Summary
Мы описываем рассечение нервной системы морской морской заяц
Abstract
Морских брюхоногих моллюсков Aplysia саЩогтса имеет почтенную историю как модель нервной системы, при этом особое значение в исследованиях обучения и памяти. Типичные препараты для таких исследований являются те, в которых сенсорных и двигательных нейронов остаются нетронутыми в минимально расчлененный животного или технически сложные нейронные совместное культивирование индивидуальных сенсорных и моторных нейронов. Менее распространенной является изолированной нейронной препарат, в котором небольшие группы номинально однородные нейроны распадается на отдельные клетки в краткосрочной перспективе культуры. Такие изолированные клетки могут быть использованы для биофизические характеристики ионного тока использованием патч зажим методы, а также целевые модуляции этих проводимостей. Методике получения таких культур описано. Протокол использует легко идентифицировать глутаматергические сенсорными нейронами плевральной и щечной ганглиев, и описывает их диссоциации и минимальное техническое обслуживание яРусская культура в течение нескольких дней без сыворотки.
Introduction
Морских моллюсков opistobranch, Aplysia, был полезный нейробиологическое модели на протяжении многих десятилетий. Он является самым известным в качестве модели привыкания и классического кондиционирования 7, 8. Исследования в области обучения и памяти в этой модели получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2000 году Эрик Р. Кандель, в выигрыше он поделился с Арвид Карлссон и Пол Грингард 10. Исследования с участием электрических записей с пониженной препараты, в которых элементы нервной системы беспозвоночных этого расчленены от животного с нервами и мышцами оставлена на устройстве, помогли выяснения роли отдельных нейронов в Aplysia. Идентификация точной молекулярные механизмы, которые составляют обучение в Aplysia однако, часто используют другой способ, долгосрочное со-культур сенсорных нейронов и мотонейронов, полученный по одному из отдельных животных-доноров и позволило сформировать синапс в культуральной чашке 21 .
Мы и другие 1, 3, 6, 14, 15, 16 эксплуатировали легкость, с которой определены нейроны могут быть направлены в этой модели, а также их выносливости в долгосрочных экспериментов сделать диссоциированными краткосрочных культурах кластеров номинально однородные нейроны , в которой мы изучаем ионных токов при напряжении зажим в конфигурации зажим патч. Многие нейроны Aplysia встать на неоднократные вспышки фиксации потенциала, чтобы дать время для длительных экспериментальных манипуляций. Метод полезен для нейронов, таких как нейросекреторной мешок клетках брюшной ганглий и сенсорными нейронами плевральной и щечной ганглиев диссоциации которых мы описываем здесь, но не для очень больших нейронов> 60 мкм в диаметре, такие как L7 или R2 в брюшной ганглий. Мы не используем Aplysia сыворотки в нашей культуре, в отличие от сенсорно-двигательных нейронов совместно культур описано в другом месте. Большинство нейронов, полученные с использованием этой процедуры будет без процессов тон первые 48 ч в культуре, содействие целом записи напряжения клетки, но затем прорастают и разработать аксонов и других процессов в течение примерно 14 дней, прежде чем умереть от недостатка питательных веществ и / или факторами роста.
Эта методика дает первичных культурах нейронов 50-100 за блюдо из физиологически документально регионах буккальное и плевральных ганглиев. Этот протокол является полезным для исследователей, изучающих аспекты одного физиологии клетки в экспериментах, которые требуют многочисленных экспериментальных повторяет одно животное. Он производит согласованную пару культур за счет анатомической отделение клеток-мишеней на левую и правую hemiganglia, позволяя исследования, которые соответствуют выгоду от лечения и контрольных культурах.
Протокол цели щечной S кластер (BSC) нейронов ганглиев щечной и плевральный ventrocaudal (ПВХ) нейронов плевральный ганглия. Эти клетки соответствующего размера для целой клетки напряжения записи и отображения RobusT глутаматергические ответов. Обсуждается методология подходит для большинства ганглиев в Aplysia нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток
- В день 1 взвесить и обезболить животное.
- Взвесить 30 г-1 кг животного. Обезболить в 5-10 объемами животное 1:01 морской воды: изотонический MgCl. 6H 2 0 в течение 1 ч при аэрации, такие как электрический воздушный насос аквариум с прикрепленными распылитель.
