Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل الخلايا العصبية الحسية من Published: July 10, 2013 doi: 10.3791/50543
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Marine Biology and Fisheries, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences, University of Miami

Summary

نحن تصف تشريح الجهاز العصبي من الأرنب البحر البحرية

Abstract

البحرية بطني الأرجل الرخويات Aplysia californica لديها تاريخ الجليلة كنموذج من وظيفة الجهاز العصبي، مع أهمية خاصة في دراسات التعلم والذاكرة. التحضيرات نموذجية لمثل هذه الدراسات هي تلك التي يتم ترك الحسية والعصبونات الحركية سليمة في تشريح الحيوان الحد الأدنى، أو تفصيلا تقنيا العصبية الثقافة المشتركة الحسي للفرد والعصبونات الحركية. أقل شيوعا هو إعداد الخلايا العصبية معزولة في الذي مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية المتجانسة أبعاده هي نأت إلى خلايا مفردة في الثقافة على المدى القصير. مثل هذه الخلايا المعزولة هي مفيدة لتوصيف البيوفيزيائية من التيارات أيون باستخدام تقنيات المشبك التصحيح، وتعديل المستهدفة من هذه المواصلة. يوصف بروتوكول لإعداد مثل هذه الثقافات. بروتوكول يستفيد من التعرف عليها بسهولة الخلايا العصبية الحسية الجلوتاميرجي من العقد الجنبي والشدق، ويصف التفكك والحد الأدنى من الصيانة طثقافة ن لعدة أيام دون المصل.

Introduction

كان الرخوي opistobranch البحرية، Aplysia، وهذا نموذج العصبية الحيوية مفيدة لعدة عقود. ومن المعروف أنها نموذج من التعود وتكييف الكلاسيكية 7، 8. فاز دراسات عن التعلم والذاكرة في هذا النموذج على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 2000 لاريك كاندل R.، في الجائزة التي تقاسمها مع أرفيد كارلسون وبول غرينغارد 10. دراسات شملت التسجيلات الكهربائية من انخفاض الاستعدادات، التي يتم تشريح عناصر الجهاز العصبي من هذه اللافقاريات من الحيوان مع الأعصاب والعضلات غادر المرفقة، وقد ساعدت توضيح أدوار الخلايا العصبية الفردية في Aplysia. تحديد الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشكل التعلم في Aplysia ومع ذلك، غالبا ما تستخدم أسلوب آخر، على المدى الطويل المشترك الثقافات من الخلايا العصبية الحسية والعصبون الحركي، التي تم الحصول عليها واحدا تلو الآخر من الحيوانات المانحة الفردية وسمح لتشكيل المشبك في صحن الثقافة 21 .

نحن وغيرنا 1، 3، 6، 14، 15، 16 لقد استغل السهولة التي تم تحديدها يمكن استهداف الخلايا العصبية في هذا النموذج، وكذلك قدرتهم على التحمل في تجارب طويلة الأمد لجعل الثقافات المدى القصير فصلها من مجموعات من الخلايا العصبية المتجانسة أبعاده التي ندرس التيارات الأيونية تحت المشبك الجهد في تكوين المشبك التصحيح. العديد من الخلايا العصبية Aplysia الوقوف في جولات متكررة من التصحيح لقط لإتاحة الوقت للالتلاعب التجريبية طويلة الأمد. هذه التقنية مفيدة للخلايا العصبية مثل الخلايا الإفرازية العصبية كيس من العقدة في البطن، والخلايا العصبية الحسية في العقد الجنبي والشدق التي تفارق وصفنا هنا، ولكن ليس لالخلايا العصبية كبيرة جدا> 60 ميكرومتر في القطر، مثل L7 أو R2 من العقدة في البطن. نحن لا توظف Aplysia المصل في ثقافاتنا، على عكس الحسية العصبون الحركي المشترك الثقافات صفه في مكان آخر. ومعظم الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء أن يكون من دون عمليات لركان أول الموارد البشرية 48 في الثقافة، وتسهيل كامل الخلية تسجيل الجهد، ولكن بعد ذلك سوف تنبت وبلورة المحاور وغيرها من العمليات لحوالي 14 يوما قبل أن يموت من نقص المواد الغذائية و / أو عوامل النمو.

