Summary
Vi beskriver dissektion af nervesystemet af havmiljøet søharen
Abstract
Det marine havsnegle mollusk Aplysia californica har en ærværdig historie som en model af nervesystemet funktion, med særlig betydning i studier af indlæring og hukommelse. De typiske forberedelser til sådanne undersøgelser er dem, hvor sensoriske og motoneurons er tilbage intakt i en minimalt dissekeret dyr eller en teknisk kompliceret neuronal co-kultur for individuel sensoriske og motoneurons. Mindre almindelige er den isolerede neuronal forberedelse, hvor små klynger af nominelt homogene neuroner er dissocieret til enkelte celler i kort sigt kultur. Sådanne isolerede celler er anvendelige til biofysiske karakterisering af ionstrømme med patch clamp teknikker og målrettet modulering af disse konduktanser. En protokol til fremstilling af sådanne kulturer er beskrevet. Protokollen tager fordel af de let identificerbare glutamaterge sensoriske neuroner i pleural og bukkale ganglier og beskriver deres afstandtagen og minimal vedligeholdelse in kultur i flere dage uden serum.
Introduction
De marine opistobranch mollusk, Aplysia har været et nyttigt neurobiologiske model i mange årtier. Det er bedst kendt som en model for tilvænning og klassisk konditionering 7, 8. Undersøgelser på indlæring og hukommelse i denne model vandt Nobelprisen i fysiologi eller medicin i 2000 for Eric R. Kandel, i en præmie han delte med Arvid Carlsson og Paul Greengard 10.. Undersøgelser, der involverer elektriske optagelser fra reducerede præparater, hvor elementer i nervesystemet denne hvirvelløse dissekeres fra dyret med nerver og muskler forlod tilknyttet, har hjulpet belyse roller enkelte neuroner i Aplysia. Identifikation af præcise molekylære mekanismer, der udgør læring i Aplysia dog ofte beskæftiget anden teknik langsigtede co-kulturer af en sensorisk neuron og en motoneuron, opnået en efter en fra individuelle donordyr og tilladt at danne en synapse i dyrkningsskålen 21 .
Vi og andre 1, 3, 6, 14, 15, har 16 udnyttet den lethed, hvormed identificerede neuroner kan målrettes i denne model samt deres udholdenhed i langsigtede eksperimenter at gøre dissocierede kortsigtede kulturer af klynger af nominelt homogene neuroner hvor vi studere ionstrømme under spænding klemme i patch-clamp-konfiguration. Mange Aplysia neuroner stå op til gentagne runder af patch fastspænding at give tid til langvarige eksperimentelle manipulationer. Teknikken er nyttig til neuroner såsom neurosekretionsceller pose celler abdominale ganglion, og de sensoriske neuroner pleura og bukkale ganglier hvis dissociation vi beskriver her, men ikke for meget store neuroner> 60 um diameter, såsom L7 eller R2 i abdominal ganglion. Vi ansætter ikke Aplysia serum i vores kulturer, i modsætning til de sensorisk-motoneuron co-kulturer beskrevet andetsteds. De fleste neuroner opnået ved hjælp af denne procedure vil være uden processer til than først 48 timer i kultur, lette hel celle spænding optagelse, men vil så spire og uddyber axoner og andre processer til cirka 14 dage før at dø af mangel på næringsstoffer og / eller vækstfaktorer.
Denne teknik producerer primære kulturer af 50-100 neuroner pr skål fra fysiologisk dokumenterede områder af mundhulen og pleural ganglier. Denne protokol er nyttig for forskere studerer aspekter af enkelt celle fysiologi i eksperimenter, der kræver talrige forsøgsgentagelser per dyr. Det producerer en udparret kulturer på grund af anatomiske adskillelse af målcellerne i venstre og højre hemiganglia, tillader undersøgelser, der nyder godt matchede behandling kulturer og kontrolkulturerne.
Protokollen mål buccale S klynge (BSC) neuroner i mundhulen ganglion og pleurale ventrocaudal (PVC) neuroner i pleural ganglion. Disse celler er en passende størrelse for hele cellespændingsværdier optagelser og display Robust glutamaterge responses. Den diskuterede metode er passende for de fleste ganglier i Aplysia nervesystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cell Preparation
- På dag 1, vejes og bedøver dyr.
