Summary
우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명
Abstract
해양 복족류 연체 동물 군소 californica는 학습과 기억의 연구에서 특히 의미와 신경계 기능의 모델로 오래된 역사를 가지고 있습니다. 이러한 연구의 일반적인 준비는 감각과의 motoneurons은 최소한의 해부 동물에 그대로 유지 또는 개별 감각과의 motoneurons의 기술적 정교한 신경 세포 공동 배양되는 것입니다. 덜 일반적인 명목상 동종 신경의 작은 클러스터 단기 문화에 하나의 세포로 해리되는 격리 된 신경 세포의 준비입니다. 이러한 고립 된 세포 패치 클램프 기법, 이러한 컨덕턴스의 대상으로 변조를 사용하여 이온 전류의 생물 물리학 적 특성에 유용합니다. 이러한 문화를 준비하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 흉막과 구강 신경절 쉽게 식별 글루타메이트 감각 뉴런을 활용하고, 그들의 분리와 최소한의 유지 보수를 설명 I혈청없이 며칠 동안 N 문화.
Introduction
해양 opistobranch 연체 동물, 군소은 수십 년 동안 유용하게 신경 생물학 모델이다. 그것은 가장 이니와 고전적 조건 7, 8의 모델로 알려져 있습니다. 이 모델의 학습과 기억에 대한 연구는 그가 Arvid Carlsson의 폴 Greengard 10과 공유 상에 에릭 칸델 Eric R. Kandel을 위해 2000 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수상했다. 감소 준비에서 전기 녹음과 관련된 연구는, 어떤이 무척추 동물의 신경계의 요소는 신경과 동물에서 해부와 근육이 부착 군소의 개별 뉴런의 역할을 명료 도움이 떠났다. 군소 학습 구성 정확한 분자 메커니즘의 식별하지만, 종종 개별 기증자 동물의 하나 하나를 얻은 또 다른 기술, 장기 감각 신경 세포의 공동 문화와 motoneuron을 고용하고 배양 접시 21 시냅스를 형성 할 수 .
우리는 다른 사람 1, 3, 6, 14, 15, 16 신경이 명목상으로 균일 한 뉴런의 클러스터 해리 단기 문화를 만들기 위해 장기 실험에서뿐만 아니라 자신의 인내로이 모델에서 타겟팅 할 수 있습니다 발견되는 용이성을 악용 한 하는 우리는 패치 클램프 구성에서 전압 클램프에서 이온 전류를 공부합니다. 많은 군소 뉴런은 오랫동안 실험 조작을위한 시간을 허용하는 클램핑 패치의 반복 라운드까지 서있다. 이 기술은 같은 복부 신경절의 neurosecretory 가방 세포와 분리 우리가 설명 흉막 및 구강 신경의 감각 신경으로 신경 유용합니다,하지만 매우 큰 뉴런> 60 μm의 같은 L7으로 직경 또는 R2 복부 신경절. 우리는 다른 설명 감각 - motoneuron 공동 배양과는 달리, 우리의 문화에서 군소 혈청을 사용하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 얻은 대부분의 뉴런은 t에 대한 프로세스없이됩니다그는 전체 셀 전압 녹화를 촉진 문화의 첫 48 시간,하지만 그 새싹과 영양분 및 / 또는 성장 인자의 부족으로 사망하기 전에 약 14 일 동안 축삭과 다른 프로세스를 자세히 설명합니다.
이 기술은 구강 및 흉막 신경의 생리적 문서화 지역의 접시 당 50-100 뉴런의 차 문화를 생산하고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 다양한 실험은 동물마다 복제 요구하는 실험에서 단일 세포 생리학의 여러 측면을 연구하는 데 유용합니다. 그것은 일치 처리 및 통제 문화에서 공부하는 혜택을 허용, 왼쪽과 오른쪽 hemiganglia에 표적 세포의 해부학 적 분리에 의한 문화의 일치하는 쌍을 생성합니다.