هذه التقنية تنتج الثقافات الأولية من 50-100 الخلايا العصبية في طبق من مناطق موثقة من الناحية الفسيولوجية من العقد الشدق والجنبي. هذا البروتوكول هو مفيد للباحثين دراسة جوانب من علم وظائف الأعضاء خلية واحدة في التجارب التي تتطلب العديد من التجارب مكررات لكل حيوان. وتنتج زوج متطابق من الثقافات بسبب الفصل التشريحي للخلايا المستهدفة في hemiganglia اليسار واليمين، والسماح الدراسات التي تستفيد من العلاج الملائمة والثقافات السيطرة.

بروتوكول يستهدف الشدق S الكتلة (BSC) الخلايا العصبية من العقدة الشدق، والجنبي ventrocaudal (PVC) الخلايا العصبية من العقدة الجنبي. هذه الخلايا هي الحجم المناسب للتسجيلات كله جهد الخلية وrobus العرضر استجابات الجلوتاميرجي. المنهجية التي نوقشت هي مناسبة لمعظم العقد في الجهاز العصبي Aplysia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. في يوم 1، وتزن تخدير الحيوان.
    1. تزن 30 جم، 1 كجم الحيوان. تخدير في حجم الحيوان 5-10 1:1 مياه البحر: MgCl متساوي التوتر. 6H 2 لمدة 1 ساعة مع تحريك مثل مضخة الهواء حوض السمك الكهربائية مع airstone المرفقة 0.
  2. إعداد لوازم تشريح.
    1. تجميع علبة تشريح نظيفة مع الفولاذ المقاوم للصدأ الدبابيس المستقيمة، مثل المسامير النسيج. تجميع عدة أطباق بتري تحتوي على مياه البحر الاصطناعي (ASW؛ انظر الجدولين 1 و 3) + البنسلين / الستربتوميسين (P / S).
    2. هل لديك استعداد لمجهر ضوئي بقوة خفيفة. هل لديك أدوات تشريح نظيفة جاهزة، مثل الأنف مضلع وملقط جراحي غرامة، والغرامة ومقص جراحي كبير. رش الصكوك مع 70٪ isopropol الكحول قبل استخدام والسماح ليجف.
  3. حيوان موقف على علبة تشريح.
    1. موقف الحيوان الجانب البطني أسفل في علبة تشريح. الحيوان دبوسمن خلال حواف جدار الجسم والحدود parapodial، ولكن تجنب الذيل والرأس، لفضح السطح الظهري والأخدود الأعضاء التناسلية
    2. شطف السطح الظهري في بطء تشغيل ماء الصنبور البارد. تطبيق تيار ضوء من 70٪ isopropol الكحول من زجاجة ضغط على طول الأخدود الأعضاء التناسلية وعلى الجزء العلوي من الرأس.
  4. جعل شق الأولي.
    1. باستخدام المجهر منخفضة الطاقة (انظر الجدول رقم 2) والضوء المنعكس لمراقبة نقطة حيث ينشأ أخدود الأعضاء التناسلية من الهامش قذيفة الأمامي، عقد بانشداد مع ملقط مضلع الأنف أضعاف من الأنسجة إلى اليسار من هذا الأصل، بينما القص ضحل حفرة على طول الطريق من خلال، مساحة الشقة السلس للجدار الجسم فقط إلى يمين الأخدود الأعضاء التناسلية مع مقص الزاوية غرامة.
    2. ينبغي مراعاة الدملمف لتصب من الحفرة، تحمل أحيانا معها العقدة في البطن والمعدة.
  5. توسيع شق.
    1. استخدام مقص كبير لتوسيع اله شق الأمامية إلى نقطة بين rhinophores، في حين سحب التصاعدي مع انخفاض شفرة لتجنب الخدش القناة الهضمية. وسيراعى في الأعضاء الداخلية لسفك للخروج من شق.
  6. إزالة العقد.
    1. إعادة الدرج وإعادة تركيز المجهر على منطقة الرأس.