- Vejer 30 g-1 kg dyr. Bedøve i 5-10 dyr volumener 01:01 havvand: isotonisk MgCl. 6H 2 0 i 1 time med beluftning såsom en elektrisk akvarium luftpumpe med vedhæftede airstone.
- Forbered dissektion forsyninger.
- Saml ren dissektion bakke med rustfrit stål cylinderstifte, såsom stof ben. Saml flere petriskåle, der indeholder kunstige havvand (ASW, se tabel 1 og 3) + penicillin / streptomycin (P / S).
- Har klar en lav effekt mikroskop. Har ren Dissektionsinstrumenter klar, såsom ribbede næse og fine kirurgiske pincet og fint og store kirurgiske saks. Spray instrumenterne med 70% isopropol alkohol før brug og lad det tørre.
- Position dyr på dissektion bakke.
- Position dyr ventrale nedad i dissektion bakken. Pin dyrgennem kanterne af kroppens væg og parapodial grænser, men undgå hale og hoved, for at eksponere den dorsale overflade og genital rille
- Skyl den dorsale overflade i slow-rindende koldt vand fra hanen. Påfør en lys strøm af 70% isopropol alkohol fra en sprøjteflaske langs den genitale rille og over toppen af hovedet.
- Gør det oprindelige snit.
- Ved hjælp af en lav effekt mikroskop (se tabel 2) og reflekteret lys til at observere det punkt, hvor den genitale rille stammer fra den forreste skallen margen, stramt fat med ribbede-næse pincet en fold af væv til venstre for denne oprindelse, mens snipping en lavvandet i hul hele vejen igennem den glatte, flade område af kroppen væggen lige til højre for den genitale rille med fine vinklede saks.
- Hæmolymfe bør overholdes for at hælde fra hullet, undertiden transporterer med det abdominale ganglion og maven.
- Udvid snittet.
- Brug store saks til at udvide the indsnit fortil til et punkt mellem rhinophores, at mens trækker opad med den nederste blad undgå huldannelse tarmen. De indre organer vil blive observeret for at spill ud af snittet.
- Fjern ganglier.
- Placer bakken og koncentrere mikroskopet på hovedet regionen.
- Brug rene pincet og fine saks, fjerne hovedet ganglier ved overskæring på et tidspunkt de nerver, der danner hovedet ganglier i en ring omkring spiserøret for at fjerne pleural-pedal og cerebral ganglier som en gruppe.
- Fjern den bukkale ganglion der klæber til den ventrale side af spiserøret.
- Fjern abdominal ganglion ved at skære de 4 store nerve connectives der udsteder fra denne ganglion.
- Isoler ganglier af interesse.
- Trim hoved ganglier hinanden og efterlader en længde på connectives knyttet til hver ganglion af interesse, der er lig med mindst diameter ganglion, og dette vil forsinke enzym over-fordøjelseaf cellerne af interesse i det næste trin.
- Put hvert mål ganglion gennem 2 skylninger af ASW + P / S, der flytter mellem skylninger med rene pincet.
- Hvis målrette PVC celler forlader højre pleural hemiganglion fastgjort til højre pedal hemiganglion, og tilsvarende forlader venstre pleural hemiganglion knyttet til den venstre pedal hemiganglion.
- Kassér uønsket ganglier og resten af dyr ifølge accepteret forskning praksis.
- Enzymatisk fordøje ganglier.
- For hver ganglion, forberede 1 ml enzymopløsning bestående af 3,75 mg dispase, 1 mg hyaluronidase og 0,3 g collagenase typen XI pr ml ASW + P / S i en 15 ml polypropylen konisk rør.
- Placer skyllet ganglier i enzym-opløsning, og fastgør låg. Glasset anbringes på siden på et roterende rysteapparat (se tabel 2) ved langsom hastighed i 13-5 timer natten over ved omtrent 23 ° C (stuetemperatur).
- Forbereddyrkningsskåle.
- Før mikrodissektion (dag 2), forberede poly-D-lysin (PDL)-belagt kultur retter i en vævskultur hætte. Tilføj ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml sterilt vand) til midten af en 35 mm skål til ~ 25 min.
- Skyl PDL 3x med sterilt vand. Lad det tørre. UV-sterilisere pladerne.
- Dag 2 Isoler neuroner.