- Подготовьте рассечение поставок.
- Соберите чистых рассечение лоток из нержавеющей стали прямые контакты, такие как ткани булавками. Сборка несколько чашек Петри содержащие искусственной морской воде (ASW; см. таблицы 1 и 3) + пенициллина / стрептомицина (P / S).
- Подготовьте низкого силового микроскопа. Иметь чистые инструменты вскрытия готовы, например, ребристый нос и тонкие хирургические щипцы, и мелких и крупных хирургических ножниц. Спрей инструментов с 70% спиртом изопропиловый перед использованием и дать высохнуть.
- Позиция животных на вскрытии лоток.
- Позиция животного вентральной стороной вниз в лоток рассечение. Pin животныхчерез ребра стенки тела и параподий границ, но избежать хвостом и головой, чтобы разоблачить и спинной поверхности половых канавкой
- Промойте спинной поверхности в медленно струей холодной водопроводной воды. Применить светового потока на 70% изопропиловый спирт из бутылки сжатия вдоль половых канавку и поверх головы.
- Сделать начальный разрез.
- Использование низкого силового микроскопа (см. таблицу 2) и отраженного света для наблюдения в точке, где половой паз происходит от переднего края оболочки, туго проводить с ребристым нос щипцы складки ткани, слева от этой происхождения, в то время как отсекать мелкие Отверстие все путем гладкую, ровную площадь стенки тела только направо половых канавки с мелкими угловыми ножницами.
- Гемолимфа следует соблюдать, чтобы вылить из отверстия, иногда унося с собой брюшной ганглий и желудка.
- Развернуть разреза.
- Используйте большие ножницы, чтобы расширить йэлектронной разрез спереди до точки между rhinophores, одновременно вытягивая вверх с нижнего ножа, чтобы избежать уменьшение поперечного сечения кишечнике. Внутренние органы будут наблюдаться в высыпался из разреза.
- Снимите ганглиев.
- Установите на лоток и переориентировать микроскоп на область головы.
- Использование чистых щипцов и тонких ножниц, удалить голову ганглиев путем разделения в одной точке нервов, которые образуют ганглии головы в кольцо вокруг пищевода удалить плевральной педали и церебральных ганглиев как группа.
- Снимите щечной ганглий, которая придерживается брюшной стороне пищевода.
- Снимите брюшной ганглий путем разрезания 4 больших связок нервов, выходящие из этого узла.
- Изолировать ганглиях интерес.
- Обрезка головка ганглиев друг от друга, оставляя длину связки прикреплены друг к ганглий интерес, равный по крайней мере, диаметр ганглий, это будет тормозить фермента на пищеварениеклеток интерес к следующему шагу.
- Положите каждую цель ганглий через 2 цикла полоскания противолодочного + P / S, перемещение между полоскания с чистыми щипцами.
- Если они нацелены на ПВХ клетки, оставьте правой плевральной hemiganglion установлен на правый hemiganglion педали, а так же оставить левую плевральную hemiganglion прикреплен к левой hemiganglion педали.
- ВЫБРАСЫВАЙТЕ ганглиев и остального животного в соответствии с принятой практикой исследований.
- Ферментативно переварить ганглиев.
- Для каждого ганглия, готовить 1 мл ферментного раствора, содержащего 3,75 мг диспазы, 1 гиалуронидазы мг и 0,3 г коллагеназы типа XI на мл ASW + P / S в 15-мл полипропиленовую коническую трубку.
- Место промывать ганглиев в раствор фермента и приложите крышку плотно. Поместите пробирку на бок на роторной качалке (см. таблицу 2) при низкой скорости в течение 13.5 часов в течение ночи при приблизительно 23 ° С (комнатная температура).
- Подготовьтекультуры блюд.
- Перед микродиссекции (день 2), готовят поли-D-лизином (PDL) покрытые культуральные чашки в капот культуры ткани. Добавить ~ 0,5 мл PDL (0,2 мг / мл стерильной воды) до центра 35 мм блюдо в течение ~ 25 мин.
- Промыть 3 раза PDL стерильной водой. Дайте высохнуть. УФ-стерилизации пластин.
- День 2 Изолировать нейронов.