    2. باستخدام ملقط نظيفة ومقص غرامة، وإزالة العقد رئيس بقطع عند نقطة واحدة في الأعصاب التي تشكل العقد رئيس في حلقة حول المريء لإزالة الجنبي-دواسة والدماغية العقد كمجموعة.
    3. إزالة العقدة الشدق أن تلتزم الجانب البطني من المريء.
    4. إزالة العقدة في البطن عن طريق قطع 4 أدوات الوصل العصبية الكبيرة هذه المسألة من هذه العقدة.
  7. عزل العقد من الفائدة.
    1. تقليم العقد الرأس بعيدا، وترك طول من حروف العطف تعلق على كل عقدة من الفائدة التي تساوي على الأقل القطر من العقدة، وهذا سوف تؤخر انزيم الإفراط في الهضممن الخلايا من الفائدة في الخطوة التالية.
    2. وضع كل العقدة الهدف من خلال 2 يشطف من ASW + P / S، والانتقال بين يشطف مع ملقط نظيفة.
    3. إذا استهداف الخلايا PVC، وترك hemiganglion الجنبي حق تعلق على حق hemiganglion دواسة، وترك بالمثل hemiganglion الجنبي اليسار تعلق على hemiganglion دواسة اليسار.
    4. تجاهل العقد غير المرغوب فيها وبقية الحيوانات وفقا للممارسة البحوث المقبولة.
  8. هضم إنزيمي في العقد.
    1. لكل عقدة، وإعداد 1 مل من محلول أنزيم تتألف من 3.75 ملغ dispase، 1 ملغ هيالورونيداز و 0.3 غرام كولاجيناز نوع الحادي عشر لكل مل من ASW + P / S في 15 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية.
    2. مكان تشطف العقد في حل الانزيم ونعلق الغطاء بإحكام. وضع أنبوب على جانبها على شاكر دوارة (انظر الجدول رقم 2) على سرعة بطيئة ل13-5 ساعة بين عشية وضحاها في حوالي 23 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة).
  9. إعدادأطباق الثقافة.
    1. قبل تسليخ مجهري (يوم 2)، وإعداد بولي-D-يسين (PDL) المغلفة أطباق الثقافة في نسيج الثقافة هود. إضافة ~ 0.5 مل PDL (0.2 ملغ / مل من الماء المعقم) إلى وسط صحن 35 ملم ل~ 25 دقيقة.
    2. شطف PDL 3x مع الماء المعقم. السماح ليجف. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم لوحات.
  10. يوم 2 عزل الخلايا العصبية.
    1. ملء وسط 35 ملم الأطباق التي كانت PDL المغلفة والأشعة فوق البنفسجية معقم مع ما يقرب من 0.5 مل من ASW + P / S لإنشاء جزيرة وسائل الإعلام داخل صحن جاف خلاف ذلك. ويمكن أن يتم هذا على مقاعد البدلاء، خارج نسيج الثقافة هود. وينبغي إعداد طبق واحد عن كل مجموعة الخلايا التي تنشأ من hemiganglion.
    2. هل لديك استعداد ل100 مم طبق تشريح أدلى به sylgard طلاء وعلاج لمدة 5 مم عميق سطح تشريح، تجهيزه مع دبابيس تشريح غرامة من عدة أحجام لأن تستخدم الدبابيس وتحقيقات (انظر الجدول 3). شطف هذا الطبق مع 70٪ isopropol الكحول، ثم مع ASW + P / S، وأخيرا فايليرة لبنانية مع ASW + P / S.
  11. إعداد تسليخ مجهري من العقد هضمها.
    1. من أجل حل الانزيم الذي يحتوي على هضمها الجنبي-دواسة والشدق العقد في طبق تشريح.
    2. ضع الطبق على مرحلة من مراحل المجهر ضد السطح الأسود تحت الضوء المنعكس.
    3. استخدام النسيج الضام المرفقة، أحدد كل الجنبي-دواسة hemiganglion الجانب الظهري تصل. فإن الأنسجة تكون لينة وغير متسامحة من التمدد.