- Fyld midten af 35 mm retter, der var PDL-coated og UV steriliseret med cirka 0,5 ml ASW + P / S for at skabe en ø af medier inde i ellers tørre skålen. Dette kan gøres på bænken, uden vævskultur hætte. En skål bør udarbejdes for hver celle klynge stammer fra en hemiganglion.
- Har klar en diameter på 100 mm dissektion fad lavet af Sylgard-belægning og helbredelse af en 5 mm dyb dissektion overflade udstyret med fine dissektion stifter af flere størrelser, der skal anvendes som stifter og sonder (se tabel 3). Skyl denne parabol med 70% isopropol alkohol, derefter med ASW + P / S, og endelig fill det med ASW + P / S.
- Forbered mikrodissektion af fordøjet ganglier.
- Hæld enzymopløsningen indeholdende det fordøjede pleural-pedalen og bukkal ganglier i dissektion skålen.
- Sæt fadet på scenen af mikroskopet mod en sort overflade under reflekteret lys.
- Brug den vedlagte bindevæv, pin ned hver pleura-pedal hemiganglion dorsalsiden op. Væv bliver bløde og intolerante over for stretching.
- Microdissect PVC neuroner.
- Brug 2 par af rene fine tænger, og holde en fin dissektion pin i en tang som en sonde, isolere PVC celler fra en pleural hemiganglion. Fordøjelse vil have fjernet eller brudt fra hinanden bindevævshinde dækker PVC klynge, men cellerne vil klæbe til hinanden.
- Brug sonden at frigøre disse celler fra pedalen-pleural bindevæv 18, så lad celle klynge falde til bunden af dissektionskål.
- Overførsel neuroner til dyrkningsskål.
- Overfør celle klynge til en tilberedt 35 mm dyrkningsskål ved forsigtigt at suge op klyngen i spidsen af et svagt brand poleret engangs glas Pasteur-pipette, så dispensering det langsomt i mediernes ø i en kultur fad, være omhyggelig med at undgå at indføre luftbobler ind i pipetten. Gentag isolering af PVC klynge af den anden hemiganglion og anbringes i en separat kultur skål.
- Microdissect og overføre BSC neuroner.
- Pin ud buccale ganglion ventrale side op, med omhu for at skåne cellerne af interesse. Gentag trin 1.12 med de 2 BSC celle klynger af den bukkale ganglion 10.
- Isolering af PVC og BSC neuroner vil producere 4 dyrkningsskålene indeholder neuron klynger: 2 retter, der indeholder BSC klynger og 2 skåle, der indeholder PVC klynger. Kassér resten af ganglier og der er afsat 100 mm dissektion fad.
- DissocIATE cellen klynger.
- Placer en kultur skål indeholdende celler på scenen af lav effekt mikroskop og fjern dækslet.
- Dissociere PVC klynge ved forsigtigt at knipse bunden af dyrkningsskålen støder op til celle klynge med en fin dissektion tap, som pincet. Flicking graver spidsen af stiften i plasten af bunden af skålen, som om at forsøge at grave en fleck af plast. Når friktionen med plastik frigiver pin punkt er et percussion bølge produceret gennem det medium, der bryder ud den nærliggende klump af celler.
- 5-10 svip kan være nødvendig til næsten fuldstændigt dissociere cellerne, men det er bedre at efterlade små klynger af celler snarere end at svippe for meget lest cellerne ødelægges ved mekanisk spring.
- Sæt dækslet og gentag med andre kultur retter.
- Opbevar cellekulturer.
- Placer dyrkningsskålene indeholdende medier øer i deres centre med dissocierede celler inden stor container, der tillader luftcirkulation, såsom en 150 x 25 mm runde plastik petriskål, og placer denne parabol i en inkubator indstillet til 17 ° C.
- Installere i kammeret en åben skål af vand som en kilde til fugtighed. Efterlad uforstyrret natten over. Cellerne vil klæbe til poly-D-lysin belægning i midten af skålen.
- Flood kultur retter.
- På dag 3, oversvømme forsigtigt retter med 2,5 ml ASW + P / S. Undersøg og tæl cellerne under anvendelse af en inverteret cellekultur mikroskop. Opbevares i den 17 ° C inkubator.
