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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

का संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव Published: July 10, 2013 doi: 10.3791/50543
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Marine Biology and Fisheries, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences, University of Miami

Summary

हम समुद्री समुद्र खरगोश के तंत्रिका तंत्र के विच्छेदन का वर्णन

Abstract

समुद्री gastropod मोलस्क Aplysia californica सीखने और स्मृति की पढ़ाई में विशेष महत्व के साथ, तंत्रिका तंत्र समारोह की एक मॉडल के रूप में एक आदरणीय इतिहास है. इस तरह के अध्ययन के लिए खास तैयारी संवेदी और motoneurons के एक न्यूनतम विच्छेदित पशु में बरकरार रह, या व्यक्तिगत संवेदी और motoneurons के एक तकनीकी तौर पर विस्तृत न्यूरोनल सह संस्कृति कर रहे हैं जो लोगों में हैं. कम आम नाममात्र सजातीय न्यूरॉन्स के छोटे समूहों अल्पावधि संस्कृति में एकल कक्षों में अलग हैं, जिसमें अलग neuronal तैयारी है. इस तरह अलग कक्षों पैच दबाना तकनीक, और इन conductances की लक्षित मॉडुलन का उपयोग आयन धाराओं के biophysical लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी होते हैं. ऐसी संस्कृतियों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्रोटोकॉल फुफ्फुस और मुख गैन्ग्लिया से आसानी से पहचाना glutamatergic संवेदी न्यूरॉन्स का लाभ लेता है, और उनके पृथक्करण और कम से कम रखरखाव का वर्णन मैंसीरम के बिना कई दिनों के लिए n संस्कृति.

Introduction

समुद्री opistobranch मोलस्क, Aplysia, कई दशकों के लिए एक उपयोगी neurobiological मॉडल की गई है. यह सबसे अच्छा आदी होना और शास्त्रीय कंडीशनिंग 7, 8 की एक मॉडल के रूप में जाना जाता है. इस मॉडल में सीखने और स्मृति पर अध्ययन वह Arvid Carlsson और पॉल Greengard 10 के साथ साझा एक पुरस्कार में, एरिक आर कंडेल के लिए 2000 में फिजियोलॉजी या चिकित्सा के लिए नोबेल पुरस्कार जीता. कम तैयारी से इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग से जुड़े अध्ययनों से पता चलता है, जिसमें इस अकशेरुकी के तंत्रिका तंत्र के तत्वों नसों के साथ जानवरों से विच्छेदित कर रहे हैं और मांसपेशियों को संलग्न, Aplysia में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की भूमिकाओं को स्पष्ट मदद की है छोड़ दिया है. Aplysia में सीखने का गठन कि सटीक आणविक तंत्र की पहचान हालांकि, अक्सर व्यक्तिगत दाता जानवरों से एक एक करके प्राप्त की एक और तकनीक, लंबे समय तक एक संवेदी न्यूरॉन के सह संस्कृतियों और एक motoneuron, नियोजित और संस्कृति पकवान 21 में एक synapse फार्म की अनुमति दी .

हम और दूसरों के 1, 3, 6, 14, 15, 16 न्यूरॉन्स नाममात्र सजातीय न्यूरॉन्स के समूहों की अलग अल्पावधि संस्कृतियों बनाने के लिए लंबी अवधि के प्रयोगों में के रूप में अच्छी तरह से उनके धीरज इस मॉडल के रूप में लक्षित किया जा सकता है की पहचान की जिस आसानी से शोषण किया है जिसमें हम पैच दबाना विन्यास में वोल्टेज क्लैंप के तहत आयनिक धाराओं का अध्ययन. कई Aplysia न्यूरॉन्स लंबे समय से स्थायी प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए समय की अनुमति clamping पैच के दोहराया राउंड अप करने के लिए खड़े हो जाओ. तकनीक ऐसी पेट नाड़ीग्रन्थि के तंत्रिका बैग कोशिकाओं, और जिसका हदबंदी हम यहाँ वर्णन फुफ्फुस और मुख गैन्ग्लिया का संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में न्यूरॉन्स के लिए उपयोगी है, लेकिन नहीं करने के लिए बहुत बड़ी न्यूरॉन्स> 60 माइक्रोन ऐसे L7 के रूप में व्यास, या की आर 2 पेट नाड़ीग्रन्थि. हम कहीं वर्णित संवेदी motoneuron सह संस्कृतियों के विपरीत, हमारे संस्कृतियों में Aplysia सीरम रोजगार नहीं है. इस प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त अधिकांश न्यूरॉन्स टी के लिए प्रक्रियाओं के बिना किया जाएगावह पूरे सेल वोल्टेज रिकॉर्डिंग की सुविधा संस्कृति में पहले 48 घंटा,, लेकिन फिर अंकुर और पोषक तत्वों और / या वृद्धि कारकों की कमी से मरने से पहले लगभग 14 दिनों के लिए axons और अन्य प्रक्रियाओं की विस्तृत होगा.