  12. Microdissect الخلايا العصبية PVC.
    1. باستخدام 2 أزواج من ملقط غرامة نظيفة، وعقد دبوس تشريح غرامة في زوج واحد من ملقط باعتباره التحقيق، عزل الخلايا PVC من hemiganglion الجنبي. انزيم الهضم سيكون قد إزالة أو تمزق غلاف النسيج الضام الذي يغطي كتلة PVC، ومع ذلك فإن الخلايا سوف تلتزم واحد آخر.
    2. استخدام مسبار لفصل هذه الخلايا من الضام دواسة الجنبي 18، ثم السماح للسقوط كتلة الخلية إلى الجزء السفلي من تشريحطبق.
  13. نقل الخلايا العصبية إلى صحن الثقافة.
    1. نقل الكتلة الخلية إلى المعدة 35 مم طبق الثقافة عن طريق مص بلطف صعودا الكتلة إلى غيض من النار قليلا مصقول ماصة باستير الزجاج القابل للتصرف، ثم الاستغناء ببطء في الجزيرة وسائل الاعلام في صحن الثقافة، والحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء في ماصة. تكرار العزلة من الكتلة PVC من hemiganglion وأماكن أخرى في طبق ثقافة منفصلة.
  14. Microdissect ونقل الخلايا العصبية BSC.
    1. يعلقون بها على الشدق العقدة الجانب البطني أعلى، مع الحرص على تجنيب خلايا الفائدة. كرر الخطوة 1.12 مع 2 BSC مجموعات الخلايا من العقدة الشدق 10.
    2. سوف عزل PVC وBSC الخلايا العصبية تنتج 4 أطباق الثقافة التي تحتوي على مجموعات الخلايا العصبية: 2 الأطباق التي تحتوي على مجموعات BSC و 2 الأطباق التي تحتوي على مجموعات PVC. تجاهل بقية العقد وتوضع جانبا على طبق 100 ملم تشريح.
  15. DissocIATE المجموعات الخلية.
    1. وضع طبق الثقافة التي تحتوي على خلايا في مرحلة مجهر ضوئي بقوة خفيفة وإزالة الغطاء.
    2. فصل الكتلة PVC بواسطة عبها بلطف الجزء السفلي من صحن الثقافة المتاخمة للكتلة الخلية مع دبوس تشريح غرامة عقد في ملقط. عبها يتم حفر غيض من دبوس في البلاستيك من الجزء السفلي من طبق كما لو تحاول انتشال البقعة من البلاستيك. عندما الاحتكاك مع البلاستيك تطلق نقطة دبوس، وينتج موجة قرع من خلال وسيلة أن ينهار في أجمة القريبة من الخلايا.
    3. قد تكون هناك حاجة إلى ما يقرب من 5-10 نقرات تنأى تماما الخلايا، ولكن من الأفضل أن تترك مجموعات صغيرة من الخلايا بدلا من نفض الغبار كثيرا لئلا يتم تدمير الخلايا عن طريق محض الميكانيكية.
    4. محل تغطية وكرر مع أطباق ثقافة أخرى.
  16. تخزين الثقافات الخلية.
    1. ضع الأطباق الثقافة التي تحتوي على الجزر وسائل الإعلام في مراكزهم مع فصل الخلايا فيوعاء كبير أن يسمح دوران الهواء، مثل × 25 ملم جولة البلاستيك طبق بتري 150، ووضع هذا الطبق في مجموعة حاضنة إلى 17 درجة مئوية.
    2. تثبيت في غرفة مفتوحة طبق من الماء كمصدر للرطوبة. ترك بين عشية وضحاها دون عائق. الخلايا سوف تتمسك طلاء بولي-D-يسين في وسط الطبق.
  17. أطباق ثقافة الفيضانات.
    1. في يوم 3، والفيضانات بلطف الأطباق مع 2.5 مل من ASW + P / S. دراسة وعد الخلايا باستخدام المجهر مقلوب خلية ثقافة. متجر في 17 درجة مئوية الحاضنة.