2.. Elektrofysiologi
Fremgangsmåden er standard patch fastspænding, der er blevet beskrevet i talrige tekster (f.eks Sakmann og Neher, 1995) 16.. Denne protokol vil arbejde på celler ≤ 100 pF kondensator, eller cellerne <60 um diameter under dag 3 og 4 i protokollen. Celler uden processer er optimale for optagelse. Følgende særlige GENNEMGANGioner anvendelse:
- Større celler kan rummes med konfigurationen indstillingen på Axopatch 200B forstærker sat til β = 0,1. Aktivering af meget store strømme kan forårsage celler at undslippe spændingsklemme. ASW løsninger erstattes saltindhold (fx en brøkdel af NaCl substitueret med impermeabel N-methyl-D-glucamin-chlorid) kan anvendes til at reducere helcelle strømamplitude.
- Fiberfyldte borsilicat patch pipetter trukket på en pipette aftrækker og efterfyldes halvvejs med intracellulær opløsning (ICS) bestående af 450 mM KCI og andre salte (se tabel 1) er egnede, og de bør have modstand på ca 0,5-1 MOhm. Hvis isolering af specifikke ionstrømme ønskes, for eksempel Na +-strømme i fravær af K strømme, K + i denne opløsning kan erstattes med andre ioner, såsom Cs +. Cl - udskiftning af ICS med en impermeabel anion også berettiget, hvis en mere naturlig ICS ønskes9..
- Cellerne er robuste> 1 time lange optagelser mulige ved stuetemperatur. Optagelse er optimal på dag 3 og 4 i protokollen, svarende til 24-48 hr i kultur. Efter 48 timer er der svært at danne gigaohm sæler, måske på grund af udarbejdelsen af en glycocalyx på celleoverfladen, og plads klemme problemer forårsaget af proces udvækst. Cellerne er nyttige, men for ikke-patch clamp-forsøg, såsom toksikologi, som kan være afsluttet i <14 d.
- ASW og andre løsninger, der skal dispenseres fra tyngdeføres opløsningen enhed, samt intracellulær opløsning, bør filtreres gennem en sprøjte monteret 0,2 um Acrodisk filter (tabel 3) for at fjerne fine partikler, som interfererer med gigaohm segl formation.
- Desensibilisering opstået ved brug af agonister, såsom D-aspartat (D-Asp), derfor ~ 1-2 minutter mellem anvendelser af agonister anbefales. Omvendt potensering ofte observeret med hurtig gentagen ansøgningkation af agonister, såsom L-glutamat (L-Glu).
- Agonist aktiverede strømme såsom L-Glu kan studeres ved at anvende agonister med picospritzer pipette. Denne pipette trukket samme som patch-pipetten og indeholder agonist ASW. Når spidsen af denne pipette anbragt under afgangsrøret af tyngdeføres opløsningen enhed, og ved en 45 ° vinkel fra afgangsrøret (fig. 2F), vil agonist hurtigt skyllet væk fra cellen, og desensibilisering vil blive minimeret. Agonist pipette skabe en vinkel på 90 ° eller mere i forhold til patch-pipetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Placeringerne af de sensoriske neuroner i ganglier, der er målrettet i denne protokol, er BSC og PVC neuroner vist i figur 1.. De BSC neuroner ligger i 2 symmetriske ovale klynger på den ventrale side af den bukkale ganglion, den overflade, der vender bort fra den bukkale masse i intakte ganglion (figur 1A). PVC neuroner danner bilaterale, V-formede klynger at wrap omkring den dorsale overflade af pleural ganglion mod den centrale akse (figur 1B). Disse sensoriske neuroner har den fordel af en stereotyp placering i ganglier, selvom den højre eller venstre klynge mangler hos enkelte dyr i cirka 1% af hændelser. BSC og PVC neuron klynger kan identificeres ved den mørke orange farve på cellemembranen og relativt lille størrelse i forhold til nærliggende celler, som vist i den store kreds omridset af figur 1A.
I kultur, disseneuroner er ofte uden processer dagen efter plating (figur 2A) og er ideelle til patch fastspænding den dag, og en dag senere. Det er undertiden muligt at opnå tilstrækkelig plads klemme selv når cellerne synes at have proces udvækst (figur 2F), tyder på, at ikke alle spiring der synes at hidrøre fra cellen organ er en del af cellen. Hvis håndteringen efter enzymatisk fordøjelse har været blid, celler ankommer i kultur med nogle processer intakte og disse processer vokse med tiden (figur 2B-2E). Sådanne celler er ikke egnede til patch fastspænding men intracellulær optagelse er mulig.