इस तकनीक मुख और फुफ्फुस ganglia के physiologically दस्तावेज क्षेत्रों से पकवान प्रति 50-100 न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों पैदा करता है. इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं कई प्रयोगात्मक पशु प्रति replicates की आवश्यकता है कि प्रयोगों में एकल कक्ष शरीर क्रिया विज्ञान के पहलुओं के अध्ययन के लिए उपयोगी है. यह मिलान उपचार और नियंत्रण संस्कृतियों के अध्ययन बताते हैं कि लाभ की अनुमति, बाएँ और दाएँ hemiganglia में लक्ष्य कोशिकाओं के संरचनात्मक जुदाई के कारण संस्कृतियों की एक जोड़ी मिलान पैदा करता है.

प्रोटोकॉल मुख नाड़ीग्रन्थि के मुख एस क्लस्टर (बीएससी) न्यूरॉन्स, और फुफ्फुस नाड़ीग्रन्थि के फुफ्फुस ventrocaudal (पीवीसी) न्यूरॉन्स लक्ष्य. इन कोशिकाओं को पूरे सेल वोल्टेज रिकॉर्डिंग और प्रदर्शन robus के लिए एक उपयुक्त आकार के होते हैंटी glutamatergic प्रतिक्रियाओं. चर्चा की कार्यप्रणाली Aplysia तंत्रिका तंत्र में सबसे गैन्ग्लिया के लिए उपयुक्त है.