- Заполните центре 35 мм блюд, которые были PDL покрытием и УФ стерилизовать примерно 0,5 мл ASW + P / S для создания острове материалы внутри сухих иначе блюдо. Это может быть сделано на скамейке, за пределами капот культуры ткани. Одно блюдо должно быть подготовлено для каждой ячейки кластера, происходящих из hemiganglion.
- Подготовьте 100 мм чашку диаметром рассечение сделанные Sylgard покрытия и отверждения глубиной 5 мм вскрытия поверхности, оснащен прекрасным контактов вскрытие нескольких размеров, которые будут использоваться как булавки и зонды (см. таблицу 3). Промыть это блюдо с 70% спиртом изопропиловый, то с ASW + P / S, и, наконец Fill его с ASW + P / S.
- Подготовьте микродиссекции переваривается ганглиев.
- Налейте раствор, содержащий фермент переваривается плевральной педали и щечной ганглиев в рассечение блюдо.
- Поместите блюдо на столик микроскопа с черной поверхности в отраженном свете.
- С помощью прилагаемой соединительной тканью, придавить каждой плевральной педали hemiganglion спинной стороной вверх. Ткань будет мягкой и нетерпимы к растяжению.
- Microdissect ПВХ нейронов.
- Использование 2 пары чистых тонкий пинцет, и проведение штраф контактный рассечение в одной парой щипцов в качестве зонда, изолировать ПВХ клеток из плевральной hemiganglion. Фермент пищеварение будут удалены или разделен на части соединительной ткани, покрывающей оболочки кластера ПВХ, пока клетки будут прилипать друг к другу.
- С помощью зонда, чтобы отделить эти клетки от педали-плевральный соединительной 18, то пусть падения кластера чеек в нижней части рассечениеблюдо.
- Передача нейронов к культуре блюдо.
- Передача клеточной кластера на подготовленное блюдо культуры 35 мм, аккуратно всасывая кластера в кончик слегка граненые одноразовой стеклянной пипетки Пастера, то это медленно дозирования в средствах массовой информации остров в культуре блюдо, соблюдая осторожность, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в пипетку. Повтор изоляции кластера ПВХ другой hemiganglion и поместить в отдельную посуду культуры.
- Microdissect и передачи BSC нейронов.
- Разъем для щечной ганглии брюшной стороне, с осторожностью, чтобы пощадить интерес клетки. Повторите шаг 1,12 с 2 BSC кластеров клеток ротовой ганглий 10.
- Изоляция из ПВХ и BSC нейронов будет производить 4 культуре блюд, содержащих кластеры нейронов: 2 блюд, содержащих кластеры BSC и 2 блюд, содержащих ПВХ кластеров. Откажитесь от остальной части ганглиев и отложите в сторону 100 мм рассечение блюдо.
- DissocИАТЭ клеточных кластеров.
- Поместите чашку Петри, содержащие клетки на стадии низкого силового микроскопа и снимите крышку.
- Диссоциируют кластера ПВХ, осторожно щелкая дне чашки для культивирования, прилегающих к кластера чеек с тонкой контактный вскрытия проведена в щипцов. Рывки копает кончик штифта в пластике дно тарелки, как будто пытался выкопать Флек из пластика. Когда трения с пластиковыми освобождает контактный пункт, ударные волны производится через среду, которая распадается соседнего скопления клеток.
- 5-10 щелчки могут быть необходимы, чтобы почти полностью диссоциируют клеток, но лучше оставить небольшие кластеры клеток, вместо того, чтобы вылить слишком много чтобы клетки будут уничтожены механическим чистой.
- Установите крышку и повторите с другими блюдами культуры.
- Храните клеточных культурах.
- Место культуры блюд, содержащих СМИ островов в их центрах с диссоциированных клеток вбольшой контейнер, который позволяет циркуляции воздуха, например, размером 150 х 25 мм круглая пластиковая блюдо Петри, и поместить это блюдо в инкубатор до 17 ° C.
- Установка в камере открытой чашке воды в качестве источника влажности. Оставьте на ночь спокойно. Клетки будет прилипать к поли-D-лизин покрытием в центр чашки.
- Наводнение блюда культуры.
- На 3 день Аккуратно затопить блюда с 2,5 мл ASW + P / S. Изучить и Граф клеток с использованием инвертированного микроскопа культуре клеток. Хранить в 17 ° C инкубаторе.