Helcelle patch clamp strømme båret af spænding gated Na + og Ca 2 + er let optaget fra PVC og BSC neuroner i kortsigtet kultur 6, og begge celletyper vise en blandet K strøm. BSC neuroner også reagere på acetylcholin, serotonin og NMDA 4 (figur 3C) Med excitatoriske strømme. Mens både BSC og PVC neuroner reagerer på L-Glu og D-Asp 3 (fig. 3A og 3B) med excitatoriske strømme De farmakologiske egenskaber af L-Glu-og D-Asp-inducerede strømme i disse neuroner er blevet beskrevet 4.
Figur 1. Mikrofotografier viser placeringen af glutamaterge sensoriske neuroner i den bukkale og pleural ganglier (røde cirkler). A. bukkale S klynge (BSC) neuroner, er kendetegnet ved deres mørk orange farve (stor cirkel på venstre hemiganglion) og den tilsvarende position i højre hemiganglion (mindre cirkler). B. V-formet, mørk orange pleural ventrocaudal (PVC)-celle klynge af retten pleural hemiganglion (venstre hemiganglion ikke vist).
Figur 2. Mikrofotografier af glutamaterge sensoriske neuroner i kultur A. Celler fra PVC klynge 24 timer efter udpladning i dyrkningsskål viser 2 sensoriske neuroner og andre celler,. Øvrige PVC celler fra separate kulturer på 24 timer er vist som indsatse B, C.. En BSC neuron i kultur ved 24 hr og samme neuron på 96 timer, hhv. D, E. A PVC neuron i kultur ved 24 hr og samme neuron på 96 timer, hhv. F. A PVC neuron ved 48 hr i en patch clamp eksperiment. Patch-pipetten er at kontakte cellen fra den højre kant, mens picospritzer pipetten er nederst. Den store mørk skygge synlig til venstre for cellen er åbningen af den strømmende bad pipette. Klik her for at se større figur.
Figur 3. Glutamaterge strømninger i helcelle patch clamp optagelser fra BSC og PVC neuroner. A. Hel celle strøm i en BSC neuron som reaktion på presset anvendelse af L-Glu (1 mM, 100 ms). B. Hele celle strøm i en PVC neuron i reaktion på tryk anvendelse af D-Asp (1 mM, 100 ms). C. Helcelle NMDA strøm i samme BSC celle som i A (1 mM, 100 ms).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissociationen teknikker beskrevet her, giver sensoriske neuron kulturer indeholdende 50-100 isolerede neuroner spækket med små antal af glia og andre uidentificerede celler. De mest kritiske trin i protokollen er det tidspunkt, hvor ganglier forblive i enzym-løsning, og zappe, dissociation af de spaltede celleklynger at bryde ud klyngen i individuelle celler. Fordøjelse (trin 1.8) skal optimeres ved den tilgængelige temperatur. Ved 23 ° C med langsom rystning, 13 hr er tilstrækkelig til fordøjelse af BSC klynger while15 hr er optimal for PVC klynger. Lavt celleudbytter i dyrkningsskålen kan tilskrives utilstrækkelig tid i enzym eller for meget mekanisk sprængning under enten celleoverføringen trin (1.11 og 1.12) eller under flicking trin (1,13). Svigt af cellerne til at holde ned til dyrkningssubstrat, samt korte overlevelse i kultur er normalt på grund af for meget mekanisk sprængning. Forurening af culturer kan også forekomme, og er bedst løses ved at sikre, at den bedøvede dyr er godt skyllet, at Dissektionsinstrumenter er rene, og at ganglier af interesse er sat gennem flere skylninger i ASW + P / S. Det kan være nødvendigt at vaske og alkohol-rene instrumenter mellem forskellige dele af dissektion procedure, eller har nok instrumenter klar, så at ren dem kan anvendes for hvert trin.
Aplysia neurobiologiske studier er oftest udført på reducerede præparater, der bevarer nerve forbindelser mellem neuroner eller mellem neuroner og muskler 2, 18. Disse præparater letter tildelingen af styring af muskulære processer til bestemte neuroner og neuronale kredsløb og muliggøre undersøgelser af potensering og facilitering af gentagne reflekser. Intakte præparater er ikke egnet til visse typer spænding clamp protokoller og studiet af virkningerne af agonister, der hurtigt desensitize deres receptorer.