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Protocol

1. सेल तैयार

  1. दिन 1 पर, वजन और पशु anesthetize.
    1. एक 30 जी 1 किलो पशु वजन. Isotonic MgCl: 1:1 समुद्री जल के 5-10 पशु मात्रा में anesthetize. ऐसे संलग्न airstone के साथ एक इलेक्ट्रिक मछलीघर हवा पंप के रूप में वेंटिलेशन के साथ 1 घंटे के लिए 6 2 0.
  2. विच्छेदन की आपूर्ति की तैयारी.
    1. इस तरह के कपड़े पिन के रूप में स्टेनलेस स्टील सीधे पिन, साथ साफ विच्छेदन ट्रे इकट्ठे. + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस). कई पेट्री कृत्रिम समुद्री जल युक्त व्यंजन (टेबल्स 1 और 3 देखें ASW) इकट्ठा
    2. तैयार एक कम शक्ति माइक्रोस्कोप है. साफ विच्छेदन उपकरणों ऐसे धारीदार नाक और ठीक शल्य संदंश के रूप में तैयार है, और ठीक है और बड़ी शल्य कैंची है. उपयोग करने से पहले 70% isopropol शराब के साथ उपकरणों स्प्रे और सुखाने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. विच्छेदन ट्रे पर स्थिति जानवर.
    1. विच्छेदन ट्रे में स्थिति पशु उदर पक्ष नीचे. पिन जानवरशरीर दीवार और parapodial सीमाओं, लेकिन पृष्ठीय सतह का पर्दाफाश करने के लिए, पूंछ और सिर से बचने और जननांग नाली के किनारों के माध्यम से
    2. धीमी गति से चल रहे ठंडे पानी के नल में पृष्ठीय सतह कुल्ला. जननांग नाली के साथ एक निचोड़ बोतल से और सिर के ऊपर से 70% isopropol शराब की एक प्रकाश धारा लागू करें.
  4. प्रारंभिक चीरा.
    1. एक उथले snipping जबकि एक कम शक्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग (2 टेबल देखें) और जननांग नाली पूर्वकाल खोल मार्जिन के स्रोत से इस मुद्दे पर जहां निरीक्षण करने के लिए प्रकाश परिलक्षित, tautly, धारीदार नाक संदंश इस मूल के बाईं ओर ऊतक के एक गुना के साथ पकड़ अभी ठीक से angled कैंची से जननांग नाली के अधिकार के लिए शरीर दीवार की चिकनी, फ्लैट क्षेत्र के माध्यम से सभी तरह छेद.
    2. Hemolymph कभी कभी इसके साथ पेट नाड़ीग्रन्थि और पेट को ले जाने, छेद से डाल करने के लिए मनाया जाना चाहिए.
  5. चीरा विस्तार करें.
    1. वें विस्तार करने के लिए बड़ी कैंची का प्रयोग करेंपूर्व से rhinophores के बीच एक बात करने के लिए ई चीरा, कम ब्लेड के साथ ऊपर की ओर खींच रहा है, जबकि पेट nicking से बचने के लिए. आंतरिक अंगों चीरा के बाहर गिर करने के लिए मनाया जाएगा.
  6. गैन्ग्लिया निकालें.
    1. ट्रे का स्थान बदलें और सिर क्षेत्र पर माइक्रोस्कोप refocus.
    2. साफ संदंश और ठीक कैंची का प्रयोग, एक बिंदु पर एक समूह के रूप में फुफ्फुस-पेडल और मस्तिष्क गैन्ग्लिया दूर करने के लिए घुटकी के चारों ओर एक अंगूठी में सिर गैन्ग्लिया कि फार्म नसों विच्छेद से सिर गैन्ग्लिया हटा दें.
    3. घुटकी के उदर पक्ष का पालन करता है कि मुख नाड़ीग्रन्थि निकालें.
    4. इस नाड़ीग्रन्थि से 4 बड़े तंत्रिका संयोजियों कि इस मुद्दे को काटने से पेट नाड़ीग्रन्थि निकालें.
  7. ब्याज की गैन्ग्लिया अलग.
    1. नाड़ीग्रन्थि के कम से कम व्यास के बराबर है कि ब्याज की प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि से जुड़ी संयोजियों की लंबाई छोड़ने के अलावा सिर गैन्ग्लिया छाँटो; इस एंजाइम मंदबुद्धि होगा पर-पाचनअगले कदम में ब्याज की कोशिकाओं की.
    2. ASW के 2 rinses + साफ संदंश के साथ rinses के बीच चलती पी / एस, के माध्यम से प्रत्येक लक्ष्य नाड़ीग्रन्थि रखो.
    3. पीवीसी कोशिकाओं को लक्षित करते हैं, तो सही पेडल hemiganglion से जुड़ी सही फुफ्फुस hemiganglion छोड़ देते हैं, और इसी तरह बाएं पेडल hemiganglion से जुड़ी बाएं फुफ्फुस hemiganglion छोड़ दें.
    4. अवांछित ganglia और स्वीकार किए जाते अनुसंधान अभ्यास के अनुसार पशु के बाकी त्यागें.
  8. Enzymatically गैन्ग्लिया पचाने.
    1. प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि के लिए, 3.75 मिलीग्राम dispase, 1 मिलीग्राम hyaluronidase और ASW की मिलीलीटर प्रति 0.3 ग्राम collagenase प्रकार इलेवन से मिलकर एंजाइम समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार एक 15 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में पी / एस.
    2. जगह एंजाइम समाधान में गैन्ग्लिया rinsed और कसकर टोपी देते हैं. लगभग 23 बजे रात में 13-5 घंटे के लिए धीमी गति से एक रोटरी प्रकार के बरतन (2 टेबल देखें) पर अपनी तरफ ट्यूब प्लेस डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान).
  9. तैयार करनासंस्कृति व्यंजन.
    1. सूक्षम से पहले (2 दिन), पाली डी lysine (पीडीएल) में लिपटे एक टिशू कल्चर हुड में संस्कृति व्यंजन तैयार करते हैं. ~ 25 मिनट के लिए एक 35 मिमी पकवान के केंद्र के लिए ~ 0.5 मिलीलीटर पीडीएल (0.2 मिलीग्राम / बाँझ पानी की मिलीलीटर) जोड़ें.