2. Электрофизиологии
Метод стандартных фиксации потенциала, которые были описаны в многочисленных текстов (например Sakmann и Neher, 1995) 16. Этот протокол будет работать на клетки ≤ 100 пФ емкости, или клеток <60 мкм в диаметре в дни 3 и 4 протокола. Клетки без процессы являются оптимальными для записи. Следующие специальные РАССМОТРЕНИЕионы применяются:
- Крупные клетки могут быть размещены с настройки конфигурации на Axopatch 200B усилитель установлен в β = 0,1. Активация очень большие токи могут привести к клеткам избежать напряжения зажима. ASW решений заменить содержание солей (например, доля NaCl замещен непроницаемый N-метил-D-глюкамин хлорид), могут быть использованы для снижения целой клетки амплитуды тока.
- Наполненный боросиликатного пипетки патч натянул съемник пипетки и засыпаны наполовину внутриклеточного раствора (ICS), состоящий из 450 мМ KCl и других солей (см. таблицу 1) подходят, и должны иметь сопротивление примерно 0,5-1 МОм. Если выделение специфических ионных токов желательна, например, Na + токи при отсутствии тока K, K + в этом растворе могут быть заменены на другие ионы, такие как Cs +. Cl - замена ICS с impermeant анион также оправдано, если более естественный ICS желательна9.
- Клетки являются надежными с> 1 час длиной записи возможно при комнатной температуре. Запись оптимальной на 3 и 4 Протокола, соответствующие 24-48 ч в культуре. После 48 часов есть трудности формирования гигаом печатей, возможно, из-за разработки гликокаликсом на поверхности клетки, и пространство зажим проблемы, вызванные процессом вырост. Клетки являются полезными, однако, для не-патч зажим исследования, такие как токсикология, которые могут быть завершены в <14 г.
- ASW и другие решения для дозирования из раствора устройство самотеком, а также внутриклеточных решение, следует профильтровать через шприц монтажа 0,2 мкм Acrodisk фильтр (таблица 3), чтобы устранить мелкие частицы, которые препятствуют образованию уплотнение гигаом.
- Десенсибилизации происходит при использовании агонистов, таких как D-аспартат (D-Asp), поэтому ~ 1-2 мин между приложениями агонистов рекомендуется. И наоборот, усиление часто наблюдается при быстром повторяется примененийкатион агонисты, такие как L-глутамат (L-Glu).
- Агонисты активированного токи, такие как L-Glu могут быть изучены с применением агонистов с Picospritzer пипетки. Это пипеткой вытягивается таким же, как патч пипетки и содержит агонистов ASW. Когда кончик пипетки это располагается ниже выпускную трубку раствора устройство самотеком, а на угол 45 ° с выпускной трубкой (рис. 2F), агонист будет быстро смывается с клетки и десенсибилизации будет сведена к минимуму. Агонист пипетки должны создавать под углом 90 ° или более, по отношению к патч пипетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Места расположения сенсорных нейронов в ганглии, которые ориентированы в данном протоколе, КБС и ПВХ нейронов показаны на рисунке 1. BSC нейронов расположены в 2 симметричных овальных кластеров на брюшной стороне ротовой ганглий, поверхность, которая обращена от щечной массы в неповрежденной ганглиев (рис. 1А). ПВХ нейроны формируют двусторонние, V-формы кластеров, которые обертывают вокруг спинной поверхности плевральных ганглиев к центральной оси (рис. 1В). Эти сенсорные нейроны имеют то преимущество, стереотипное место в ганглиях, хотя правая или левая кластере отсутствует у отдельных животных в примерно 1% случаев. BSC и ПВХ нейрон кластеры могут быть идентифицированы по темно-оранжевый цвет клеточной мембраны и относительно небольшие размеры по сравнению с соседними клетками, как показано на большой контур круга 1А.
В культуре этинейроны часто без процессы день после посева (рис. 2А) и идеально подходят для фиксации потенциала в тот день, и один день позже. Иногда удается достичь адекватного зажим места даже когда клетки, кажется, есть результат процесса (рис. 2F), предполагая, что не все, что прорастание, кажется, исходят от тела клетки является частью клетки. Если после обработки ферментативного расщепления была нежной, клетки прибывают в культуре с некоторыми процессами нетронутыми, и эти процессы расти со временем (рис. 2B-2E). Такие клетки не являются подходящими для фиксации потенциала, но внутриклеточной регистрации возможно.
