Summary
Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif
Abstract
Deniz gastropod yumuşakça Aplysia californica öğrenme ve hafıza çalışmaları özellikle öneme sahip, sinir sistemi fonksiyonu bir model olarak bir saygıdeğer bir geçmişi vardır. Bu tür çalışmalar için tipik hazırlıkları duyusal ve motor nöronlar minimal disseke hayvan değişmeden kalır, ya da bireysel duyusal ve motor nöronlar bir teknik olarak nöronal ko-kültür edildiği olanlardır. Daha az görülen sözde homojen nöronların küçük kümeler kısa vadeli kültüründe tek hücrelere ayrışmış olduğu izole nöronal hazırlıktır. Bu tür izole edilmiş hücreler yama kıskaç teknikleri ve bu iletkenlikleri hedef modülasyonu kullanılarak iyon akımlarının biyofiziksel karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür kültürlerde hazırlanması için bir protokol açıklanmıştır. Protokol plevra ve yanak ganglion kolayca tanımlanabilir glutamaterjik duyu nöronlarının yararlanır ve bunların ayrışma ve minimum bakım açıklar iserumsuz birkaç gün boyunca N kültürü.
Introduction
Deniz opistobranch yumuşakça, Aplysia, onlarca yıl için yararlı bir nörobiyolojik model olmuştur. Bu iyi alışkanlık ve klasik koşullanma 7, 8 modeli olarak bilinir. Bu modelde öğrenme ve hafıza ile ilgili çalışmalar o Arvid Carlsson ve Paul Greengard 10 ile paylaşılan bir ödül, Eric R. Kandel için 2000 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandı. Düşük hazırlıkları elektrik kayıtları içeren çalışmalar, hangi bu omurgasız ve sinir sisteminin unsurları sinirleri ile hayvan disseke ve kasların tutunduğu, Aplysia bireysel nöronların rollerini aydınlatmak yardımcı olmuştur bıraktı. Aplysia öğrenme teşkil hassas moleküler mekanizmaların belirlenmesi Ancak, çoğu zaman bireysel donör hayvanlardan tek tek elde edilen başka bir teknik, uzun vadeli bir duyusal nöron eş-kültür ve bir motonöron, istihdam ve kültür çanak 21 bir sinaps oluşturmak için izin .
Biz ve diğerleri 1, 3, 6, 14, 15, 16 nöronlar sözde homojen nöron kümeleri ayrışmış kısa vadeli kültürleri yapmak için uzun vadeli deneylerde de kendi dayanıklılık gibi bu modelde hedeflenebilir tespit hangi ile kolaylığı istismar var hangi biz yama kelepçe yapılandırmasında gerilim kelepçe altında iyonik akımların çalışma. Birçok Aplysia nöronlar uzun süreli deneysel manipülasyonlar için zaman tanımak için sıkma yama tekrar mermi stand up. Bu teknik, örneğin, karın ganglion Nörosekretor torba hücreleri ve ayrışma burada açıklandığı plevral ve yanak ganglion sensor nöronları olarak nöronlar için yararlıdır, fakat çok büyük nöronlar> 60 mikron gibi L7 gibi çapı ya da R2 karın ganglion. Biz başka bir yerde tanımlanan duyusal-motor nöron ko-kültür aksine, bizim kültürlerde Aplysia serum istihdam yok. Bu işlem kullanılarak elde edilen en nöronlar t işlemleri olmadan olacako tüm hücre voltajı kayıt kolaylaştırmak kültüründe ilk 48 saat,, ama sonra filiz ve besin ve / veya büyüme faktörlerinin eksikliği nedeniyle ölme önce yaklaşık 14 gün boyunca akson ve diğer işlemler ayrıntılı olacaktır.
Bu teknik, bukkal ve plevral gangliyon fizyolojik olarak belgelenmiş bölgelerinden tabak başına 50-100 nöronlarının birincil kültürleri üretir. Bu protokol, araştırmacılar, çeşitli deneysel hayvan başına çoğaltır gerektiren deneylerde tek hücre fizyolojisinin açıdan araştırılması için de faydalıdıdr. Bu eşleştirilmiş tedavi ve kontrol kültürlerinden çalışmalar yarar izin, sol ve sağ hemiganglia içine hedef hücrelerin anatomik ayrılması nedeniyle kültürlerin bir eş üretir.
