D3-UCR1 AKAP-Lbc ile etkileşim birincil bölge olduğunu. Bu sonuç, aynı zamanda, protein-protein etkileşimi için altın standardı (Şekil 5), CO-IP ile teyit edilmiştir.
Şekil 1. Immünofloresan mikroskobu ile AKAP-Lbc-PDE4D3-fragmanı etkileşim BiFC analizi. Bimoleküler Floresan tamamlama A) şematik temsilcisi (BiFC). Venüs parçaları, VN ve VC sırasıyla AKAP-Lbc ve PDE4D3 için kaynaşmıştır. Fonksiyonel YFP floresan AKAP-Lbc-PDE4D3 etkileşim sonuçları. Haritalama için kullanılan PDE4D3 yapıları B) şematik diyagramı. C) transfekte HEK 293T hücreleri Temsilcisi BiFC sinyalleri. Hücreler VN-AKAP-Lbc ve BiFC analizi, VC-PDE4D3 yapıları (-FL-UCR1,-UCR2 + CAT) ile ko-transfekte edilmiştir. CFP-Vektör, aynı zamanda, bir transfeksiyon işaretleyici olarak birlikte transfekte edildi. 24 saat post-transfeksiyon, hücreler görüntüleme için tespit edildi. Yeşil ve OBP birleştirilmiş rakamlar Pseudocolor kırmızı gösterilir de BiFC sinyal gösterilir. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Kapıları ve FACS analizi için tazminat belirlenmesi. Tazminat. D önce OBP (OBP + hücreler) ifade A) FSC vs SSC nokta kapısı canlı hücrelere arsa ve enkaz ve ölü hücreleri hariç. B) Side Scatter vs darbe genişliği nokta arsa kapısı tek hücrelere ve agrega dahil değildir. C) Hücreler YFP tazminat sonra OBP (OBP + hücreleri) ifade) Hücreler. YFP ifade ile hücreler için kesme hat yeniden belirlenmiştir. E) tazminat. F önce BiFC sinyal (YFP + hücreler) ile hücreler) OBP tazminat sonra BiFC sinyal (YFP + hücreleri) hücreleri. CFP ifadeli hücreler için cut-off hattı yeniden belirlenmiştir.target = "_blank"> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. PDE4D3 ifadesinin miktarı değiştirilerek BiFC akım sitometrisi ile AKAP-Lbc-PDE4D3 etkileşim analizi. A) VC-PDE4D3 artan miktarda transfekte OBP + hücrelerin içinde BiFC sinyal arttırıldı. Hücreler CFP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng), ve VC-PDE4D3 artan miktarlarda (2.5 ng 80 ng) ile transfekte edildi. Sigara toplu OBP + canlı hücreleri kapılı ve YFP floresan İleri YFP vs Dağılım çift nokta arsa olarak gösterilir. YFP + hücreler yeşil gösterilmiştir. Gösteren 5 ng, 20 ng ve 80 ng VC-PDE4D3 Temsilcisi verileri. B) canlı hücrelerde OBP floresan tüm örnekleri arasında tutarlı CFP floresan gösteren, OBP vs Forward Scatter çift nokta arsa olarak gösterilir gösterilir. C) Western Blot analizi PDE4D3 expressio artann AKAP-Lbc ve α-tubulin (bir yükleme kontrol olarak kullanılan) tutarlı ifadesi ile. D) Venüs (YFP) CFP floresan yoğunluğu (MFI) ortalama + hücreler VC-PDE4D3 ifade ile ilişkilidir. OBP + hücrelerinden YFP MFI hem de kat değişiklik olmayan toplu canlı hücrelerden OBP MFI kat değişiklik ile birlikte çizilir. Western Blot görüntü J analizi ile belirlenen VC-PDE4D3 nispi ifade seviyeleri de çizilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT Sitometrisi kullanarak AKAP-Lbc etkileşim BiFC analizi. A) AKAP-Lbc-PDE4D3-fragmanı etkileşim protein ekspresyonu (AKAP-Lbc, PDE4D3 parçaları ve yükleme kontrolü α-tubulin) normalize Venüs-MFI ile ölçüldü. DBiFC sinyal ifference tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile incelendi bir p 0.05 transfekte HEK 293T değil önemli (ns). B) Temsilcisi BiFC sinyal olarak kabul edilir <p değeri ise 0.01 (**) çok önemli bir kabul edilir> hücreler. HEK 293T hücreleri CFP VN-AKAP-Lbc ve VC-PDE4D3 yapıları (-FL-UCR1,-UCR2 + CAT) ile ko-transfekte edilmiştir. Sigara toplu canlı OBP + hücreleri kapılı vardı, ve BiFC floresan İleri YFP vs içinde Dağılım çift nokta arsa gösterilmiştir. C) AKAP-Lbc ve PDE4D3-parçaları karşılaştırılabilir ifade gösteren Western Blot. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Ko-immünopresipitasyon ile Akış sitometrisi analizi teyidi. HEK 293T hücrelerine ko-transfekte edilmiştirV5-AKAP-Lbc ve GFP-PDE4D3 yapıları (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT) ifadesi için. 48 saat sonrası transfeksiyon, AKAP-Lbc V5-agaroz boncuk kullanılarak immunoprecipitated edildi. PDE4D3-FL Bağlama, UCR1 ve UCR2 + CAT anti-GFP primer antikor kullanarak SDS-PAGE ve Western Blot tarafından tespit edildi. İmmünopresipitasyon için kullanılan karşılık gelen PDE4D3 girişi de tüm PDE4D3-parçaları için benzer bir ekspresyon gösteren gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC protein-protein etkileşimleri incelemek için basit ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, yeni bir protein-protein etkileşimleri tanımlamak için kullanılamaz, ancak, bu hücre içinde, protein-protein etkileşimi teyit etmek için ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için özellikle uygundur, örneğin protein-protein etkileşimi siteleri eşleme protein kompleksleri hücre altı konumlanması olarak, ve protein-protein etkileşimi modüle eden küçük moleküller / peptitlerin taranması için. VN ve VC parçaları floresan olmayan olduğu için, arka plan flüoresan nedenle bu tahlilin hassasiyetini yardım düşüktür. Zaman VN-protein-VC-protein etkileşimi olgun / dengelemek için gereklidir, böylece protein-protein etkileşimi görselleştirmek için olup, gecikme ve optimum zaman noktaları, ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir. Bu VN-protein-VC-protein etkileşimi geri olmadığı da not edilmelidir, bu nedenle ne yazık ki mevcut Venüs BiFC ile, bu tayinde t uygun değildir inşaProtein-protein etkileşimleri o dinamik çalışma kinetiği.