프로토콜은 구강 신경의 구강 S 클러스터 (BSC) 뉴런, 그리고 흉막 신경절의 흉막 ventrocaudal (PVC) 뉴런을 대상으로합니다. 이러한 세포는 전체 셀 전압 녹음 및 디스플레이 robus에 적절한 사이즈입니다T 글루타메이트 반응. 논의 방법론은 군소 신경계에있는 대부분의 신경에 적합합니다.
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Protocol
1. 세포의 준비
- 1 일에, 무게와 동물을 마취.
- 30 G-1kg 동물의 무게. 등장 MgCl : 1시 1분 해수의 5-10 동물의 볼륨을 마취. 이러한 연결 airstone와 전기 수족관 공기 펌프로 통기와 함께 1 시간 동안 6H 2 0.
- 해부 용품을 준비합니다.
- 같은 패브릭 핀으로 스테인레스 스틸 직선 핀, 깨끗 해부 트레이를 조립합니다. + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 여러 배양 인공 해수를 포함하는 요리 (표 1 및 3 참조 ASW)을 조립
- 준비 저전력 현미경이있다. 깨끗한 절개 악기와 같은 늑골이있는 코와 미세 수술 집게로 준비하고, 정밀하고 큰 수술 가위있다. 사용하기 전에 70 % isopropol 알코올과 악기를 스프레이하고 건조 할 수 있습니다.
- 절개 트레이에 위치 동물입니다.
- 절개 트레이에 위치 동물의 복부 측면 아래로. 핀 동물신체 벽 parapodial 테두리 만 등의 표면을 노출, 꼬리와 머리를 방지하고 성기 홈의 가장자리를 통해
- 실행 속도가 느린 차가운 수돗물 등의 표면을 씻어. 성기 홈을 따라 스퀴즈 병 및 머리의 정상에 70 % isopropol 알코올의 빛 스트림을 적용합니다.
- 초기 절개를합니다.
- 얕은을 자르기에있는 동안 저전력 현미경을 사용하여 (표 2 참조) 성기 홈이 전방 쉘 여백에서 유래 점을 관찰 할 수 빛의 반사, tautly, 늑골 코 집게이 원점의 왼쪽에 조직의 배 홀드 잘 각도 가위로 성기 홈의 오른쪽에 몸을 벽의 부드럽고 평평한 지역을 통해 모든 방법을 구멍입니다.
- 혈 림프는 때때로 그것으로 복부 신경절과 위장을 들고 구멍에서 부어 관찰해야한다.
- 절개를 확장합니다.
- 일을 확장하는 큰 가위를 사용하여전방 rhinophores 사이의 지점에 전자 절개, 낮은 블레이드 위쪽으로 당기면서하면 직감을 새김 눈 방지 할 수 있습니다. 내부 장기를 절개 밖으로 유출 관찰됩니다.
- 신경을 제거합니다.
- 트레이를 옮기고 머리 지역에 현미경을 재조명.
- 깨끗한 포셉 및 미세 가위를 사용하여 한 지점에서 그룹으로 흉막 페달과 대뇌 신경을 제거하는 식도 주위에 반지에 머리 신경절을 형성하는 신경을 절단하는으로 머리 신경절을 제거합니다.
- 식도의 복부 측면을 준수 구강 신경절을 제거합니다.
- 이 신경절에서 4 큰 신경 접속사가 문제를 절단하여 복부 신경절을 제거합니다.
- 관심 신경절을 분리합니다.
- 신경절의 최소 직경과 동일합니다 그 각각의 신경절에 연결 접속사의 길이를 떠나, 떨어져 머리를 신경 트림,이 효소 지체 과다 소화다음 단계에 대한 관심의 세포.
- ASW의 2 헹굼 + 깨끗한 포셉 린스 간 이동 P / S를 통해 각 대상 신경절을 넣어.
- PVC 세포를 대상으로하는 경우, 오른쪽 페달 hemiganglion에 연결된 오른쪽 흉막 hemiganglion을두고 마찬가지로 왼쪽 페달 hemiganglion에 연결된 왼쪽 흉막 hemiganglion을 둡니다.
- 불필요한 신경 및 허용 연구 방법에 따라 동물의 나머지를 버린다.
- 효소 신경을 소화.