2. الكهربية

الأسلوب هو معيار التصحيح لقط التي تم وصفها في النصوص العديدة (مثل Sakmann وNeher، 1995) 16. سوف يشكل هذا البروتوكول يعمل على خلايا ≤ 100 السعة PF، أو خلايا <60 ميكرومتر في القطر خلال أيام 3 و 4 من البروتوكول. الخلايا دون العمليات هي الأمثل للتسجيل. وconsiderat الخاصة التاليةتطبيق أيونات:

  1. يمكن استيعاب الخلايا أكبر مع إعداد التكوين على مكبر للصوت 200B Axopatch لتعيين β = 0.1. تفعيل تيارات كبيرة جدا قد يسبب الخلايا للهروب المشبك الجهد. حلول ASW بديلا عن محتوى الملح (على سبيل المثال جزء من كلوريد الصوديوم كلوريد استبداله مع كتيمة N-methy-D-glucamine) يمكن استخدامها للحد من كامل السعة الحالية الخلية.
  2. الألياف المليئة ماصات التصحيح البورسليكات سحبت على مجتذب ماصة وردم في منتصف الطريق مع الحل داخل الخلايا (ICS)، ويتألف من 450 ملي بوكل والأملاح الأخرى (انظر الجدول 1) هي مناسبة، وينبغي أن يكون مقاومة من حوالي 0.5-1 MOhms. إذا كان المطلوب عزل التيارات الأيونية محددة، على سبيل المثال، نا + يمكن استبدال التيارات في غياب التيارات K، K + في هذا الحل مع الأيونات الأخرى مثل جيم +. هناك ما يبرر استبدال ICS مع أنيون impermeant أيضا إذا هو المطلوب ICS أكثر طبيعية - CL9.
  3. كانت الخلايا قوية مع> 1 تسجيلات لمدة ساعة ممكن في درجة حرارة الغرفة. تسجيل هو الأمثل في أيام 3 و 4 من البروتوكول، أي ما يعادل 24-48 ساعة في الثقافة. بعد 48 ساعة هناك صعوبة تشكيل الأختام gigaOhm، ربما بسبب وضع الكنان السكري على سطح الخلية، والمشاكل الناجمة عن المشبك الفضاء ثمرة عملية. الخلايا هي مفيدة، ولكن لدراسات المشبك غير التصحيح، مثل علم السموم، والتي يمكن الانتهاء منها في <14 د.
  4. ASW وغيرها من الحلول إلى الاستغناء عن بالجاذبية جهاز حل، فضلا عن حل داخل الخلايا، يجب أن تتم تصفيته من خلال حقنة محمولة على 0.2 ميكرومتر Acrodisk مرشح (الجدول 3) للقضاء على الجسيمات الدقيقة التي تتداخل مع gigaOhm تشكيل الختم.
  5. تحدث الحساسية عند استخدام منبهات مثل D-الأسبارتات (D-ASP)، ولذلك ~ 1-2 دقيقة بين التطبيقات من منبهات ويوصى. وعلى العكس، وغالبا ما لوحظ التقوية مع تطبيق صحيفة السريع المتكررةالموجبة للمنبهات مثل L-الغلوتامات (L-غلو).
  6. ناهض التيارات تفعيلها مثل L-غلو يمكن دراستها عن طريق تطبيق منبهات مع picospritzer ماصة. يتم سحب هذه ماصة نفس ماصة التصحيح ويحتوي ناهض في ASW. عندما يتم وضع هذا غيض من ماصة تحت أنبوب تدفق خطورة الاحتياطي الفيدرالي جهاز حل، وعلى زاوية 45 درجة من أنبوب تدفق (الشكل 2F)، وناهض غسلها بسرعة بعيدا عن الخلية، وسوف يكون الحد الأدنى الحساسية. يجب ماصة ناهض خلق بزاوية 90 درجة أو أكثر نسبة إلى ماصة التصحيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مواقع الخلايا العصبية الحسية في العقد التي تستهدف في هذا البروتوكول، وتظهر الخلايا العصبية BSC وPVC في الشكل 1. توجد الخلايا العصبية BSC في 2 مجموعات متناظرة البيضاوي على الجانب البطني من العقدة الشدق، والسطح الذي يواجه بعيدا عن الكتلة الشدق في العقدة سليمة (الشكل 1A). الخلايا العصبية PVC تشكل، على شكل V مجموعات الثنائية التي يلتف حول السطح الظهري من العقدة الجنبي نحو المحور المركزي (1B الشكل). هذه الخلايا العصبية الحسية لديها ميزة من موقع النمطية ضمن العقد، على الرغم من أن كتلة اليمين أو اليسار مفقود في الحيوانات الفردية في ما يقرب من 1٪ من الحوادث. وBSC وPVC مجموعات الخلايا العصبية يمكن تمييزها من قبل اللون البرتقالي الداكن من غشاء الخلية وصغر حجمها نسبيا مقارنة مع الخلايا المجاورة، كما هو مبين في مخطط دائرة كبيرة من الشكل 1A.