Protokol yanak ganglion yanak S kümesi (BSC) nöronlar ve plevral ganglion plevral ventrocaudal (PVC) nöronlar hedefliyor. Bu hücreler, tüm hücre voltaj kayıtları ve görüntüleme Robus için uygun bir boyuttadırt glutamaterjik yanıtları. Açıklanan metodoloji Aplysia'nın sinir sisteminde en gangliyonların birleşmeleri için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hazırlanması
- Gün 1, tartmak ve hayvan uyutmak.
- Bir 30 g kg-1 hayvan tartılır. Izotonik MgCl: 1:1 Uygulama deniz suyu 5-10 hayvan hacimlerde anestezisi. Bu ekli airstone ile elektrikli akvaryum hava pompası gibi havalandırma ile 1 saat 6H 2 0.
- Diseksiyon malzemeleri hazırlayın.
- Bu kumaş işaretçilerine olarak paslanmaz çelik düz iğne, temiz diseksiyon tepsi birleştirin. + Penisilin / streptomisin (P / S).; Birkaç Petri yapay deniz suyu içeren yemekler (Tablo 1 ve 3'e bakınız ASW) monte
- Hazır bir düşük güç mikroskop var. Temiz diseksiyon aletleri gibi nervürlü burun ve ince cerrahi forseps gibi, hazır, ve ince ve büyük cerrahi makas var. Kullanmadan önce% 70 isopropol alkol ile araçlar Sprey ve kurumasını bekleyin.
- Diseksiyon tepsi konumu hayvan.
- Diseksiyon tepsiye pozisyonu hayvan ventral tarafı. Pin hayvangövde duvarı ve parapodial sınırları, ancak dorsal yüzeyini ortaya çıkaracak şekilde, yükleme ve baş önlemek ve genital oluğun kenarları boyunca
- Yavaş dönen soğuk musluk suyunda dorsal yüzeyi durulayın. Genital kanal boyunca bir sıkmak şişe ve başın üstünden 70% isopropol alkol hafif akışı uygulayın.
- Ilk kesi yapmak.
- Sığ bir kırpma sırasında düşük güç mikroskop kullanarak (bkz. Tablo 2) ve genital oluk ön kabuk marjı kaynaklanan noktaya gözlemlemek için yansıyan ışık, gerili, yivli-burun forseps Bu kökenli solunda doku kat ile tutun sadece iyi açılı makas ile genital oluk sağındaki vücut duvarının düzgün, düzlük tüm yol boyunca delik.
- Hemolimf bazen ile karın ganglion ve mide taşıyan, delikten dökmek için dikkat edilmelidir.
- Kesi genişletin.
- Inci genişletmek için büyük makas kullanınöne rhinophores arasında bir noktaya e kesi, alt bıçak ile yukarı çekerken bağırsak nicklemek önlemek için. Iç organların kesi dışarı dökmek için gözlenecektir.
- Ganglionlar çıkarın.
- Tepsiyi yeniden konumlandırmak ve baş bölgeye mikroskop yönlendirmesi.
- Temiz forseps ve ince makas kullanarak, bir noktada bir grup olarak plevra-pedalı ve serebral ganglionlar kaldırmak için yemek borusu etrafında bir halka içine baş ganglionlar oluşturan sinirler kesilmesinin tarafından baş ganglionlar çıkarın.
- Yemek borusu ventral tarafına yapışır yanak ganglion çıkarın.
- Bu ganglion gelen 4 büyük sinir bağlaçlar bu konuda keserek karın ganglion çıkarın.
- Ilgi ganglion izole edin.
- Ganglion en az çapına eşit olan her bir ilgi gangliyon bağlanmış bağlayıcılar arasında bir uzunluğa bırakarak, ayrı baş ganglion Trim; bu enzim geciktirir aşırı sindirimBir sonraki adım, ilgi hücre.
- ASW 2 durulama + temiz forseps ile durulama arasında hareket P / S, ile her hedef ganglion koyun.
- PVC hücreleri hedef, doğru pedal hemiganglion bağlı sağ plevral hemiganglion bırakın ve benzer şekilde sol pedal hemiganglion bağlı sol plevral hemiganglion bırakın.
- Istenmeyen ganglionlar ve kabul edilen araştırma uygulama göre hayvanın geri kalanını atın.
- Enzimatik ganglionlar sindirmek.
- Her gangliyon için, 3.75 mg dispaz, 1 mg hiyaluronidaz ve DSH ml'si başına 0.3 gr kollajenaz tip XI oluşan enzim çözeltisi, 1 ml hazırlanması 15 ml polipropilen konik tüpe +, P / S.