    2. बाँझ पानी के साथ 3x पीडीएल कुल्ला. सूखे की अनुमति दें. प्लेटों यूवी बाँझ.
  10. 2 दिन न्यूरॉन्स अलग.
    1. पीडीएल में लिपटे और अन्यथा सूखी पकवान अंदर मीडिया के एक द्वीप बनाने के लिए एएसडब्ल्यू + पी / एस के लगभग 0.5 मिलीलीटर के साथ निष्फल यूवी थे कि 35 मिमी व्यंजन का केन्द्र भरें. इस टिशू कल्चर हुड के बाहर बेंच पर किया जा सकता है. एक पकवान एक hemiganglion से होने वाले प्रत्येक कोशिका क्लस्टर के लिए तैयार रहना चाहिए.
    2. Sylgard कोटिंग से बने होते हैं और (3 टेबल देखें) पिन और जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए कई आकारों के ठीक विच्छेदन पिन के साथ outfitted एक 5 मिमी गहरी विच्छेदन सतह, इलाज के लिए तैयार एक 100 मिमी व्यास विच्छेदन पकवान है. ASW के साथ + पी / एस, और अंत में इंटरनेट है, तो 70% isopropol शराब के साथ इस पकवान कुल्लायह एएसडब्ल्यू + पी / एस के साथ करूँगा
  11. पच ganglia के सूक्षम तैयार.
    1. विच्छेदन डिश में पचा फुफ्फुस-पेडल और मुख गैन्ग्लिया युक्त एंजाइम समाधान डालो.
    2. परिलक्षित प्रकाश के तहत एक काले रंग की सतह के खिलाफ खुर्दबीन के मंच पर पकवान.
    3. संलग्न संयोजी ऊतक का प्रयोग, प्रत्येक फुफ्फुस-पेडल hemiganglion पृष्ठीय पक्ष नीचे पिन. ऊतकों नरम और खींच के असहिष्णु हो जाएगा.
  12. पीवीसी न्यूरॉन्स Microdissect.
    1. साफ ठीक संदंश के 2 जोड़ी का उपयोग करना, और एक जांच के रूप में संदंश की एक जोड़ी में एक ठीक विच्छेदन पिन पकड़े, एक फुफ्फुस hemiganglion से पीवीसी कोशिकाओं को अलग. एंजाइम पाचन हटा या पीवीसी क्लस्टर को कवर संयोजी ऊतक म्यान अलावा टूटी हुई है, फिर भी कोशिकाओं को एक दूसरे का पालन करना होगा होगा.
    2. पेडल फुफ्फुस संयोजी 18 से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए जांच का प्रयोग करें, तो विच्छेदन की तह तक सेल क्लस्टर गिर जानेपकवान.
  13. संस्कृति डिश के लिए न्यूरॉन्स स्थानांतरण.
    1. धीरे हवा बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, तो एक संस्कृति डिश में मीडिया द्वीप में धीरे धीरे यह वितरण, एक थोड़ा आग पॉलिश डिस्पोजेबल गिलास पाश्चर पिपेट की नोक में क्लस्टर को चूसने द्वारा तैयार 35 मिमी संस्कृति डिश के लिए सेल क्लस्टर स्थानांतरण पिपेट में. एक अलग संस्कृति डिश में अन्य hemiganglion और जगह की पीवीसी क्लस्टर के अलगाव को दोहराएँ.
  14. बीएससी न्यूरॉन्स Microdissect और हस्तांतरण.
    1. ब्याज की कोशिकाओं को क्षमा करने के लिए ध्यान के साथ, ऊपर मुख नाड़ीग्रन्थि उदर पक्ष बाहर पिन. मुख नाड़ीग्रन्थि 10 में से 2 बीएससी सेल समूहों के साथ कदम 1.12 दोहराएँ.
    2. पीवीसी समूहों युक्त बीएससी समूहों और 2 व्यंजन युक्त 2 व्यंजन: परमवीर चक्र और बीएससी न्यूरॉन्स के अलगाव न्यूरॉन समूहों युक्त 4 संस्कृति व्यंजन का उत्पादन होगा. गैन्ग्लिया के बाकी त्यागें और 100 मिमी विच्छेदन पकवान अलग निर्धारित करें.
  15. Dissocसेल समूहों देर हो गई.
    1. कम बिजली की खुर्दबीन के मंच पर कोशिकाओं से युक्त एक संस्कृति डिश प्लेस और कवर हटा दें.
    2. धीरे संदंश में आयोजित एक ठीक विच्छेदन पिन के साथ सेल क्लस्टर से सटे संस्कृति डिश के नीचे flicking द्वारा पीवीसी क्लस्टर अलग कर देना. Flicking हालांकि प्लास्टिक की एक दारा बाहर खुदाई करने के लिए कोशिश कर के रूप में पकवान के नीचे से प्लास्टिक में पिन की नोक खुदाई कर रहा है. प्लास्टिक के साथ घर्षण पिन बिंदु जारी करता है, एक टक्कर लहर अलग कोशिकाओं के आसपास के पेड़ों का झुरमुट टूट जाता है कि मध्यम के माध्यम से उत्पादन किया है.
    3. 5-10 गेंद लगभग पूरी तरह से कोशिकाओं को अलग कर देना करने की जरूरत है, लेकिन यह कोशिकाओं यांत्रिक सरासर से नष्ट हो ऐसा न हो कि बहुत ज्यादा झटका बजाय कोशिकाओं के छोटे समूहों को छोड़ने के लिए बेहतर है हो सकता है.
    4. कवर और अन्य संस्कृति व्यंजन के साथ दोहराने बदलें.
  16. सेल संस्कृतियों स्टोर.
    1. अलग कोशिकाओं के साथ अपने केन्द्रों में मीडिया द्वीपों से युक्त संस्कृति बर्तन में रखेंइस तरह के एक 150 x 25 मिमी दौर प्लास्टिक पेट्री डिश के रूप में हवा परिसंचरण, परमिट, और 17 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन सेट में इस पकवान जगह है कि एक बड़े कंटेनर
    2. कक्ष में नमी का एक स्रोत के रूप में पानी की एक खुली डिश स्थापित करें. रातोंरात अछूता छोड़ दें. कोशिकाओं डिश के केंद्र में पाली डी lysine कोटिंग का पालन करना होगा.
  17. बाढ़ संस्कृति व्यंजन.
    1. 3 दिवस पर, धीरे ASW के 2.5 मिलीलीटर के साथ व्यंजन बाढ़ पी / एस जांच करने और एक औंधा सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं गिनती. 17 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्टोर.