- 각 신경절의 경우, 3.75 MG 디스 파제 (dispase), 1 밀리그램 히알루 및 ASW의 ML 당 0.3 g 콜라 유형 XI로 구성된 효소 용액 1 ㎖를 준비하고 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 + P / S.
- 장소는 효소 용액에 신경을 씻어서 뚜껑을 꼭 부착합니다. 약 23에서 하룻밤 13-5 시간 동안 느린 속도로 회전하는 셰이커 (표 2 참조)에 자사의 측면에 튜브를 놓습니다 ° C (실내 온도).
- 준비배양 접시.
- microdissection을하기 전에 (2 일), 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 조직 문화 후드에서 배양 접시를 준비합니다. ~ 25 분 35 밀리미터 접시의 중앙에 ~ 0.5 ML PDL를 (0.2 ㎎ / 멸균 ml의 물)를 추가합니다.
- 멸균 물을 3 배 PDL을 씻어. 건조하도록 허용합니다. 접시를 UV-소독.
- 하루에 2 뉴런을 분리합니다.
- PDL 코팅과 달리 건조 그릇 안에 미디어의 섬을 만들 ASW + P / S의 약 0.5 ml의 살균 UV 있었다 35mm 요리의 중심을 입력합니다. 이 조직 문화 후드 외부 벤치에 수행 할 수 있습니다. 한 접시 hemiganglion에서 발생하는 각 셀의 클러스터에 대해 준비를해야합니다.
- 실 가드 코팅에 의해하고 (표 3 참조) 핀 및 프로브로 사용되는 여러 가지 크기의 미세 해부 핀으로 장착 5mm 깊이 해부 표면을 경화 준비 100 mm 직경 해부 접시가있다. ASW와 + P / S, 그리고 마지막으로 인터넷 다음, 70 % isopropol의 알코올이 요리를 씻어그것은 ASW + P / S로 어떠냐
- 소화 신경의 microdissection을 준비합니다.
- 해부 접시에 소화 흉막 페달 및 구강 신경절을 포함하는 효소 용액을 붓는다.
- 반사 조명 아래 검은 색 표면에 대한 현미경의 무대에서 접시를 놓습니다.
- 첨부 된 결합 조직을 사용하여 각 흉막 페달 hemiganglion의 등쪽면을 아래로 핀. 조직 부드러운 스트레칭의 관용 될 것입니다.
- PVC 신경을 Microdissect.
- 깨끗한 미세 집게 2 쌍을 사용하고 프로브 등 포셉 한 쌍의 미세 절개 핀을 들고, 흉막 hemiganglion에서 PVC 세포를 분리. 효소 분해 제거 또는 PVC 클러스터를 덮고있는 결합 조직 칼집 떨어져 깨진, 아직 세포가 서로를 준수 할 것.
- 페달 흉막 결합 18에서 이러한 세포를 분리하기 위해 프로브를 사용하여, 다음 해부의 바닥에 세포 클러스터 떨어지게요리.
- 문화 요리에 신경을 전송합니다.
- 부드럽게 공기 방울을 도입하지 않도록주의하고, 그 문화 접시에 매체 섬으로 천천히 분배, 약간 불 광택 일회용 유리 파스퇴르 피펫의 끝으로 클러스터를 빨아들이 준비한 35mm 배양 접시에 세포 클러스터 전송 피펫으로. 별도의 배양 접시에 다른 hemiganglion과 장소의 PVC 클러스터의 분리를 반복합니다.
- BSC 신경을 Microdissect 및 전송할 수 있습니다.
- 관심의 세포를 절약하는주의 최대 구강 신경절 복부 측면을 핀. 구강 신경절 (10)의 2 BSC 세포 클러스터와 단계 1.12를 반복합니다.
- PVC 클러스터를 포함하는 BSC 클러스터와 2 요리를 포함하는 2 요리 : PVC와 BSC 뉴런의 분리는 신경 세포의 클러스터를 포함하는 4 배양 접시를 생성합니다. 신경의 나머지를 삭제하고 100mm 해부 접시를 따로 설정할 수 있습니다.
- Dissoc세포 클러스터를 늦.
- 저전력 현미경의 무대에 세포를 포함하는 배양 접시를 놓고 덮개를 제거합니다.