Den langsigtede neuronal co-kultur er et supplerende redskab til at studere potensering og facilitering under meget kontrollerede forhold. Langsigtet co-kulturer også egner sig til biokemiske undersøgelser af enkelte neuroner. Succes af co-kultur forberedelse er ofte tilskrives tilsætning af op til 50% Aplysia hemolymph til kulturer 17. Men succesen af denne metode afhænger ofte batch-til-batch variation for denne hemolymph.
Den dissocieret cellekultur forberedelse beskrevet her udvider brugen repertoire Aplysia modellen. Dissocierede cellekulturer er ikke egnet til at udlede neurale kredsløb eller studere intakte synapse som de ovenfor nævnte fremgangsmåder gøre. Den dissocieret cellekultur forberedelse har sin største nytte i at bekræfte eksistensen af specifikke ioniske konduktanser og deres kinetiske og farmakologiske egenskaber i encellede spænding clamp eksperimenter. Sevrelle unikke strømme er blevet opdaget ved hjælp af encellede præparater, herunder en excitatorisk kation strøm i pose celler 19 og D-Asp receptor strøm i BSC neuroner 4.. Undersøgelser om Aplysia sjældent fokus på ionstrømmene af de enkelte celler, dels på grund af de ofte uhåndterlige størrelse af sådanne celler og eksistensen af en lang række andre egnede model celletyper, der egner sig godt til patch clamp teknikker. Som et resultat heraf er forekomsten af visse strømme i Aplysia, såsom dem aktiveres ved alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionsyre (AMPA) sædvanligvis udledes blok af formodet AMPA-receptoren (R) -relateret adfærd efter AMPAR antagonister anvendes til den reducerede nerve forberedelse, snarere end direkte registreret. Således verifikation af forekomsten af visse strømninger mangler. Isolering af dyrkede glutamaterge neuroner og enkelt celle spænding clamp metode giver en direkte test for tilstedeværelsen afforskellige typer af L-GluR kanaler i denne model organisme.
En anden anvendelse af Aplysia neuroner i encellede patch clamp eksperimenter er i dissekere second messenger kaskader. Aplysia neuroner er særligt velegnet til studier af anden messenger induceret modulation fordi de er stabile i lange perioder optagelse ved stuetemperatur 3, 12, 20, 21 , og er tilstrækkeligt robust, så individuelle celler kan gemmes efter optagelse og optaget fra igen efter 24 timer 5.. Disse buccale og pleural sensoriske neuron klynger bekvemt give et par af matchede kulturer fra hvert ganglion, således at den ene parabol kan betegnes en kontrolkultur mens dens mage modtager en behandling.
En yderligere fordel ved dette præparat er i undersøgelser af den morfologiske status for individuelle neuroner. For eksempel opdagede vi, at cellelegemer af Aplysia neuroner fra senescent dyr var LARger end dem fra yngre dyr, men kom ikke nærmere celle processer efter flere dage i kultur 6.. Disse isolerede neuron præparater også lette undersøgelser med vitale farvestoffer til at vurdere niveauet af intracellulært Ca +2, pH, reaktive oxygenarter, mitrokondriemembranen og andre fysiologiske træk, der derefter kan sammenlignes med neurofysiologiske funktioner i individuelle celler. Mens nogle af disse tilgange er gældende i intakt eller co-kultur præparater, dataindsamling er meget mere ligetil at bruge isolerede neuroner i denne let kultur system. I fremtiden håber vi at bruge disse celler til en enkelt celle molekylær profilering 13..
Den dissocierede kortsigtede kultur giver ideelle materiale for at undersøge fundamentale neurofysiologiske processer, og kan give et særligt effektivt redskab, når det bruges i forbindelse med undersøgelser med reduceret eller co-kultur præparater. Den dissocieredeAplysia neuron kultur udvider anvendeligheden af denne ærværdige dyremodel til nye og interessante inden for neurologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansieret af NIH P40 OD010952 den Korein Foundation, en University of Miami Fellowship til SLC og et Maytag stipendium til at ATK. Forfatterne takker personalet for National Resource for Aplysia samt Lauren Simonitis og Hannah Peck, der leverede mikrografier til en figur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