Целая клетка патч зажим токов осуществляется по напряжению закрытого Na + и Ca 2 + легко записаны из ПВХ и BSC нейронов в краткосрочной перспективе культуры 6, и оба типа клеток отображать смешанные K тока. BSC нейроны также реагировать на ацетилхолин, серотонин и NMDA-4 (рис. 3C) С возбуждающими токами, в то время как BSC и ПВХ нейроны реагировать на L-Glu и Asp, D-3 (фиг.3А и 3В) с возбуждающих токов. Фармакологическая характеристика L-Glu-и D-Asp-индуцированных токов в этих нейронах были описаны 4.
Рисунок 1. Микрофотографии, показывающие расположение глутаматэргическую сенсорных нейронах буккальное и плевральных ганглиев (красный кружки). А. щечной S кластер (BSC) нейронов, идентифицируемых по их темно-оранжевый цвет (большой круг на левом hemiganglion) и соответствующие положения в право hemiganglion (меньшие кружки). B. V-образной формы, темно-оранжевый ventrocaudal плевральный (ПВХ) клетка кластер правой плевральной hemiganglion (слева hemiganglion не показаны).
Рисунок 2. Микрофотографии глутаматергические сенсорных нейронов в культуре клетках A. из кластера ПВХ 24 часов после посева культуры в росписи тарелки 2 сенсорные нейроны и другие клетки;. Другие клетки ПВХ из отдельных культур через 24 часа показаны как вставками B, C.. BSC нейронов в культуре через 24 часа и того же нейрона через 96 часов, соответственно. D, E. ПВХ нейронов в культуре через 24 часа и того же нейрона через 96 часов, соответственно. F. ПВХ нейрона в 48 часов в Эксперимент патч зажим. Патч пипетки контактирование клетки от правого края, в то время как Picospritzer пипетки на дно. Большие темные тени видны слева от ячейки, является открытие протекающей пипетки ванну. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 3. Глутаматэргическую токов в целой клетки патч зажим записи с BSC и ПВХ нейронов. A. полного тока ячейки в BSC нейрона в ответ на давление применение L-Glu (1 мМ, 100 мс). B. полного тока ячейки в ПВХ нейронов ответ на давление применение D-Asp (1 мМ, 100 мс). С. Цельная клетки NMDA тока в той же клетке, что и в BSC (1 мМ, 100 мс).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Диссоциации описанные здесь методы получения сенсорных нейронов культур содержащие 50-100 изолированных нейронов перемежаются с небольшими числами глии и других неустановленных клеток. Наиболее важным шагом в протоколе являются время ганглии оставаться в растворе фермента, и щелкая, диссоциацию расщепленной кластеры клеток разбиваются на части кластера на отдельные клетки. Фермент пищеварение (шаг 1.8) должны быть оптимизированы на доступные температуре. При 23 ° С при медленном встряхивании 13 часов достаточно для переваривания КБС кластеров while15 часов оптимальна для кластеров ПВХ. Низкий выход клеток в культуральной чашке может быть приписано недостаточности времени на фермент или слишком большое механическое разрушение во время или шаг переноса клеток (1,11 и 1,12) или в течение щелкая шаг (1.13). Выход из строя клетки, приклеивать к культуре подложки, а также краткую выживания в культуре, как правило, из-за слишком большого механического разрушения. Загрязнение кульвания также может произойти, и лучше всего решать путем обеспечения того, под наркозом животного хорошо промыты, что рассечение инструментов чистые, и что ганглии интерес ставятся через несколько полосканий в ASW + P / S. Это может быть необходимо, чтобы вымыть и алкоголем чистой инструментов между различными частями вскрытия процедуры или достаточно инструментов, чтобы готовые чистые могут быть использованы для каждого шага.
Aplysia нейробиологические исследования чаще всего проводятся на пониженной препараты, сохраняющие нервных связей между нейронами или между нейронами и мышцами 2, 18. Эти препараты облегчения присвоения контроля мышечных процессов для конкретных нейронов и нейронных цепей, а также позволяют исследования потенцирование и упрощения повторяющихся рефлексов. Интактных препараты не подходят для определенных типов протоколов напряжение зажима и изучение эффектов агонистов, которые быстро уменьшают чувствительность их рецепторов.