في الثقافة، هذهالخلايا العصبية هي في كثير من الأحيان دون عمليات اليوم بعد الطلاء (الشكل 2A) وتعتبر مثالية للقط التصحيح في ذلك اليوم، وبعد يوم واحد. فمن الممكن في بعض الأحيان لتحقيق المشبك مساحة كافية حتى عندما تظهر الخلايا لديها ثمرة عملية (الشكل 2F)، مما يوحي بأن ليس كل تنبت الذي يبدو أن تنبثق من جسم الخلية هو جزء من الخلية. إذا التعامل مع بعد الهضم الأنزيمي كان لطيف، وخلايا تصل في الثقافة مع بعض عمليات سليمة، وهذه العمليات تنمو مع الوقت (أرقام 2B-2E). مثل هذه الخلايا ليست مناسبة للقط التصحيح ولكن تسجيل داخل الخلايا هو ممكن.

يتم تسجيل كامل الخلية التيارات المشبك التصحيح التي تحملها الجهد بوابات نا + والكالسيوم 2 + بسهولة من الخلايا العصبية PVC وBSC في الثقافة المدى القصير 6، وكلا النوعين الخلية عرض K المختلطة الحالية. الخلايا العصبية BSC أيضا أن تستجيب لأستيل كولين والسيروتونين وNMDA 4 (الشكل 3C ) مع التيارات مثير، في حين أن كلا BSC والخلايا العصبية PVC الرد على L-غلو وD-ASP 3 (أرقام 3A و3B) مع التيارات مثير. وقد وصفت خصائص دوائية من L-غلو والتيارات D-ASP التي يسببها في هذه الخلايا العصبية 4.

الشكل 1
الشكل 1. Photomicrographs تبين الموقف من الخلايا العصبية الحسية الجلوتاميرجي من العقد الشدق والجنبي (الدوائر الحمراء). ألف الشدق S الكتلة (BSC) الخلايا العصبية، التعرف عليها عن طريق اللون البرتقالي الداكن من (دائرة كبيرة على hemiganglion يسار) والموقف المقابل في hemiganglion الحق (دوائر أصغر). B. على شكل حرف V، الظلام أورانج الجنبي ventrocaudal (PVC) كتلة خلية من hemiganglion الجنبي الحق (hemiganglion اليسرى لا تظهر).

العمر = "دائما"> الشكل 2
الشكل 2. وتظهر الخلايا PVC غيرها من الثقافات منفصلة في 24 ساعة كما إدراجات B، C؛ Photomicrographs من الخلايا العصبية الحسية الجلوتاميرجي في الثقافة A. خلايا من الكتلة PVC 24 ساعة بعد الطلاء في صحن الثقافة عرض 2 الخلايا العصبية الحسية والخلايا الأخرى.. A BSC الخلايا العصبية في الثقافة في 24 ساعة ونفس الخلايا العصبية في 96 ساعة، على التوالي. D، E. فالعصبون PVC في الثقافة في 24 ساعة ونفس الخلايا العصبية في 96 ساعة، على التوالي. F. فالعصبون PVC في 48 ساعة في التصحيح المشبك التجربة. ماصة التصحيح يتم الاتصال الخليوي من الحافة اليمنى، في حين أن picospritzer ماصة هو في الجزء السفلي. الظل الداكن كبيرة مرئية لليسار الخلية هو افتتاح ماصة حمام المتدفقة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.

الشكل (3)
الشكل (3). التيارات الجلوتاميرجي كليا التصحيح الخلية التسجيلات المشبك من الخلايا العصبية BSC وPVC. A. خلية كاملة الحالي في إحدى الخلايا العصبية BSC ردا على تطبيق الضغط من L-غلو (1 ملم، و 100 ميللي ثانية). B. خلية كاملة الحالي في إحدى الخلايا العصبية في PVC ردا على تطبيق الضغط من D-ASP (1 ملم، و 100 ميللي ثانية). C. الجامع الخلية NMDA الحالي في نفس الخلية BSC كما في (1 ملم، و 100 ميللي ثانية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التقنيات تفارق الموصوفة هنا تسفر الثقافات الخلايا العصبية الحسية التي تحتوي على الخلايا العصبية معزولة 50-100 تتخللها أعداد صغيرة من الخلايا الدبقية والخلايا الأخرى مجهولة الهوية. الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي المرة تبقى العقد في حل الانزيم، والتحريك، وتفارق من مجموعات الخلايا هضمها لتحطيم الكتلة إلى الخلايا الفردية. يجب أن يكون الأمثل انزيم الهضم (الخطوة 1.8) في درجة الحرارة المتاحة. في 23 درجة مئوية مع الهز بطيئة، 13 ساعة كافية لهضم BSC مجموعات while15 الموارد البشرية هو الأمثل لكتل ​​PVC. ويمكن أن يعزى انخفاض غلة خلية في صحن الثقافة إلى عدم كفاية الوقت في الانزيم، أو الكثير من الاضطراب الميكانيكية خلال إما خطوة نقل الخلية (1.11 و 1.12) أو خلال الخطوة عبها (1.13). فشل الخلايا التمسك صولا الى الركيزة الثقافة، فضلا عن بقاء قصيرة في الثقافة هي عادة بسبب خلل ميكانيكي أكثر من اللازم. تلوث طريق مسدوديمكن أن يحدث أيضا توريس، وأفضل طريقة لمعالجة عن طريق ضمان أن يتم تخدير الحيوان تشطف جيدا، أن الصكوك تشريح نظيفة، وأن يتم وضع العقد من الفائدة من خلال عدة يشطف في ASW + P / S. قد يكون من الضروري لغسل وتنظيف الأدوات الكحول بين أجزاء مختلفة من إجراء تشريح، أو لديك ما يكفي من أدوات جاهزة بحيث منها نظيفة يمكن استخدامها لكل خطوة.