- 부드럽게 포셉에서 개최 미세 해부 핀 세포 클러스터에 인접한 문화 접시의 바닥을 쓸어 PVC 클러스터를 떼어 놓다. 가볍게 치기는하지만 플라스틱의 반점을 찾아 내려고 노력으로 접시의 바닥의 플라스틱으로 핀의 끝을 파고있다. 플라스틱 마찰 핀 포인트를 놓을 때, 타악기 파가 떨어져 세포의 근처의 덩어리를 나누기 매체를 통해 생산됩니다.
- 5-10 제스처는 거의 완전히 세포를 떼어 놓다 필요하지만 세포가 기계적 깎아 지른듯한 의해 파괴되지 않도록 너무 가볍게하기보다는 세포의 작은 클러스터를두고하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
- 커버 및 기타 문화 요리와 함께 반복을 대체합니다.
- 세포 배양을 저장합니다.
- 해리 세포의 가운데에있는 미디어 제도를 포함하는 배양 접시에 배치같은 150 × 25 mm 둥근 플라스틱 페트리 접시로 공기 순환을 허용하고 17 ° C.에 보육 세트에이 접시를 놓고 대형 컨테이너
- 챔버 습도의 소스로 물을 오픈 접시를 설치합니다. 하룻밤 그대로 둡니다. 세포는 접시의 중앙에있는 폴리 - D - 라이신 코팅을 준수합니다.
- 홍수 문화 요리.
- 3 일에 조심스럽게 ASW의 2.5 ML를 요리 홍수 + P / S. 검사 및 역 세포 배양 현미경을 사용하여 세포를 계산합니다. 17 ° C 배양기에있는 상점.
2. 전기 생리학
방법은 (예를 들어 Sakmann 및 Neher, 1995) 수많은 텍스트에 16을 설명했습니다 그 죄는 표준 패치입니다. 이 프로토콜은 세포 ≤ 100 PF 커패시턴스, 또는 셀 <프로토콜의 일 3, 4시 60 μm의 직경을 작동합니다. 프로세스가없는 세포는 녹음에 최적입니다. 다음과 같은 특별한 considerat이온이 적용됩니다 :
- 큰 세포는 β = 0.1로 설정 Axopatch 200B 앰프의 구성 설정을 수용 할 수 있습니다. 매우 큰 전류의 활성화는 세포 전압 클램프를 탈출하는 원인이 될 수 있습니다. ASW 솔루션 (불 침투성 N-메틸-D-글루 카민 염화로 치환 된 염화나트륨의 예를 들어 분수) 소금 함량을 대체 전체 셀 전류 진폭을 줄일 수 있습니다.
- 피펫 풀러를 뽑아 KCl을 다른 소금 450 밀리미터 (표 1 참조)으로 구성된 세포 내 용액 (ICS)와 중간 채워질 섬유 채워진 붕규산 패치 피펫가 적합하며, 약 0.5 mOhms 온 저항이 있어야합니다. 특정 이온 전류의 차단이 필요한 경우, 예를 들어, 나는 + K 전류, K +이 솔루션의 부재에서 전류와 같은 고사 + 등의 이온으로 대체 될 수 있습니다. CL - 더 자연 ICS가 필요한 경우 impermeant 음이온와 ICS의 교환도 보증9.
- 세포는 실온에서 가능> 1 시간 - 긴 녹음과 강력한입니다. 기록 문화의 24-48 시간에 해당하는 일 3 프로토콜의 4 최적입니다. 48 시간 후 어려움 때문에 세포 표면에 glycocalyx의 정교화, 아마 기가 옴 물개를 형성하고, 공정 부산물에 의한 공간 클램프 문제가있다. 세포는 <14 D에 완료 할 수 있습니다와 같은 독극물과 같은 비 패치 클램프 연구를위한 유용한, 그러나이다.
- ASW와 다른 솔루션 중력 공급 솔루션 장치에서 분배 할뿐만 아니라, 세포 내 솔루션을 통해 필터링해야 기가 옴 씰 형성을 방해 미세 입자를 제거하기 위해 0.2 μm의 Acrodisk 필터 (표 3) 주사기 장착.