Uygun kontrol BiFC analizi için önemlidir. Uygun bir negatif kontrol etkileşmeyen proteinler veya ilgili BiFC vektör spesifik olmayan peptitler, veya eğer mümkünse, protein-protein etkileşimi bozan bir mutant içerir. Bu spesifik olmayan yüksek eşiğe neden olarak boş BiFC vektör iyi bir kontrol değildir. BiFC iki etkileşiminde olan proteinleri gözlenen değilse, ifade analiz edilmelidir. Ayrıca, sinyal BiFC protein-protein etkileşimi sitelere bağlı olarak değişebilir. Bu VN ve VC etkileşim mekansal modülasyon da floresans yoğunluğunu etkileyebilir dikkat edilmelidir, bu nedenle, C-terminal ve N-terminal VN / VC ekspresyon yapıları kullanarak hem BiFC deneylerini gerçekleştirmek için ilk olarak önemlidir. Örneğin, BiFC, protein-protein etkileşimi engeller Venüs parçalarının yeniden ilişki gerçekleşmeyebilir. Bu nedenle, VN ve VC çoklu kombinasyonlar omuz oluşturur(C ve N-terminal füzyon proteini hem gibi) test edilecek d.
BiFC floresan yoğunluğu daha güçlü etkileşim ve zayıf etkileşim düşündüren düşük bir floresan gösteren yüksek BiFC yoğunluğu ile, protein-protein etkileşim gücü ile orantılıdır. BiFC MFI bu sayede, protein-protein etkileşimi için gösterge olarak kullanılır. BiFC protein-protein etkileşimleri hassas analizi için, Western Blot analizi hiçbir protein yıkımı doğru analiz engel olabilir ki, meydana gelen farklı yapıları eşit ifade sağlamak için yapılır ve olması çok önemlidir. Aynı örneklerden Lizat nedenle, analiz edilen tüm örnekler için benzer protein ekspresyonu belirlemek için Western blot analizi için tercih edilir. Ayrıca, bu doğrusal ekspresyonu ve protein etkileşimi sağlamak için transfeksiyon için plazmid uygun bir miktarını belirlemek için kritiktir ve bu dizi arasında, protein etkileşimi wi korelasyonBiFC sinyal inci floresan.
Plazmid OBP Düşük miktarda bu yüzden sadece OBP pozitif hücreler burada analiz edildi, başarılı transfeksiyon için bir belirteç olarak kullanılır. Bu tür TTT gibi farklı bir floresan protein, akmalarını en aza indirmek için bir renk 11 arasında kullanılabilir. Akış sitometrisi, tekli pozitif hücreler telafisi için dahil edilmesi gereklidir. Mümkünse, en az 10.000 CFP pozitif hücrelerin iyi bir örnek boyutu sağlamak için sayılır.
Özetle, burada akış sitometrik analizi ile bağlantı BiFC metodoloji hücre içinde protein-protein etkileşim iyi bir göstergesi olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Immünofloresan mikroskop kullanılarak BiFC geleneksel analizi zaman alıcı ve örneklem büyüklüğü sitometri akmaya da karşılaştırma çok daha düşüktür. Transfeksiyon verimi düşük olduğunda Böylece, BiFC ile akış sitometrisi birleştirme protein-protein etkileşimi analizi için avantajlı olabilir. BuRapor, biz AKAP-Lbc bağlama için PDE4D3 içinde etkileşim siteleri eşleştirmek için BiFC-Sitometrisi yararlandı. Bu teknik aynı zamanda moleküller veya ilaç keşfi 12, protein-protein etkileşimi bozabilir veya artırabilir peptidler için ekrana genişletilebilir. Bu yöntem, aynı zamanda, en GPCR 13. ligand bağlı içselleştirme gibi çeşitli fizyolojik olayların incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz eleştirel deneysel değerlendirme ve tartışma için UIC de O'Bryan laboratuvar teşekkür ederim. Klinik ve Translasyonel Bilimler Hibe UL1TR000050 için UIC Merkezi - Bu çalışma Translational Bilim ilerlemek için GKC ve Ulusal Merkezi Amerikan Kalp Derneği Hibe 11SDG5230003 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