Долгосрочные нейронов совместно культуры является дополнительным инструментом для изучения потенцирования и облегчение при очень контролируемых условиях. Долгосрочные сокультурах также поддаются биохимические исследования на отдельных нейронов. Успех совместной культуре препарат часто связывают с добавлением до 50% Aplysia гемолимфой к культурам 17. Однако успех этого подхода часто зависит от партии к партии изменчивость этой гемолимфы.
Диссоциированных препарат клеточных культур, описанные здесь расширяется использование репертуар модели Aplysia. Диссоциированных культурах клеток не подходят для выведения нейронных цепей или учебы нетронутыми синапса как упомянутые выше методы делают. Диссоциированных подготовки культуры клеток имеет свои наиболее выгоден тем, подтверждающих существование ионной проводимости конкретных и их кинетические и фармакологические свойства в одном эксперименты напряжения элемента зажима. СевEral уникальные токи были обнаружены использованием одного клеточных препаратов, в том числе возбуждающей катионов тока в сумке клетки 19 и D-Asp рецепторов ток в нейронах BSC 4. Исследования по Aplysia редко сосредоточены на ионные токи отдельных клеток, в частности, из-за часто громоздки размер таких клеток и существуют многочисленные другие подходящую модель типы клеток, которые хорошо поддаются патч зажим методов. Как следствие, наличие определенных токов в Aplysia, например, активированный с помощью альфа-амино-3-гидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионовой кислоты (АМРА), как правило, выводится из блока предполагаемый рецептор AMPA (R) поведения, связанного по AMPAR антагонистов применяется к пониженной подготовки нерв, а не непосредственно записаны. Таким проверки существования определенных токов отсутствует. Выделение культурных глутаматергические нейронов и одной ячейки напряжения зажим методология обеспечивает прямой тест для существованияразличные типы L-GluR каналов в этой модели организма.
Другое использование нейронов Aplysia в одном экспериментов клетки патч зажим находится в рассекает второй каскады сообщениями. Aplysia нейроны особенно хорошо подходит для исследований второй модуляции индуцированного мессенджера, потому что они являются стабильными в течение длительных периодов записи при комнатной температуре 3, 12, 20, 21 , и являются достаточно надежными, что отдельные клетки могут быть сохранены после записи и записал от снова после 24 часов 5. Эти буккальное и плевральный сенсорных нейронов кластеров удобно получить пару совмещенных культур из каждого ганглия, так что блюдо может быть обозначен контрольной культуры в то время как его помощник получает лечение.
Дополнительным преимуществом этого препарата в исследованиях морфологический состояние отдельных нейронов. Например, мы обнаружили, что клеточные тела нейронов Aplysia от стареющих животных LARGER, чем те, от молодых животных, но не уточнил, клеточных процессов после нескольких дней в культуре 6. Эти изолированные препараты нейрон также способствовать исследований с использованием витальных красителей для оценки уровня внутриклеточного Са +2, рН, активные формы кислорода, митохондриального мембранного потенциала и другие физиологические признаки, которые можно затем сравнить с нейрофизиологические особенности отдельных клеток. Хотя некоторые из этих подходов могут применяться в нетронутыми или совместного культивирования препаратов, сбор данных является гораздо более простой с использованием изолированных нейронов в этой простой системе культуры. В будущем мы надеемся использовать эти клетки для одной ячейки молекулярного профилирования 13.
Диссоциированных короткий срок культура обеспечивает идеальный материал для исследования фундаментальных нейрофизиологических процессов, а, может обеспечить особенно мощным инструментом, когда используется в сочетании с исследований с участием уменьшен или совместного культивирования препаратов. ДиссоциированныхAplysia нейрона культуры расширяет полезность этого почтенного животной модели на новые и интересные области нейронаук.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Финансируемых NIH P40 OD010952, Korein Фонда, Университета Майами стипендий для SLC и Maytag стипендию ATK. Авторы выражают благодарность сотрудникам Национального Ресурс для Aplysia, а также Лорен Simonitis и Ханна Пек, который предоставил микрофотографии для фигуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