- 같은 D-아스파 라진 산염 (D-ASP)를 같은 작용제를 사용하는 경우 탈감작이 발생하므로 작용제의 응용 프로그램 사이에 1-2 분 ~를 추천합니다. 반대로, 상승 작용은 종종 신속하게 반복 응용과 관찰이러한 L-글루타민산 (L-글루) 등의 작용제의 양이온.
- 이러한 L-글루 등의 작용제 작동 전류는 picospritzer 피펫 작용제를 적용하여 공부하실 수 있습니다. 이 피펫은 패치 피펫과 동일하게 뽑아 ASW의 작용제를 포함합니다. 이 피펫 팁 중력 공급 솔루션 장치의 유출 파이프 아래에 위치하며, 유출 관 (그림 2F)에서 45 ° 각도로 작용제를 신속하게 셀에서 씻겨되며, 탈감작을 최소화 할 때. 작용제 피펫은 90 ° 또는 패치 피펫에 더 상대의 각도를 만들어야합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서 대상으로하는 신경에서 감각 신경의 위치는, BSC 및 PVC 뉴런은 그림 1에 표시됩니다. BSC의 뉴런은 구강 신경절, 그대로 신경절 (그림 1A)에서 구강 질량에서 멀리 얼굴 표면의 복부 측면에 2 대칭 타원형 클러스터에 있습니다. PVC 뉴런은 중앙 축 (그림 1B)쪽으로 흉막 신경의 등쪽 표면의 주위에 래핑하는 양측, V-모양의 클러스터를 형성합니다. 오른쪽 또는 왼쪽 클러스터 사건의 약 1 %에서 개별 동물에 누락되어 있지만, 이러한 감각 뉴런은 신경 내의 박힌 위치의 장점이 있습니다. BSC와 PVC 신경 세포 클러스터는 세포막의 다크 오렌지 색상과 그림 1A의 큰 원형 개요에 나와 근처의 세포에 비해 상대적으로 작은 크기로 식별됩니다.
문화, 이러한뉴런은 공정하지 않고 종종 도금 다음날 (그림 2A)이며, 패치 그날 클램핑, 어느 날 이후에 이상적입니다. 그것은 모든 세포 본체에서 쏘아내는 것 같은 싹이없는 것은 세포의 일부임을 시사 세포가 공정 부산물 (그림 2F)가 나타납니다 경우에도 충분한 공간 클램프를 달성하기 위해 때로는 수 있습니다. 효소 소화 후 처리하여 부드러운 된 경우, 세포는 그대로 어떤 프로세스와 문화에 도착하고, 이러한 프로세스는 시간이 (그림 2B-2)로 성장한다. 이러한 세포는 패치 클램핑 적합하지 않지만 세포 녹음이 가능합니다.
전압이 게이트 나 +와 칼슘 2 +에 의해 수행 전체 세포 패치 클램프 전류는 쉽게 단기 문화 6 PVC 및 BSC 뉴런에서 기록, 두 세포 유형이 혼합 K 전류가 표시됩니다. BSC 신경은 아세틸 콜린, 세로토닌과 NMDA 4 (그림 3C에 응답) 흥분성의 전류를, BSC 및 PVC의 뉴런이 모두 흥분성의 전류와 L-글루와 D-ASP를 3 (그림 3A 및 3B)에 응답하면서. 약물의 특성에 L-글루과 이러한 뉴런 D-ASP를 유도 전류는 4 설명하고있다.
그림 1. . A.이 구강 S 클러스터 (BSC) 뉴런들은 진한 오렌지 색상 (왼쪽 hemiganglion에 큰 원)과의 해당 위치에 의해 식별 구강 및 흉막 신경절 (빨간색 원)의 글루타메이트 감각 신경의 위치를 보여주는 현미경 사진 오른쪽 흉막 hemiganglion 오른쪽 hemiganglion (작은 원). B. V-모양의 다크 오렌지 흉막 ventrocaudal (PVC) 세포 클러스터 (왼쪽 hemiganglion가 표시되지 않음).