وغالبا ما تجري Aplysia الدراسات العصبية الحيوية على تقليل الاستعدادات التي تحافظ على الاتصالات العصبية بين الخلايا العصبية أو بين الخلايا العصبية والعضلات 2، 18. هذه الاستعدادات تسهيل مهمة السيطرة على العمليات العضلات إلى خلايا عصبية محددة ودوائر الخلايا العصبية وتسمح أيضا دراسات من التقوية وتيسير ردود الافعال المتكررة. ليست مناسبة الاستعدادات سليمة لأنواع معينة من البروتوكولات المشبك الجهد ودراسة آثار منبهات أن توعي بسرعة مستقبلاتها.

على المدى الطويل العصبية المشارك الثقافة هي أداة إضافية لدراسة التقوية وتيسير تحت ظروف خاضعة للرقابة إلى حد كبير. على المدى الطويل إقراض المشترك الثقافات أيضا أنفسهم لدراسات كيميائية حيوية على الخلايا العصبية واحدة. وغالبا ما تنسب نجاح إعداد الثقافة المشتركة إلى إضافة ما يصل إلى 50٪ الدملمف Aplysia على الثقافات 17. ومع ذلك، فإن نجاح هذا النهج في كثير من الأحيان يعتمد على التباين دفعة إلى دفعة من هذه الدملمف.

وفصلها خلية إعداد ثقافة الموصوفة هنا يوسع ذخيرة استخدام نموذج Aplysia. مزارع الخلايا نأت ليست مناسبة للاستنتاج الدوائر العصبية أو دراسة المشبك سليمة وأساليب المذكورة أعلاه القيام به. إعداد خلية ثقافة فصلها لديه أعظم فائدته في تأكيد وجود المواصلة الأيونية المحددة وخصائصها الحركية والدوائية في الخلية الجهد تجارب المشبك واحد. بغازيوقد تم اكتشاف التيارات فريدة من نوعها األطراف استخدام مستحضرات خلية واحدة، بما في ذلك الموجبة مثير الحالي في خلايا كيس (19) ومستقبلات D-ASP الحالي في BSC الخلايا العصبية 4. نادرا ما تركز الدراسات على Aplysia على التيارات الأيونية من الخلايا الفردية، وذلك جزئيا بسبب حجم غير عملي في كثير من الأحيان من مثل هذه الخلايا، ووجود العديد من أنواع الخلايا نموذج مناسب الأخرى التي تصلح جيدا لرأب الصدع تقنيات المشبك. ونتيجة لذلك، يتم عادة الاستدلال على وجود بعض التيارات في Aplysia، مثل تلك تفعيلها من خلال حمض ألفا الأمينية-3-الهيدروكسيل-5-الميثيل-4-isoxazole-البروبيونيك (أمبا) من كتلة من المفترض أمبا مستقبلات (R) السلوكيات ذات الصلة من قبل الخصوم AMPAR تطبيقها على إعداد العصب مخفضة، بدلا من تسجيلها مباشرة. وبالتالي التحقق من وجود بعض التيارات غير متوفرة. عزل الخلايا العصبية مستقبلات الخلية مثقف ومنهجية المشبك الجهد واحدة يوفر الاختبار المباشر لوجودأنواع مختلفة من القنوات L-GluR في هذا النموذج الحي.