2. विद्युतशरक्रिया विज्ञान

विधि (जैसे Sakmann और नेहर, 1995) कई ग्रंथों में 16 वर्णित किया गया है कि clamping मानक पैच है. इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं पर ≤ 100 पीएफ समाई, या कोशिकाओं <प्रोटोकॉल के दिन 3 और 4 के दौरान 60 माइक्रोन व्यास काम करेंगे. प्रक्रियाओं के बिना कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी हैं. निम्न विशेष बातों केआयनों लागू होते हैं:

  1. बड़ा कोशिकाओं β = 0.1 के लिए सेट Axopatch 200B एम्पलीफायर पर विन्यास की स्थापना के साथ शामिल किया जा सकता है. बहुत बड़ी धाराओं के सक्रियण कोशिकाओं वोल्टेज क्लैंप से बचने के लिए कारण हो सकता है. एएसडब्ल्यू समाधान (अभेद्य एन बहुत से कार्बनिक योगिकों का आधार-D-glucamine क्लोराइड के साथ प्रतिस्थापित NaCl के जैसे एक अंश) नमक सामग्री के लिए एवजी पूरे सेल वर्तमान आयाम को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. एक विंदुक खींचने पर खींच लिया और KCl और अन्य लवण 450 मिमी (1 टेबल देखें) से मिलकर intracellular समाधान (आईसीएस) के साथ आधे रास्ते backfilled फाइबर से भरे borosilicate पैच pipettes उपयुक्त हैं, और लगभग 0.5-1 MOhms का विरोध करना चाहिए था. विशिष्ट आयनिक धाराओं के अलगाव वांछित है, उदाहरण के लिए, ना + कश्मीर धाराओं, कश्मीर + इस समाधान में की अनुपस्थिति में धाराओं ऐसे सी + + के रूप में अन्य आयनों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. सीएल - एक अधिक प्राकृतिक आईसीएस वांछित है अगर एक impermeant आयनों के साथ आईसीएस के प्रतिस्थापन भी न्यायसंगत9.
  3. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर संभव> 1 घंटा भर की रिकॉर्डिंग के साथ मजबूत कर रहे हैं. रिकॉर्डिंग संस्कृति में 24-48 घंटा, इसी दिन 3 और प्रोटोकॉल के 4 पर इष्टतम है. 48 घंटे के बाद कठिनाई क्योंकि कोशिका की सतह पर एक glycocalyx के विस्तार की शायद, gigaOhm जवानों बनाने, और प्रक्रिया परिणाम की वजह से अंतरिक्ष दबाना समस्या है. कोशिकाओं <14 घ में पूरा किया जा सकता है कि इस तरह के विष विज्ञान के रूप में गैर पैच दबाना अध्ययन, के लिए, उपयोगी, लेकिन कर रहे हैं.
  4. ASW और अन्य समाधान गुरुत्वाकर्षण खिलाया समाधान डिवाइस से तिरस्कृत किया जाना है, साथ ही intracellular समाधान के माध्यम से फिल्टर किया जाना चाहिए एक gigaOhm सील गठन के साथ हस्तक्षेप कि ठीक कणों को खत्म करने के लिए 0.2 माइक्रोन Acrodisk फिल्टर (तालिका 3) सिरिंज मुहिम शुरू की.
  5. ऐसे D-aspartate (डी एएसपी) के रूप में एगोनिस्ट का उपयोग करते समय असंवेदीकरण होता है, इसलिए agonists के अनुप्रयोगों के बीच 1-2 मिनट ~ सिफारिश की है. इसके विपरीत, potentiation अक्सर तेजी से दोहराया appli के साथ मनाया जाता हैऐसे एल ग्लूटामेट (एल ग्लू) के रूप में agonists के कटियन.
  6. ऐसे एल ग्लू रूप agonist सक्रिय धाराओं Picospritzer पिपेट साथ एगोनिस्ट लगाने से अध्ययन किया जा सकता है. इस पिपेट पैच विंदुक के रूप में ही खींच लिया और ASW में एगोनिस्ट होता है. इस पिपेट की नोक गुरुत्वाकर्षण खिलाया समाधान डिवाइस का बहिर्वाह पाइप के नीचे स्थित है, और बहिर्वाह पाइप (चित्रा 2 एफ) से एक 45 डिग्री के कोण पर, एगोनिस्ट जल्दी सेल से दूर धोया जाएगा, और desensitization कम से कम हो जाएगा. एगोनिस्ट पिपेट 90 डिग्री या पैच विंदुक के लिए अधिक रिश्तेदार के कोण बनाने चाहिए.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में लक्षित कर रहे हैं कि गैन्ग्लिया भीतर संवेदी न्यूरॉन्स के स्थानों, बीएससी और पीवीसी न्यूरॉन्स चित्र 1 में दिखाया जाता है. बीएससी न्यूरॉन्स मुख नाड़ीग्रन्थि, अक्षत नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 1 ए) में मुख जन से दूर चेहरे कि सतह के उदर पक्ष पर 2 सममित अंडाकार समूहों में स्थित हैं. पीवीसी न्यूरॉन्स केंद्रीय धुरी (चित्रा 1 बी) की ओर फुफ्फुस नाड़ीग्रन्थि के पृष्ठीय सतह के आसपास है कि चादर के द्विपक्षीय, वी के आकार समूहों फार्म. दाएं या बाएं क्लस्टर घटनाओं के लगभग 1% में व्यक्ति पशुओं में याद आ रही है, हालांकि ये संवेदी न्यूरॉन्स, ganglia के भीतर एक टकसाली स्थान का फायदा है. बीएससी और पीवीसी न्यूरॉन समूहों कोशिका झिल्ली के गहरे नारंगी रंग और रूप में चित्रा 1 ए के बड़े सर्कल रूपरेखा में दिखाए पास कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत छोटे आकार के द्वारा पहचाने जाने योग्य हैं.

संस्कृति में, इनन्यूरॉन्स प्रक्रियाओं के बिना अक्सर चढ़ाना के बाद दिन (2A चित्रा) कर रहे हैं और पैच कि दिन clamping, और एक दिन बाद के लिए आदर्श हैं. यह सभी सेल शरीर से निर्गत होना लगता है कि अंकुरण नहीं सेल का हिस्सा है, सुझाव है कि कोशिकाओं प्रक्रिया परिणाम (चित्रा 2 एफ) दिखाई देते हैं, जब भी पर्याप्त स्थान दबाना प्राप्त करने के लिए कभी कभी संभव है. Enzymatic पाचन के बाद से निपटने सौम्य किया गया है, कोशिकाओं को अक्षुण्ण कुछ प्रक्रियाओं के साथ संस्कृति में पहुंचें, और इन प्रक्रियाओं समय (आंकड़े 2 बी -2 ई) के साथ बड़े होते हैं. ऐसी कोशिकाओं पैच clamping के लिए उपयुक्त नहीं हैं लेकिन intracellular रिकॉर्डिंग संभव है.

वोल्टेज gated ना + और ​​सीए 2 + द्वारा किए गए पूरे सेल पैच दबाना धाराओं आसानी से अल्पकालिक संस्कृति 6 में पीवीसी और बीएससी न्यूरॉन्स से दर्ज की गई, और दोनों प्रकार की कोशिकाओं के एक मिश्रित कश्मीर वर्तमान प्रदर्शित कर रहे हैं. बीएससी न्यूरॉन्स भी acetylcholine, सेरोटोनिन और NMDA 4 (चित्रा -3 सी का जवाब) उत्तेजक धाराओं के साथ, बीएससी और पीवीसी न्यूरॉन्स दोनों उत्तेजक धाराओं के साथ एल ग्लू और डी एएसपी 3 (आंकड़े 3 ए और 3 बी) का जवाब है. औषधीय की विशेषताओं एल ग्लू और इन न्यूरॉन्स में डी एएसपी प्रेरित धाराओं 4 में वर्णित किया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. . ए मुख एस क्लस्टर (बीएससी) न्यूरॉन्स, उनके गहरे नारंगी रंग (बाएं hemiganglion पर बड़ा वृत्त) और में इसी स्थिति से पहचान योग्य मुख और फुफ्फुस गैन्ग्लिया (लाल वृत्त) के glutamatergic संवेदी न्यूरॉन्स की स्थिति दिखा photomicrographs सही फुफ्फुस hemiganglion की सही hemiganglion (छोटे हलकों). बी वी के आकार, गहरे नारंगी फुफ्फुस ventrocaudal (पीवीसी) सेल क्लस्टर (बाएं hemiganglion) नहीं दिखाया.


चित्रा 2. संस्कृति में glutamatergic संवेदी न्यूरॉन्स की photomicrographs 2 संवेदी न्यूरॉन्स और अन्य कोशिकाओं दिखा संस्कृति डिश में चढ़ाना के बाद पीवीसी क्लस्टर 24 घंटे से ए प्रकोष्ठों;. 24 घंटे में अलग संस्कृतियों से अन्य पीवीसी कोशिकाओं insets के रूप में दिखाए जाते हैं, बी, सी.. एक में 48 घंटे में क्रमशः 24 घंटे और 96 घंटे में ही न्यूरॉन में संस्कृति में बीएससी न्यूरॉन,. डी, 24 घंटे में संस्कृति में ई. एक पीवीसी न्यूरॉन और क्रमश: 96 घंटे में एक ही न्यूरॉन,. एफ एक पीवीसी न्यूरॉन पैच दबाना प्रयोग. Picospritzer पिपेट तल पर है जबकि पैच पिपेट, ठीक किनारे से सेल से संपर्क कर रहा है. सेल के बाईं ओर दिखाई बड़ा अंधेरा छाया बह स्नान पिपेट का उद्घाटन है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. बीएससी और पीवीसी न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग में glutamatergic धाराओं. एल ग्लू का दबाव आवेदन के जवाब में एक बीएससी न्यूरॉन में वर्तमान ए पूरे सेल (1 मिमी, 100 मिसे). में एक पीवीसी न्यूरॉन में वर्तमान बी पूरे सेल डी एएसपी का दबाव आवेदन (1 मिमी, 100 मिसे) के जवाब. ए (1 मिमी, 100 मिसे) के रूप में ही बीएससी सेल में वर्तमान सी. पूरे सेल NMDA.

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Discussion

हदबंदी तकनीक glia और अन्य अज्ञात कोशिकाओं की कम संख्या के साथ interspersed 50-100 पृथक न्यूरॉन्स युक्त संवेदी न्यूरॉन संस्कृतियों उपज यहाँ वर्णित है. प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम गैन्ग्लिया एंजाइम समाधान में रहते समय कर रहे हैं, और, व्यक्ति की कोशिकाओं में क्लस्टर अलग तोड़ने के लिए पचा सेल समूहों की हदबंदी flicking. एंजाइम पाचन (कदम 1.8) उपलब्ध तापमान पर अनुकूलित किया जाना चाहिए. 23 से कम धीमी झटकों के साथ डिग्री सेल्सियस, 13 घंटा बीएससी समूहों while15 घंटा पीवीसी समूहों के लिए इष्टतम है के पाचन के लिए पर्याप्त है. संस्कृति डिश में कम सेल पैदावार एंजाइम में अपर्याप्त समय के लिए जिम्मेदार ठहराया है, या तो सेल हस्तांतरण कदम (1.11 और 1.12) के दौरान या flicking कदम (1.13) के दौरान बहुत अधिक यांत्रिक विघटन. किया जा सकता है संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए नीचे लकड़ी करने के लिए कोशिकाओं की विफलता है, साथ ही संस्कृति में संक्षिप्त अस्तित्व आमतौर पर बहुत ज्यादा यांत्रिक व्यवधान की वजह से है. संस्कृति के प्रदूषणtures में भी हो सकता है, और सबसे अच्छा संवेदनाहृत पशु अच्छी तरह विच्छेदन उपकरणों साफ कर रहे हैं, rinsed, और ब्याज की गैन्ग्लिया एएसडब्ल्यू में कई rinses के पी / एस के माध्यम से डाल रहे हैं कि है कि सुनिश्चित करने के द्वारा संबोधित किया गया है यह विच्छेदन की प्रक्रिया के विभिन्न भागों के बीच उपकरणों धोने और शराब से साफ करने के लिए आवश्यक हो सकता है, या स्वच्छ लोगों प्रत्येक चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि तैयार पर्याप्त उपकरणों हो सकता है.

Aplysia neurobiological पढ़ाई सबसे अधिक बार न्यूरॉन्स के बीच या न्यूरॉन्स और मांसपेशियों को 2, 18 के बीच तंत्रिका कनेक्शन को बनाए रखने कि कम तैयारी पर आयोजित की जाती हैं. इन तैयारियों विशिष्ट न्यूरॉन्स और neuronal सर्किट को पेशी प्रक्रियाओं के नियंत्रण के काम की सुविधा और भी दोहराए सजगता की potentiation और सरलीकरण की पढ़ाई की अनुमति. बरकरार तैयारी तेजी से अपने रिसेप्टर्स असंवेदनशील कि वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल और agonists के प्रभाव के अध्ययन के कुछ प्रकार के लिए अनुकूल नहीं हैं.

लंबी अवधि के लिए neuronal सह संस्कृति अत्यधिक नियंत्रित परिस्थितियों में potentiation और सुविधा का अध्ययन करने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण है. लंबी अवधि के सह संस्कृतियों भी एकल न्यूरॉन्स पर जैव रासायनिक अध्ययन के लिए उधार दे. सह संस्कृति तैयारी की सफलता अक्सर संस्कृतियों 17-50% Aplysia hemolymph तक की इसके लिए जिम्मेदार ठहराया है. हालांकि, इस दृष्टिकोण की सफलता अक्सर इस hemolymph के बैच को बैच परिवर्तनशीलता पर निर्भर करता है.

यहाँ वर्णित अलग सेल संस्कृति तैयारी Aplysia मॉडल के उपयोग के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार. अलग सेल संस्कृतियों तंत्रिका सर्किट deducing या तरीकों कर उपरोक्त के रूप में बरकरार अन्तर्ग्रथन के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं. अलग सेल संस्कृति तैयारी एकल कक्ष वोल्टेज दबाना प्रयोगों में विशिष्ट आयनिक conductances और उनकी गतिज और औषधीय गुणों के अस्तित्व की पुष्टि में इसकी सबसे बड़ी उपयोगिता है. सेवआम अद्वितीय धाराओं बैग कोशिकाओं में मौजूदा एक उत्तेजक केशन 19 और बीएससी न्यूरॉन्स 4 में वर्तमान डी एएसपी रिसेप्टर सहित एकल कक्ष की तैयारी, का उपयोग करते हुए पाया गया है. Aplysia पर अध्ययन शायद ही कभी क्योंकि ऐसी कोशिकाओं और दबाना तकनीकों पैच करने के लिए अच्छी तरह से खुद को उधार दे कि कई अन्य उपयुक्त मॉडल प्रकार की कोशिकाओं के अस्तित्व के अक्सर बोझल आकार के हिस्से में व्यक्ति की कोशिकाओं के आयनिक धाराओं, पर ध्यान केंद्रित. नतीजतन, ऐसे अल्फा एमिनो 3 हाइड्रॉक्सिल-5-मिथाइल-4-isoxazole-propionic एसिड (AMPA) द्वारा सक्रिय उन के रूप में Aplysia में कुछ धाराओं के अस्तित्व आमतौर पर ख्यात AMPA रिसेप्टर के ब्लॉक (नि.) से inferred रहे हैं कम तंत्रिका तैयारी के लिए आवेदन किया है, बजाय सीधे दर्ज Ampar गरम करके संबंधी व्यवहार. इस प्रकार कुछ धाराओं के अस्तित्व का सत्यापन कमी है. सुसंस्कृत glutamatergic न्यूरॉन्स और एकल कक्ष वोल्टेज दबाना कार्यप्रणाली के अलगाव के अस्तित्व के लिए एक प्रत्यक्ष परीक्षण प्रदान करता हैइस मॉडल जीव में एल GluR चैनलों के विभिन्न प्रकार के.

एकल कक्ष पैच दबाना प्रयोगों में Aplysia न्यूरॉन्स की एक और उपयोग दूसरे दूत cascades विदारक में है. वे कमरे के तापमान 3, 12, 20, 21 पर रिकॉर्डिंग की लंबी अवधि के लिए स्थिर रहे हैं क्योंकि Aplysia न्यूरॉन्स विशेष रूप से अच्छी तरह से दूसरा दूत प्रेरित मॉडुलन की पढ़ाई के लिए अनुकूल हैं , और व्यक्ति की कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के बाद बचा लिया और 24 घंटे 5 के बाद फिर से दर्ज किया जा सकता है कि पर्याप्त रूप से मजबूत कर रहे हैं. ये मुख और फुफ्फुस संवेदी न्यूरॉन समूहों आसानी से अपने साथी एक उपचार प्राप्त करता है, जबकि एक पकवान एक नियंत्रण संस्कृति में नामित किया जा सकता है, ताकि प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि से मिलान संस्कृतियों की एक जोड़ी निकलेगा.

इस तैयारी का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की रूपात्मक स्थिति के अध्ययन में है. उदाहरण के लिए, हम वृद्ध होनेवाला जानवरों से Aplysia न्यूरॉन्स सेल निकायों थे कि पता चला लोकप्रियछोटे जानवरों से उन लोगों की तुलना में जर्मन, लेकिन संस्कृति 6 में कई दिनों के बाद सेल की प्रक्रिया विस्तृत नहीं था. ये अलग न्यूरॉन की तैयारी भी तो व्यक्ति की कोशिकाओं के neurophysiological सुविधाओं के साथ तुलना की जा सकती कि intracellular सीए 2, पीएच, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, mitochondrial झिल्ली क्षमता और अन्य शारीरिक लक्षण के स्तर का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण रंगों का उपयोग अध्ययन की सुविधा. इन तरीकों में से कुछ को बरकरार या सह संस्कृति की तैयारी में लागू होते हैं, डेटा संग्रह और अधिक सरल यह आसान संस्कृति प्रणाली में पृथक न्यूरॉन्स का उपयोग कर रहा है. भविष्य में हम एकल कक्ष आणविक रूपरेखा 13 के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने की उम्मीद है.

अलग अल्पावधि संस्कृति मौलिक neurophysiological प्रक्रियाओं की जांच के लिए आदर्श सामग्री प्रदान करता है, और पढ़ाई कम से जुड़े या सह संस्कृति तैयारी के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है जब एक विशेष रूप से शक्तिशाली उपकरण प्रदान कर सकता है. वियोजितAplysia न्यूरॉन संस्कृति तंत्रिका विज्ञान के नए और दिलचस्प क्षेत्रों को इस आदरणीय पशु मॉडल की उपयोगिता फैली हुई है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

एनआईएच P40 OD010952, Korein फाउंडेशन, एसएलसी को मियामी फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय और ATK को एक Maytag फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों का आभार Aplysia, साथ ही लॉरेन Simonitis और एक व्यक्ति के लिए micrographs प्रदान की जो हन्ना पेक, के लिए राष्ट्रीय संसाधन के कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar  
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)  
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild  
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer  
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.  
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices  
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA  
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA  
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA  
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH  
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek  
Faraday cage custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA  
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - WPI 1B150-3  
3 inch length  
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 Becton-Dickinson For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA For perfusion system
one-way valves For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)  
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100 fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store  
dish holder for microscope stage with isolated ground bath Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator  

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

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References

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का संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamatergic धाराओं के पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए
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Fieber, L. A., Carlson, S. L.,… More

Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

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