그림 2. 문화의 글루타메이트 감각 뉴런의 현미경 사진 2 감각 뉴런과 다른 세포를 보여주는 문화 접시에 도금 후 PVC 클러스터 24 시간에서 A. 세포;. 24 시간에서 별도의 문화에서 다른 PVC 세포는 인세로 표시됩니다 B, C가.. 48 시간에서 각각 24 시간과 96 시간에서 동일한 신경 세포에서 문화의 BSC 신경. D, 24 시간에서 문화의 E. PVC 신경 세포 각각 96 시간에서 동일한 신경 세포. F. PVC 신경 패치 클램프 실험. picospritzer 피펫 아래에있는 동안 패치 피펫, 오른쪽 가장자리에서 셀을 문의합니다. 셀의 왼쪽에 보이는 큰 어두운 그림자 흐르는 욕실 피펫의 시작입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. BSC와 PVC 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 녹음에서 글루타메이트 전류. L-글루의 압력이 응용 프로그램에 대한 응답으로 BSC 신경 전류 A. 전체 셀 (1 ㎜, 100 밀리 초).의 PVC 신경 전류 B. 전체 셀 D-ASP에서의 압력 응용 프로그램 (1 ㎜, 100 밀리 초)에 대응. (1 ㎜, 100 밀리 초)에서와 같은 BSC 셀에 현재 C. 전체 셀 NMDA.
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Discussion
분리 기술은 아교 및 기타 미확인 세포의 작은 숫자와 함께 산재 50-100 고립 된 뉴런을 포함하는 감각 신경 세포의 배양을 얻을 여기에 설명. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신경 효소 용액에 남아있는 시간이며, 개별 세포로 클러스터를 분열하는 소화 세포 클러스터의 분리를 가볍게 치는. 효소 소화 (단계 1.8) 사용 가능 온도에서 최적화해야합니다. 23 천천히 흔들어 ° C, 13 시간은 BSC 클러스터 while15 시간은 PVC 클러스터에 대한 최적의 소화에 충분하다. 배양 접시에서 낮은 세포 수율은 효소 시간이 부족에 기인하거나, 하나의 셀 전송 단계 (1.11 1.12) 중 또는 플릭 단계 (1.13) 동안 너무 기계적 중단. 할 수 있습니다 문화 기판 아래로 붙어 세포의 실패뿐만 아니라, 문화의 짧은 생존은 일반적으로 너무 많은 기계적인 방해로 인해 발생합니다. 막 오염뚜가 발생할 수 있으며, 최고의 마취 동물이 잘 해부 계기가 깨끗한 지, 세척 및 관심 신경절은 ASW의 여러 린스 + P / S. 겪어야하는 것을 보장함으로써 해결된다 그것은 해부 절차의 다른 부분 사이에 악기를 씻고 알코올 청소해야 할, 또는 깨끗한 사람이 각 단계에 사용할 수 있도록 준비가 충분한 계기가있을 수 있습니다.
군소 신경 생물학적 연구는 주로 신경 세포 사이 또는 신경 세포와 근육 2, 18 사이의 신경 연결을 유지 감소 준비를 실시하고 있습니다. 이러한 준비는 특정 뉴런과의 연결 회로에 근육 프로세스 제어의 할당을 용이하게하고 또한 반복 반사의 상승 작용과 촉진의 연구를 허용합니다. 그대로 준비는 빠르게 자신의 수용체를 둔감하는 전압 클램프 프로토콜 및 길항제의 효과 연구의 특정 유형에 적합하지 않습니다.
장기 신경 공동 문화는 매우 통제 된 조건 하에서 상승 작용과 촉진을 연구하는 추가 도구입니다. 장기 협력 문화도 단일 신경 세포에 생화학 적 연구에 자신을 빌려. 공동 문화 준비의 성공은 종종 문화 17-50%의 군소의 혈 림프까지의 추가에 따라 결정됩니다. 그러나이 방법의 성공은 종종 혈 림프의 배치 별 변동에 따라 달라집니다.
여기에 설명 된 해리 세포 배양 준비 군소 모델의 사용 레퍼토리를 확장합니다. 해리 세포 배양은 신경 회로를 추론이나 방법은 어떻게 위에서 언급 한 바와 같이 그대로 시냅스를 공부 적합하지 않습니다. 해리 세포 배양 준비 단일 셀 전압 클램프 실험에서 특정 이온 컨덕턴스과 운동과 약물 속성의 존재를 확인에서 가장 큰 유틸리티가 있습니다. SEVERAL 고유의 전류는 부대 세포에서 현재의 흥분성 양이온 19 BSC 뉴런 4 현재 D-ASP에서 수용체를 포함한 단일 셀 준비를 사용하여 발견되었습니다. 군소에 대한 연구는 거의 때문에 이러한 세포와 클램프 기법을 패치에 잘 자신을 빌려 수많은 다른 적절한 모델 세포 유형의 존재를 자주 다루기 힘든 크기의 부분에서 개별 세포의 이온 전류에 초점을하지 않습니다. 결과적으로, 이러한 알파 - 아미노 -3 - 히드 록시 -5 - 메틸 -4 - isoxazole - 프로피온산 (AMPA)에 의해 활성화 된 것과 같은 군소의 특정 전류의 존재는 일반적으로 추정 AMPA 수용체의 블록 (R)에서 유추됩니다 감소 된 신경 준비에 적용하기보다는 직접 기록 AMPAR 길항제에 의한 관련 행동. 따라서 특정 전류의 존재의 확인이 부족합니다. 교양 글루타메이트 뉴런과 단일 셀 전압 클램프 방법의 분리의 존재에 대한 직접 테스트를 제공합니다이 모델 생물의 L-GluR 채널의 종류.
단일 세포 패치 클램프 실험에서 군소 뉴런의 또 다른 사용은 두 번째 메신저 폭포를 해부 있습니다. 그들은 실내 온도 3, 12, 20, 21에 기록 오랜 기간 동안 안정적이기 때문에 군소 뉴런은 특히 두 번째 메신저에 의한 변조의 연구에 적합하다 및 개별 세포가 녹음 한 후 저장하고 24 시간 후 5부터 다시 기록 할 수있는 충분히 강력합니다. 이러한 구강 및 흉막 감각 신경 세포의 클러스터 편리의 친구가 치료를받는 동안 한 접시가 컨트롤 문화를 지정 할 수 있도록, 각 신경절에서 일치하는 문화의 쌍을 얻을 수 있습니다.
이 준비의 추가 장점은 개별 신경 세포의 형태 학적 상태를 연구 중입니다. 예를 들어, 우리는 노화 동물의 군소 뉴런의 세포 기관이 있다고 발견 고맙다어린 동물에서보다 GER하지만 문화 6에서 몇 일 후에 세포 프로세스를 설명하지 않았다. 이러한 고립 된 뉴런 준비는 다음 각 세포의 신경 생리 학적 기능과 비교 될 수있는 세포 내 칼슘 +2, 산도, 활성 산소, 미토콘드리아 막 잠재력과 다른 생리적 특성의 수준을 평가하는 중요한 염료를 사용하여 연구를 용이하게합니다. 이러한 방법 중 일부를 그대로 또는 공동 배양 준비에 적용 할 수 있지만, 데이터 수집이 훨씬 더 간단이 쉽게 배양 시스템에서 격리 된 뉴런을 사용하고 있습니다. 미래에 우리는 단일 세포 분자 프로파일 13이 세포를 사용하도록하겠습니다.
해리 단기 문화는 근본적인 신경 생리 학적 과정 조사를위한 이상적인 물자를 제공하고, 연구 감소와 관련된 또는 공동 배양 준비와 함께 사용할 때 특히 강력한 도구를 제공 할 수 있습니다. 해리군소 신경 세포 문화는 신경 과학의 새롭고 흥미로운 영역이 오래된 동물 모델의 유틸리티를 확장합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
NIH P40 OD010952, Korein 재단, SLC 마이애미 원정대의 대학과 공격력 MAYTAG 휄로우 십. 저자는 기꺼이 군소뿐만 아니라, 로렌 Simonitis과 그림에 대한 현미경을 제공 한나 펙을위한 국가 자원의 직원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
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References
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