استخدام آخر من الخلايا العصبية Aplysia في الخلية التصحيح التجارب المشبك واحد هو في تشريح شلالات رسول الثانية. Aplysia الخلايا العصبية هي مناسبة بشكل خاص للدراسات من رسول الثاني الناجم عن التشكيل لأنها مستقرة لفترات طويلة من تسجيل في درجة حرارة الغرفة 3، 12، 20، 21 ، وتكون قوية بما فيه الكفاية أن الخلايا الفردية يمكن حفظها بعد تسجيل وسجلت من جديد بعد 24 ساعة 5. هذه المجموعات والخلايا العصبية الحسية الشدق الجنبي تسفر مريح زوج من الثقافات المتطابقة من كل عقدة، بحيث طبق واحد يمكن أن يكون المعين ثقافة السيطرة في حين يتلقى زميله في العلاج.

ميزة إضافية من هذا التحضير هو في دراسات حالة المورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية. على سبيل المثال، اكتشفنا أن الهيئات خلية من الخلايا العصبية Aplysia من الحيوانات هرمة كانت لارلم GER من تلك التي من الحيوانات الأصغر سنا، ولكن لم يقدم اي تفاصيل عمليات الخلية بعد عدة أيام في الثقافة 6. هذه الاستعدادات الخلايا العصبية معزولة أيضا تسهيل الدراسات باستخدام الأصباغ الحيوية لتقييم مستويات الخلايا الكالسيوم +2، ودرجة الحموضة، أنواع الاكسجين التفاعلية، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا والصفات الفسيولوجية الأخرى التي يمكن بعد ذلك مقارنة مع ميزات العصبية من الخلايا الفردية. في حين أن بعض من هذه الأساليب قابلة للتطبيق في الاستعدادات سليمة أو ثقافة مشتركة، وجمع البيانات هو أكثر من ذلك بكثير مباشرة باستخدام الخلايا العصبية معزولة في هذا النظام ثقافة سهلة. في المستقبل ونأمل في استخدام هذه الخلايا لخلية واحدة التنميط الجزيئي 13.

يوفر ثقافة فصلها على المدى القصير المادة المثالية لتحقيق العمليات الفسيولوجية العصبية الأساسية، ويمكن أن توفر أداة قوية بشكل خاص عندما تستخدم بالاقتران مع الدراسات التي تنطوي على خفض أو مستحضرات ثقافة مشتركة. ونأتAplysia العصبية ثقافة تمتد فائدة هذا النموذج الحيواني الجليلة إلى مناطق جديدة ومثيرة للاهتمام في علم الأعصاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة P40 OD010952، ومؤسسة Korein، في جامعة ميامي زمالة إلى SLC وزمالة مايتاغ إلى ATK. المؤلفين الامتنان موظفي الموارد الوطنية للAplysia، وكذلك لورين Simonitis وهانا بيك، الذين قدموا الميكروسكوب لشخصية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar  
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)  
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild  
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer  
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.  
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices  
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA  
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA  
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA  
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH  
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek  
Faraday cage custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA  
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - WPI 1B150-3  
3 inch length  
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 Becton-Dickinson For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA For perfusion system
one-way valves For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)  
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100 fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store  
dish holder for microscope stage with isolated ground bath Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator  

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
  2. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
  3. Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
  4. Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
  5. Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
  6. Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
  7. Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
  8. Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
  9. Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
  10. Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
  11. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  12. Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
  13. Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
  14. R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  15. Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
  16. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
  17. Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
  18. Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
  19. Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
  20. Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
  21. White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
  22. Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
  23. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).

Tags

علم الأعصاب، العدد 77، بيولوجيا الأعصاب، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأحياء الخلوية والبيولوجيا الجزيئية والعلوم البيئية، علم الأحياء البحرية، والمستقبلات، الفسيولوجيا العصبية، العصبي، وكلاء العصبي، تسجيلات المشبك التصحيح والثقافة الخلية الأولية، الكهربية، L-الغلوتامات، NMDA، D- اسبارتاتي، تشريح، العقد، العقدة الشدق، الخلايا العصبية، اللافقارية،
عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fieber, L. A., Carlson, S. L.,… More

Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter