Summary
Vi beskriver disseksjon av nervesystemet av det marine sea hare
Abstract
Den marine gastropod mollusk Aplysia californica har en ærverdig historie som en modell av nervesystemet fungerer, med særlig betydning i studier av læring og hukommelse. Den typiske forberedelser for slike studier er de der sensoriske og motoneurons er igjen intakt i en minimal dissekert dyr, eller en teknisk forseggjort neuronal co-kulturen i enkelte sensoriske og motoneurons. Mindre vanlig er det isolerte neuronal forberedelse der små klynger av nominelt homogene nevroner er dissosiert i enkeltceller i kortsiktig kultur. Slike isolerte celler er nyttige for karakterisering av biofysiske ion strømninger ved hjelp av patch clamp-teknikker, og målrettet modulering av slike konduktans. En protokoll for fremstilling av slike kulturer er beskrevet. Protokollen tar nytte av lett identifiserbare glutamatergic sensoriske nevroner av pleural og bukkalt ganglier, og beskriver deres dissosiasjon og minimalt vedlikehold iN kultur i flere dager uten serum.
Introduction
Den marine opistobranch mollusk, Aplysia, har vært et nyttig nevrobiologisk modell for mange tiår. Det er best kjent som en modell for tilvenning og klassisk betinging 7, 8. Studier på læring og hukommelse i denne modellen vant Nobelprisen for fysiologi eller medisin i 2000 for Eric R. Kandel, i en pris han delte med Arvid Carlsson og Paul Greengard 10. Studier med elektriske opptak fra reduserte forberedelser, hvor elementer av nervesystemet av dette virvelløse blir dissekert fra dyret med nerver og muskler igjen festet, har bidratt til å belyse rollene til enkelte nevroner i Aplysia. Identifikasjon av presise molekylære mekanismer som utgjør læring i Aplysia imidlertid ofte brukt en annen teknikk, langsiktige co-kulturer av en sensorisk nervecelle og en motoneuron, innhentet en etter en fra individuelle donordyr og lov til å danne en synapse i kulturen fatet 21 .
Vi og andre 1, 3, 6, 14, 15, har 16 utnyttet den enkle som identifiserte nevroner kan være målrettet i denne modellen, samt utholdenhet deres i langsiktige eksperimenter for å lage dissosiert kortsiktige kulturer av klynger av nominelt homogene nevroner som studerer vi ioniske strømninger under spenning klemmen i patch clamp konfigurasjon. Mange Aplysia nevroner stå opp til gjentatte runder med patch klem å gi tid for langvarige eksperimentelle manipulasjoner. Denne teknikken er nyttig for nerveceller slik som neurosecretory bag celler av buk-ganglion, og de sensoriske nevronene i pleura og buccal ganglier hvis dissosiasjons vi beskrive her, men ikke for meget store neuroner> 60 mikrometer diameter, slik som L7 eller R2 i abdominal ganglion. Vi benytter ikke Aplysia serum i våre kulturer, i motsetning til de sensoriske-motoneuron co-kulturer beskrevet andre steder. De fleste nevroner innhentet ved hjelp av denne prosedyren vil være uten prosesser for than først 48 timer i kultur, tilrettelegging hel celle spenning opptak, men vil da spire og utdype axoner og andre prosesser i ca 14 dager før å dø av mangel på næringsstoffer og / eller vekstfaktorer.
Denne teknikken gir primære kulturer av 50-100 nerveceller per parabol fra fysiologisk dokumenterte regioner av buccale og pleural ganglier. Denne protokollen er nyttig for forskere å studere aspekter ved enkelt celle fysiologi i eksperimenter som krever mange eksperimentelle gjentak per dyr. Den produserer en matchende par av kulturer på grunn av den anatomiske separering av målcellene til venstre og høyre hemiganglia, tillater studier som har nytte av behandling matchet og kontrollkulturer.
Protokollen er rettet mot buccale S cluster (BSC) nevroner av buccale ganglion, og pleural ventrocaudal (PVC) nevroner i pleural ganglion. Disse cellene er en passende størrelse for hele celle spenning opptak og vise Robust glutamatergic svar. Diskutert metodikk er hensiktsmessig for de fleste ganglier i Aplysia nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Celleforberedelsen
- På dag 1, veie og anesthetize dyr.
- Veie 30 g-1 kg dyr. Anesthetize i 5-10 dyr mengder 01:01 sjøvann: isoton MgCl. 6H 2 0 for en time med lufting for eksempel en elektrisk akvarium luftpumpe med vedlagte airstone.
- Forbered disseksjon forsyninger.
- Monter ren disseksjon skuffen med rustfrie rette pinner, for eksempel stoff pins. Montere flere petriskåler som inneholder kunstig sjøvann (ASW, se tabell 1 og 3) + penicillin / streptomycin (P / S).
- Ha klar en lav effekt mikroskop. Ha rene disseksjon instrumenter klare, slik som ribbet nese og fin kirurgiske tang, og fine og store kirurgiske saks. Spray instrumentene med 70% isopropol alkohol før bruk og la tørke.
- Posisjon dyr på disseksjon skuffen.
- Posisjon dyr ventral side ned i disseksjon skuffen. Pin dyrgjennom kantene av kroppen veggen og parapodial grenser, men unngå halen og hodet, for å eksponere framsiden og underlivet groove
- Skyll framsiden i saktegående kaldt vann fra springen. Påfør en lett strøm av 70% isopropol alkohol fra en klemme flaske langs genital sporet og over toppen av hodet.
- Foreta den første innsnitt.
- Ved hjelp av en laveffekts mikroskop (se tabell 2) og reflektert lys for å observere det punkt hvor sporet genital stammer fra det fremre skallet margin, spennes med riflet holder-nese tang en fold av vev til venstre for denne opprinnelse, mens klippeverktøy et grunt hull tvers gjennom den glatte, flate område av kroppen veggen akkurat til høyre for genital sporet med fine vinklede saks.
- Hemolymfe bør observeres å helle fra hullet, og til og bærer med seg den abdominale ganglion og magen.
- Utvid snittet.
- Bruk store saks for å utvide the snitt anteriorly til et punkt mellom rhinophores, til mens du trekker oppover med den nedre bladet unngå nicking tarmen. De indre organene blir observert å renne ut av snittet.
- Fjern ganglier.
- Reposisjonere skuffen og refokusere mikroskopet på hodet regionen.
- Ved hjelp av rene tang og fine saks, fjerne hodet ganglia ved å skille på ett punkt nervene som danner hodet ganglia inn i en ring rundt spiserøret for å fjerne pleural-pedal og cerebral ganglia som en gruppe.
- Fjern det bukkale ganglion som fester seg til den ventrale side av spiserøret.
- Fjern abdominal ganglion ved å kutte de fire store nerve connectives som utsteder fra denne ganglion.
- Isolere ganglia av interesse.
- Trim hode ganglier fra hverandre, slik at en lengde av connectives festet til hver ganglion av interesse som er lik i det minste diameteren av ganglion, og dette vil hemme enzymet over-fordøyelseav cellene av interesse i det neste trinn.
- Sett hvert mål ganglion gjennom to skyllinger av ASW + P / S, flytting mellom skyllinger med rene tang.
- Hvis rettet mot PVC-celler, la retten pleural hemiganglion festet til den høyre pedalen hemiganglion, og tilsvarende forlate venstre pleural hemiganglion festet til venstre pedalen hemiganglion.
- Kast uønsket ganglier og resten av dyret i henhold til aksepterte undersøkelser praksis.
- Enzymatisk fordøye ganglia.
- For hver ganglion, forberede en ml av enzym-oppløsning bestående av 3,75 mg dispase, 1 mg hyaluronidase og 0,3 g kollagenase typen XI per ml ASW + P / S i et 15 ml konisk rør av polypropylen.
- Sted skylles ganglier i enzym løsning og feste hetten. Plasser røret på sin side på en roterende shaker (se tabell 2) ved lav hastighet for 13-5 hr overnatter på ca 23 ° C (romtemperatur).
- Klargjørkultur retter.
- Før mikrodisseksjon (Dag 2), forberede poly-D-lysin (PDL)-belagte kultur retter i en vev kultur hette. Legg ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml sterilt vann) til midten av en 35 mm fatet for ~ 25 min.
- Skyll PDL 3x med sterilt vann. La det tørke. UV-steriliseres platene.
- Dag 2 Isoler nerveceller.
- Fyll sentrum av 35 mm retter som var PDL-belagt og UV sterilisert med ca 0,5 ml ASW + P / S for å skape en øy av papir inne i ellers tørr parabolen. Dette kan gjøres på benken, utenfor vev kultur hette. En tallerken bør være forberedt på hver celle klynge som stammer fra en hemiganglion.
- Ha klar en 100 mm diameter disseksjon rett laget av Sylgard-belegg og herding en 5 mm dype disseksjon overflate, utstyrt med fine disseksjon pins i flere størrelser som skal brukes som pins og sonder (se tabell 3). Skyll denne retten med 70% isopropol alkohol, deretter med ASW + P / S, og til slutt fill det med ASW + P / S.
- Forbered mikrodisseksjon av fordøyd ganglier.
- Hell den enzym-oppløsningen inneholdende det fordøyde pleural-pedal og bukkal ganglier i disseksjon fatet.
- Sett fatet på scenen av mikroskopet mot en svart overflate under reflektert lys.
- Ved hjelp av den vedlagte bindevev, peke ut hver pleural-pedal hemiganglion dorsal side opp. Vevene blir myk og intolerant overfor strekking.
- Microdissect PVC nerveceller.
- Ved hjelp av to par av rene fine tang, og holder en fin disseksjon pin i en pinsett som en sonde, isolere PVC celler fra en pleural hemiganglion. Enzym fordøyelse vil ha fjernet eller brutt fra hverandre bindevevet kappe som dekker PVC-klyngen, men cellene fester seg til hverandre.
- Bruk sonden for å løsne disse cellene fra pedal-pleural bindevev 18, og deretter la cellen klynge faller til bunnen av den disseksjonparabolen.
- Overfør nerveceller til kultur parabolen.
- Overfør cellen klynge til en forberedt 35 mm kultur tallerken ved forsiktig å suge opp klyngen inn i tuppen av et svakt brann polert disponibel glass Pasteur-pipette, og deretter utlevering av den sakte inn i papir-øy i et kultur tallerken, er forsiktig for å unngå innføring av luftbobler inn i pipetten. Gjenta isolering av PVC klynge av den andre hemiganglion sted og inn i en separat kultur tallerken.
- Microdissect og overføre BSC nerveceller.
- Pin ut buccale ganglion ventrale siden opp, med forsiktighet til overs cellene av interesse. Gjenta steg 1,12 med de to BSC celle klynger av buccale ganglion 10.
- Isolering av PVC og BSC nevroner vil produsere fire kultur retter som inneholder nervecellen klynger: 2 retter som inneholder BSC klynger og to retter som inneholder PVC klynger. Kast resten av ryggmargen og sette av 100 mm disseksjon parabolen.
- DissocIATE cellen klynger.
- Plasser en kultur tallerken som inneholder celler på scenen av lav effekt mikroskop og ta av dekselet.
- Dissosiere den PVC klynge ved forsiktig å sveipe bunnen av kultur tallerken som grenser til cellen klynge med en fin disseksjon pin holdt i tenger. Flicking graver tuppen av hanndelen inn i plastmaterialet i bunnen av skålen som om forsøk på å grave ut en fleck av plast. Når friksjonen med plastmaterialet frigir fint, er et slagverk bølge produsert gjennom mediet som bryter fra hverandre den nærliggende klump av celler.
- 5-10 vipper kan være nødvendig for å nesten helt distansere cellene, men det er bedre å la små klynger av celler i stedet for å flikke for mye lest cellene bli ødelagt av mekanisk ren.
- Skift dekk og gjenta med andre kultur retter.
- Oppbevar cellekulturer.
- Plasser kultur retter som inneholder media øyer i sine sentre med dissosiert celler ien stor beholder som tillater luftsirkulasjon, slik som en 150 x 25 mm rund plast petriskål, og plassere denne tallerken i en inkubator innstilt på 17 ° C.
- Sett i kammeret en åpen skål med vann som en kilde til fuktighet. La uforstyrret over natten. Cellene fester seg til poly-D-lysin belegg i sentrum av skålen.
- Flood kultur retter.
- På dag 3, forsiktig oversvømme retter med 2,5 ml ASW + P / S. Undersøke og telle cellene ved hjelp av en omvendt celle kultur mikroskop. Oppbevares i 17 ° C inkubator.
2. Elektrofysiologi
Metoden er standard patch fastspenning som er blitt beskrevet i mange tekster (f.eks Sakmann og Neher, 1995) 16. Denne protokollen vil fungere på celler ≤ 100 pF kapasitans, eller celler <60 mikrometer diameter under dager 3 og 4 i protokollen. Celler uten prosessene er optimal for opptak. Følgende spesielle considerationer gjelder:
- Større celler kan innpasses med konfigurasjonen innstillingen på Axopatch 200B forsterkeren satt til β = 0,1. Aktivering av svært store strømmer kan forårsake celler til å unnslippe spenning klemme. ASW løsninger substituert for salt-innhold (f.eks en brøkdel av NaCl substituert med ugjennomtrengelig N-metyl-D-glukamin-klorid) kan brukes til å redusere hele celle dagens amplitude.
- Fiber-fylt borosilicate patch pipetter trukket på en pipette avtrekker og backfilled halvveis med intracellulære løsning (ICS) bestående av 450 mM KCl og andre salter (se tabell 1) er egnet, og bør ha motstand på ca 0,5-1 MOhms. Ved isolering av spesifikke ioniske strøm er ønsket, for eksempel Na +-strømmer i fravær av K-strømmer, K + i denne oppløsningen kan byttes ut med andre ioner som Cs +. Cl - utskifting av ICS med en impermeant anion er også utvises hvis en mer naturlig ICS er ønsket9.
- Cellene er robust med> 1 time lange opptak mulige ved romtemperatur. Opptak er optimal på dager 3 og 4 i protokollen, tilsvarende 24-48 timer i kultur. Etter 48 timer er det vanskeligheter med forming gigaOhm tetninger, kanskje på grunn av utdypning av en glycocalyx på celleoverflaten, og plass klemme problemer forårsaket av prosess utvekst. Cellene er nyttige, men for ikke-patch clamp studier, som toksikologi, som kan gjennomføres i <14 d.
- ASW og andre løsninger som skal dispenseres fra tyngdekraften matet løsning enhet, samt intracellulær løsning, bør filtreres gjennom en sprøyte montert på 0,2 mikrometer filter Acrodisk (tabell 3) for å fjerne fine partikler som forstyrrer gigaOhm tetning formasjon.
- Desensitivisering oppstår ved bruk av agonister som D-aspartat (D-Asp), således ~ 1-2 min mellom påføring av agonister er anbefalt. Motsatt er potensering ofte observert med rask gjentatt søkerekationet av agonister som L-glutamat (L-Glu).
- Agonist aktiverte strømmer som L-Glu kan studeres ved å påføre agonister med picospritzer pipette. Dette pipette trekkes det samme som patch pipette og inneholder agonist i ASW. Når spissen av denne pipette er posisjonert nedenfor utløpsrøret av tyngdekraften matet løsning enhet, og i en 45 ° vinkel fra utløpsrøret (figur 2F), vil agonist administreres hurtig vasket bort fra cellen, og desensitivisering vil bli minimalisert. Den agonist pipette skal skape en vinkel på 90 ° eller mer i forhold til plasteret pipette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lokaliseringen av de sensoriske neuroner innenfor ganglia som er rettet i denne protokollen, er BSC og PVC nevroner vist i figur 1. BSC nevroner befinner seg i to symmetriske ovale klynger på den ventrale side av den bukkale ganglion, den overflate som vender bort fra den buccale massen i intakt ganglion (figur 1A). De PVC-nevroner danner bilaterale, V-formede klynger som festes rundt den dorsale overflate av pleural ganglion mot den midtre aksen (figur 1B). Disse sensoriske nevroner har fordelen av en stereotyp sted i ryggmargen, selv om høyre eller venstre klynge mangler i enkelte dyr i ca 1% av forekomster. BSC og PVC neuron klyngene er identifiserbare ved den mørk orange farge av cellemembranen og relativt liten størrelse sammenlignet med nærliggende celler, som vist i den store sirkelen omrisset av figur 1A.
I kultur, dissenevroner er ofte uten prosesser dagen etter platekledning (Figur 2A) og er ideelle for patch klemmer den dagen, og en dag senere. Det er noen ganger mulig å oppnå tilstrekkelig plass klemmen selv når cellene synes å ha prosess utvekst (figur 2F), noe som tyder på at ikke alle spirer som synes å utgå fra cellelegemet er en del av cellen. Hvis håndtering etter enzymatisk fordøyelse har vært mild, celler ankommer kultur med noen prosesser intakt, og disse prosessene vokse med tiden (Tall 2B-2E). Slike celler er ikke egnet for patch festebraketter men intracellulære opptaket er mulig.
Helcelle patch clamp strømmer ledet av spenning gated Na + og Ca 2 + blir lett tatt opp fra PVC og BSC nevroner i kortsiktig kultur seks, og begge celletyper viser en blandet K strøm. BSC nevroner også svare på acetylkolin, serotonin og NMDA 4 (Figur 3C) Med eksitatoriske strømninger, mens både BSC og PVC nevroner svare til L-Glu og Asp D-3 (figurene 3A og 3B) med eksitatoriske strømninger. De farmakologiske egenskaper av L-Glu-og D-Asp-induserte strømmer i disse nevronene er blitt beskrevet 4..
Figur 1. Photomicrographs som viser plasseringen av de glutamatergic sensoriske nevroner av buccale og pleural ganglier (røde sirkler). A. buccale S cluster (BSC) nevroner, identifiserbare ved deres mørk oransje farge (stor sirkel på venstre hemiganglion) og tilsvarende posisjon i høyre hemiganglion (mindre sirkler). B. V-formet, mørk orange pleural ventrocaudal (PVC) celle klynge av høyre pleural hemiganglion (venstre hemiganglion ikke vist).
Figur 2. Photomicrographs av glutamatergic sensoriske nevroner i kultur A. celler fra PVC klynge 24 timer etter plating i kultur tallerken viser to sensoriske nerveceller og andre celler,. Andre PVC-celler fra egne kulturer på 24 hr vises som innfellinger B, C.. En BSC nevron i kulturen ved 24 timers og samme neuron ved 96 timer, henholdsvis. D, E. En PVC nevron i kultur i 24 timer og det samme neuron ved 96 hr, henholdsvis. F. En PVC-neuron i 48 timer i en patch clamp eksperiment. Plasteret pipette er i kontakt med cellen fra den høyre kant, mens den picospritzer pipetten er på bunnen. Den store mørk skygge sees til venstre for cellen er åpningen av det strømmende bad pipette. klikk her for å vise større figur.
Figur 3. Glutamaterg strømmer i helcelle patch clamp opptak fra BSC og PVC nerveceller. A. helcelle strøm i en BSC nevron som reaksjon på press anvendelse av L-Glu (1 mM, 100 msek). B. helcelle strøm i en PVC-neuron i påtrykk anvendelse av D-Asp (1 mM, 100 msek). C. helcelle NMDA strøm i samme BSC celle som i A (1 mM, 100 msek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dissosiasjon teknikkene som er beskrevet her gi sensoriske nevroner kulturer som inneholder 50-100 isolerte nerveceller ispedd små mengder gliaceller og andre uidentifiserte celler. De mest kritiske trinnene i protokollen, er den tid ganglia forbli i enzymoppløsning, og bla, dissosiering av de fordøyde celle grupper for å bryte fra hverandre klyngen inn i individuelle celler. Enzym fordøyelse (trinn 1.8) må optimaliseres ved den tilgjengelige temperatur. Ved 23 ° C med langsom risting, er 13 hr tilstrekkelig for fordøyelsen av BSC klynger while15 hr er optimal for PVC klynger. Lave celleutbytte i kulturen fatet kan tilskrives utilstrekkelig tid i enzymet, eller for mye mekanisk forstyrrelser under enten cellen overføring trinn (1,11 og 1,12) eller under flicking trinn (1,13). Svikt i cellene å feste seg til kultur-substrat, så vel som korte overlevelsen i kultur er vanligvis på grunn av for mye mekanisk forstyrrelse. Forurensning av kultursjoner kan også forekomme, og er best løses ved å sikre at bedøvet dyret er godt skylt, at disseksjon instrumenter er rene, og at ganglia av interesse er satt gjennom flere skyllinger i ASW + P / S. Det kan være nødvendig å vaske-og alkohol-ren instrumenter mellom forskjellige deler av disseksjon prosedyre, eller med nok utstyr klar slik at ren de kan anvendes for hvert trinn.
Aplysia nevrobiologiske studier er oftest utført på reduserte preparater som bevarer nerve forbindelser mellom nerveceller eller mellom nerveceller og muskler 2, 18. Disse forberedelsene til rette for tildeling av kontroll av muskulære prosesser til bestemte nerveceller og nevrale kretser og også tillate studier av forsterkning og tilrettelegging av repeterende reflekser. Intakt preparater er ikke egnet til visse typer spenning klemme protokoller og studiet av effekter av agonister som raskt desensitize deres reseptorer.
Den langsiktige neuronal co-kulturen er et ekstra verktøy for å studere potensering og tilrettelegging i henhold til svært kontrollerte forhold. Lang sikt co-kulturer også egner seg til biokjemiske studier på enkle nevroner. Suksessen til ko-kulturen forberedelse ofte tilskrives tilsetning av inntil 50% Aplysia hemolymfe til kulturene 17. Imidlertid avhenger suksessen av denne tilnærmingen ofte på batch-til-batch variasjon av denne hemolymph.
Den dissociated cellekultur forberedelse beskrevet her utvider bruken repertoar av Aplysia modell. Dissosiert cellekulturer er ikke egnet for deducing nevrale kretser eller studere intakt synapse som metodene nevnt ovenfor gjøre. Den dissosiert cellekultur preparatet har sin største nytte i å bekrefte eksistensen av spesifikke ioniske conductances og deres kinetiske og farmakologiske egenskaper i encellede voltage-clamp-eksperimenter. Sevtater unike strømmer har blitt oppdaget ved hjelp av encellede forberedelser, inkludert en eksitatoriske kation strøm i pose celler 19 og D-Asp reseptor strøm i BSC nevroner fire. Studier på Aplysia sjelden fokusere på de ioniske strømninger av individuelle celler, delvis på grunn av den ofte uhåndterlig størrelse på slike celler og eksistensen av en rekke andre egnede modell celletyper som egner seg godt til å lappe klemme teknikker. Som et resultat, er eksistensen av visse strømninger i Aplysia, slik som de som aktiveres av alfa-amino-3-hydroksyl-5-metyl-4-isoksazol-propionsyre-(AMPA) vanligvis utledes fra blokk av putative AMPA reseptor (R) -relatert atferd ved Ampar antagonister brukes på redusert nerve forberedelse, snarere enn direkte registrert. Således verifisering av eksistensen av visse strømmer mangler. Isolering av dyrkede glutamatergic nevroner og enkelt celle spennings-klemme-metoden gir en direkte test for at det eksistererforskjellige typer av L-Glur kanaler i denne modellen organisme.
En annen bruk av Aplysia nevroner i encellete patch clamp eksperimenter er i dissekere andre messenger kaskader. Aplysia nevronene er spesielt godt egnet til studier av andre messenger indusert modulering fordi de er stabile i lange perioder av opptak ved romtemperatur 3, 12, 20, 21 , og er tilstrekkelig robust at individuelle celler kan lagres etter opptak og spilt fra igjen etter 24 timer 5. Disse bukkale og pleural sensorisk neuron klynger beleilig gi en matchende par av kulturer fra hver ganglion, slik at den ene tallerken kan betegnes en kontrollkultur mens dens mate mottar en behandling.
En ekstra fordel med dette preparatet er i studier av den morfologiske statusen til de enkelte nerveceller. For eksempel oppdaget vi at cellen organer Aplysia nerveceller fra senescent dyrene var Larger enn de fra yngre dyr, men ikke utdype celleprosesser etter flere dager i kultur seks. Disse isolerte nervecellen preparater også legge til rette for studier med viktige fargestoffer for å vurdere nivået av intracellulær Ca 2, pH, reaktive oksygenforbindelser, mitokondriemembranen potensial og andre fysiologiske egenskaper som kan deretter sammenlignes med nevrofysiologiske funksjoner i individuelle celler. Mens noen av disse tilnærmingene er aktuelt i intakt eller co-kultur forberedelser, er datainnsamling mye enklere å bruke isolerte nerveceller i denne enkle kultur system. I fremtiden håper vi å bruke disse cellene for enkelt celle molekylær profilering 13.
Den dissociated kort sikt kultur gir ideelle materialet for å undersøke grunnleggende nevrofysiologiske prosesser, og kan gi en spesielt kraftig verktøy når det brukes sammen med studier som involverer redusert eller co-kultur forberedelser. Den dissociatedAplysia nervecellen kultur utvider nytten av denne ærverdige dyremodell til nye og interessante områdene nevrovitenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiert av NIH P40 OD010952, den Korein Foundation, en University of Miami Fellowship til SLC og en Maytag fellesskap å ATK. Forfatterne ønsker å takke de ansatte på National Resource for Aplysia, samt Lauren Simonitis og Hannah Peck, som ga mikrografer for en figur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