- Yeri enzim çözüm ganglionlar durulanır ve kapağını sıkıca takın. Yaklaşık 23 saat boyunca 13-5 gece boyunca yavaş bir hızda döner çalkalayıcı üzerinde (bakınız Tablo 2) üzerinde yan tüp yerleştirin ° C (oda sıcaklığı).
- Hazırlayınkültür kaplarına.
- Mikrodiseksiyon önce (Gün 2), poli-D-lisin (PDL) kaplı bir doku kültürü kaputu kültür yemekleri hazırlamak. ~ 25 dakika süre ile, 35 mm tabağın merkezine ~ 0.5 ml PDL (0.2 mg / ml 'lik steril su) ilave edilir.
- Steril su ile 3x PDL durulayın. Kurumasını bekleyin. Kalıpları UV-sterilize.
- 2. Gün nöronlar izole edin.
- PDL kaplı ve başka kuru bir tabak içinde medya bir ada oluşturmak için ASW + P / S yaklaşık 0.5 ml steril UV vardı 35 mm yemekleri ortasına doldurun. Bu doku kültürü kaputu dışında, bankta yapılabilir. Bir çanak hemiganglion kaynaklanan her hücre küme için hazırlanmalıdır.
- Sylgard kaplama tarafından yapılan ve (bkz. Tablo 3) işaretçilerine ve sondalar olarak kullanılmak üzere çeşitli boyutlarda ince diseksiyon işaretçilerine ile donatılmış bir 5 mm derin diseksiyon yüzey, kür hazır bir 100 mm çapında diseksiyon çanak var. ASW ile + P / S, ve son olarak fi sonra,% 70 isopropol alkol ile bu çanak durulayınbu ASW + P / S ile ll
- Sindirilmiş gangliyon mikrodiseksiyon hazırlayın.
- Diseksiyon çanak içine sindirmek plevra-pedalı ve yanak ganglion içeren enzim çözeltisi dökün.
- Yansıyan ışık altında siyah bir yüzeye karşı mikroskop sahnede çanak yerleştirin.
- Ekli bağ dokusu kullanarak, her plevra-pedal hemiganglion sırt tarafında yukarı aşağı pin. Yumuşak doku ve germe hoşgörüsüz olacaktır.
- PVC nöronlar Microdissect.
- Temiz ince forseps 2 çift kullanarak ve bir prob olarak forseps bir çift bir ince diseksiyon iğne tutan, bir plevral hemiganglion gelen PVC hücreleri izole. Enzim sindirim kaldırıldı veya PVC küme kapsayan bağ dokusu kılıf dağıldığına, henüz hücreleri birbirine yapışır olacak.
- Pedal-plevral bağ 18 bu hücreleri ayırmak için prob kullanın, sonra diseksiyon altına hücre küme düşmesine izinçanak.
- Kültür çanak nöronlar aktarın.
- Yavaşça hava kabarcıkları tanıtan önlemek için dikkatli olmak, sonra bir kültür çanak medya ada haline yavaş yavaş dağıtım, biraz yangın cilalı tek cam Pasteur pipet ucu içine küme emerek hazırlanmış bir 35 mm kültür çanak hücre küme aktarın pipet içine. Ayrı bir kültür çanak içine diğer hemiganglion ve yerin PVC küme izolasyonu tekrarlayın.
- BSC nöronlar Microdissect ve transfer.
- Ilgi hücreleri yedek dikkatle, kadar yanak ganglion ventral yan Pin. Yanak ganglion 10 2 BSC hücre kümeleri ile adım 1.12 tekrarlayın.
- PVC kümeleri içeren BSC kümeleri ve 2 yemekleri içeren 2 yemekler: PVC ve BSC nöronların izolasyonu nöron kümeleri içeren 4 kültür kaplarına üretecek. Ganglion geri kalanı atın ve 100 mm diseksiyon çanak kenara koyun.
- Dissochücre kümeleri iate.
- Düşük güç mikroskop sahnede hücreleri içeren bir kültür çanak yerleştirin ve kapağı çıkarın.
- Hafifçe forseps düzenlenen bir ince diseksiyon iğne ile hücre küme bitişik kültür çanak alt getirerek PVC küme ayırmak. Flicking rağmen plastik bir nokta kazmak için çalışıyor gibi çanak alt plastik içine iğne ucu kazma olduğunu. Plastik sürtünme pin nokta serbest bıraktığında, bir perküsyon dalga ayrı hücrelerin yakındaki yığın tatili vasıtasıyla üretilmektedir.
- 5-10 sinema neredeyse tamamen hücreleri ayırmak için gerekli, ancak hücreleri mekanik sırf tarafından yok edilmesi diye çok fazla fiske yerine hücre küçük kümeler bırakmak daha iyidir olabilir.
- Kapak ve diğer kültür yemekleri ile tekrar değiştirin.
- Hücre kültürleri saklayın.
- Ayrışmış hücreleri ile merkezlerinde medya adaları içeren kültür kaplarına yerleştirinBöyle bir 150 x 25 mm yuvarlak plastik Petri kabı gibi hava sirkülasyonu, izin verir, ve 17 ° C bir kuluçka set Bu yemeğin yer geniş bir kap
- Odasında nem kaynağı olarak su açık bir tabak yükleyin. Gece rahatsız bırakın. Hücreler çanak merkezinde poli-D-lizin kaplama uyacaktır.
- Sel kültür kaplarına.
- Gün 3, yavaşça ASW 2.5 ml yemekleri sel + P / S Incelemek ve ters bir hücre kültürü mikroskop kullanarak hücreleri saymak. 17 ° C inkübatör saklayın.
2. Elektrofizyoloji
Yöntemi (örnein, Sakmann ve Neher, 1995), pek çok metinde 16 tarif edilmiştir sıkıştırma standardı yamadır. Bu protokol hücreleri üzerinde ≤ 100 pF kapasitans, ya da hücreler <Protokolün gün 3 ve 4 sırasında 60 mikron çapında çalışacaktır. Süreçleri olmadan Hücreler kayıt için uygun olan. Aşağıdaki özel de İngiltere'deiyonları geçerlidir:
- Büyük hücreleri β = 0.1 olarak ayarlanmış Axopatch 200B amplifikatör yapılandırma ayarı ile yerleştirilebilir. Çok büyük akımlar aktivasyonu hücre gerilim kelepçe kaçmaya neden olabilir. ASW çözümleri (geçirimsiz bir N-metil-D-glukamin klorid ile ikame edilmiş NaCl örneğin bir kısmı) tuz içeriğinden ikame edilen bütün bir hücre akım genliği azaltmak için kullanılabilir.
- Bir pipet çekici üzerine çekilir ve KCl ve diğer tuzlar 450 mm (bkz. Tablo 1) oluşan hücre içi çözelti (ICS) ile yarım toprakla fiber dolgulu borosilikat yama pipetler uygundur ve yaklaşık 0.5-1 Mohms bir dirence sahip olmalıdır. Belirli iyonik akımların izolasyonu isteniyorsa, örneğin, Na + K akımları, K +, bu çözüm yokluğunda akımları gibi Cs + gibi diğer iyonlar ile değiştirilebilir. Cl - daha doğal bir ICS isteniyorsa geçirgen olmayan anyon ile ICS değiştirilmesi de garanti edilir9.
- Hücreler oda sıcaklığında mümkün> 1 saat süren kayıtları ile sağlamdır. Kayıt kültüründe 24-48 saat için gelen, gün 3 ve protokolün 4 en uygunudur. 48 saat sonra, güçlük, hücre yüzeyi üzerinde bir glikokaliksin hazırlanması belki de, gigaohm conta oluşturan, ve proses sonucudur neden olduğu alan kıskaç sorunlar vardır. Hücreler <14 d içinde tamamlanabilir gibi toksikoloji olmayan yama kelepçe çalışmalar, için, yararlı, ancak vardır.
- ASW ve diğer çözümler ağırlık beslenen çözüm cihaz vasıtasıyla dağıtılabilmesidir için, hem de hücre içi çözelti süzülür gereken bir gigaohm conta oluşumuna müdahale ince parçacıkların ortadan kaldırmak için 0.2 mikron Acrodisk filtre (Tablo 3), bir şırınga monte edilebilir.
- Örneğin, D-aspartat (D-Asp) agonist kullanıldığında Duyarsızlaştırma oluşur, bu nedenle agonist, uygulamalar arasında, 1-2 dakika ~ tavsiye edilir. Tersine, Potentiation genellikle hızlı tekrar başvurunun ile görülmektedirL-glutamat (L-Glu), agonist katyon.
- L-Glu gibi agonist aktif akımları Picospritzer pipet ile agonistleri uygulayarak incelenebilir. Bu pipet yama pipet ile aynı çekilir ve ASW agonisti içerir. Bu pipet ucu yerçekimi beslenen çözüm cihaz çıkışı boru altında konumlandırılmış ve çıkış boru (Şekil 2F) bir 45 ° açıyla, agonist hızla hücreden kalmamis olur ve duyarsızlaştırma en aza inecektir zaman. Agonist pipet 90 ° 'lik ya da daha fazla yama pipet' lik bir açı oluşturması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde hedeflenen gangliyon içindeki duyu nöronlarının yerle BSC ile PVC nöronlar Şekil 1 'de gösterilmiştir. BSC nöronlar bukkal gangliyonu, sağlam ganglion (Şekil 1A) 'de bukkal kütle uzağa dönük yüzeyinin ventral tarafta simetrik 2 oval kümeler halinde bulunmaktadır. PVC nöronlar merkez ekseni (Şekil 1B) doğru plevral ganglion dorsal yüzeyi etrafında saran ikili, V şeklinde kümeler oluştururlar. Sağ veya sol küme olaylar yaklaşık 1% bireysel hayvanlarda eksik olmasına rağmen bu duyusal nöronlar, ganglion içinde kalıplaşmış yer avantajı var. BSC ve PVC nöron kümeleri hücre zarının koyu turuncu renk ve Şekil 1A büyük daire anahat gösterilen yakın hücreleri ile karşılaştırıldığında nispeten küçük boyutu ile tanımlanabilir.
Kültüründe, bunöronlar süreçleri olmadan genellikle kaplama bir gün sonra (Şekil 2A) ve yama o gün sıkma ve bir gün sonra için idealdir. Tüm hücre vücuttan yayılan gibi görünüyor çimlenme değil hücrenin parçası olduğunu öne, hücrelerin süreci akıbet (Şekil 2F) var görünüyor bile yeterli alan kelepçe elde etmek bazen mümkün olabilir. Enzimatik sindirim sonra işleme nazik olmuşsa, hücreleri sağlam bazı süreçleri ile kültür gelmesi ve bu süreçlerin zaman (Şekil 2B-2E) ile büyür. Bu hücreler yama sıkma için uygun değil, hücre içi kayıt mümkündür.
Voltaj kapılı Na + ve Ca 2 + taşıdığı tüm hücre yama kelepçe akımları kolayca kısa süreli kültür 6 PVC ve BSC nöronlar kaydedilen ve her iki hücre tipleri karışık K güncel ekran vardır. BSC nöronlar da asetilkolin, serotonin ve NMDA 4 (Şekil 3C cevap) Eksitatör akımlarla, BSC ve PVC nöronlar hem uyarıcı akım, L-Glu, D-Asp, 3 (Şekil 3A ve 3B) yanıt ise. Farmakolojik özellikleri L-Glu-, ve bu nöronların D-Asp-indüklenen akımlar 4 tarif edilmiştir.
Şekil 1. . A. bukkal S kümesi (BSC) nöronlar, kendi koyu turuncu renk (sol hemiganglion üzerinde büyük daire) ve karşılık gelen konuma göre tanımlanabilir yanak ve plevral ganglionlar (kırmızı daireler) glutamaterjik duyusal nöronların konumunu gösteren fotomikrografı Sağ plevral hemiganglion hakkı hemiganglion (küçük daireler). B. V şeklinde, koyu turuncu plevral ventrocaudal (PVC) hücre kümesi (sol hemiganglion gösterilmemiştir).
Şekil 2. Kültür glutamaterjik duyusal nöronların fotomikrografı 2 duyusal nöronlar ve diğer hücreler gösteren kültür çanak sonra kaplama PVC küme 24 saat gelen A. Hücreleri;. 24 saat ayrı kültürlerden gelen PVC hücreleri parçalar olarak gösterilir B, C.. Bir 48 saat sırasıyla 24 saat ve 96 saat aynı nöron de kültürde bir BSC nöron,. D, 24 saat de kültürde E. bir PVC nöron ve sırasıyla 96 saat aynı nöron,. F. bir PVC nöron yama kelepçe deney. Picospritzer pipet altındaki iken yama pipet, sağ kenarından hücre temas ettiğine. Hücrenin solunda görünen büyük koyu gölge akan banyo pipet açılmasıdır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. BSC ve PVC nöronlardan tüm hücre yama kelepçe kayıtları glutamaterjik akımlar. L-Glu basınç uygulamasına yanıt olarak bir BSC nöron mevcut A. Tüm hücre (1 mM, 100 msn). Bir PVC nöron mevcut B. Tüm hücre D-Asp basınç uygulaması (1 mM, 100 milisaniye) tepki. bir (1 mM, 100 ms) 'de anlatılanla aynı BSC hücresindeki akımın ° C. Tam hücre NMDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ayrışma teknikleri glia ve diğer tanımlanamayan hücrelerin az sayıda serpiştirilmiş 50-100 izole nöron içeren duyusal nöron kültürleri verim burada açıklanan. Protokolde en kritik adımlar ganglionlar enzim çözeltisi kalır zaman vardır, ve, tek tek hücrelere küme bozmaya sindirilmiş hücre kümeleri ayrışma Flicking. Enzim sindirimi (adım 1.8) mevcut sıcaklığında optimize edilmesi gerekmektedir. 23 yavaş sallayarak ° C, 13 saat BSC kümeleri while15 saat PVC kümeleri için optimum sonucu sindirim için yeterlidir. Kültür çanak düşük hücre verim enzim yeterli zaman atfedilen, ya da hücre aktarımını adım (1.11 ve 1.12) sırasında ya da Flicking adım (1.13) sırasında çok fazla mekanik bozulması. Olabilir Kültür yüzey aşağı sopa hücrelerin yetersizliği, hem de kültür kısa ölümler çok fazla mekanik hasarı ile ortaya çıkar. Kültürel kirlenmesilarda da oluşabilir, ve en iyi anestezi hayvan iyi diseksiyon aletleri temiz olduğunu, durulanır, ve ilgi ganglion ASW birkaç durulama + P / S ile konur sağlayarak ele Bu diseksiyon prosedür farklı parçaları arasındaki araçların yıkama ve alkol-temiz gerekebilir, ya da temiz olanlar her adım için kullanılabilir, böylece hazır yeterli araçlar olabilir.
Aplysia nörobiyolojik çalışmalar en sık nöronlar arasında ya da nöronlar ve kaslar 2, 18 arasında sinir bağlantıları korumak azaltılmış hazırlıkları yapılmaktadır. Bu preparatlar özel nöronlar ve nöronal devreleri kas süreçlerin kontrol tayin ve aynı zamanda tekrarlayan reflekslerin potansiyasyonu ve kolaylaştırma çalışmaları izin verir. Bozulmamış hazırlıkları hızla reseptörleri duyarsızlaştırmak bu gerilim kelepçe protokolleri ve agonistlerin etkilerinin çalışmanın belirli türleri için uygun değildir.
Uzun süreli nöronal ko-kültür son derece kontrollü koşullar altında potansiyasyonu ve kolaylaştırma incelemek için ek bir araçtır. Uzun vadeli ortak kültürleri de tek nöronlar üzerinde biyokimyasal çalışmalara kendilerini katmaktadır. Ko-kültür hazırlanması başarısı genellikle kültürleri 17-50% Aplysia'nın hemolimf kadar ilavesi atfedilir. Ancak, bu yaklaşımın başarısı genellikle bu hemolimf toplu-seri değişkenlik bağlıdır.
Burada açıklanan ayrışmış hücre kültürü hazırlanması Aplysia modelinin kullanımı repertuarı genişletir. Ayrışmış hücre kültürleri nöral devreleri deducing veya yöntemleri yapmak, yukarıda belirtildiği gibi sağlam sinaps incelemek için uygun değildir. Ayrışmış hücre kültürü hazırlanması tek bir hücre voltaj-kıskaç deneylerde spesifik iyonik iletkenlikleri ve bunların kinetik ve farmakolojik özelliklerinin varlığını teyit bunun en büyük yarar vardır. Several benzersiz akımları torba hücrelerde mevcut uyarıcı bir katyon BSC 19 ve nöronlar 4 mevcut olan D-Asp reseptörü de dahil olmak üzere tek bir hücre preparatları kullanılarak tespit edilmiştir. Aplysia çalışmaları nadiren, çünkü bu tür hücreleri ve kelepçe teknikleri yama iyi kendilerini borç çok sayıda başka uygun bir model hücre tiplerinin varlığının genellikle hantal boyutu bir parçası tek tek hücrelerin iyonik akımları, odaklanın. Sonuç olarak, bu tür alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazol-propionik asit (AMPA) tarafından aktive gibi Aplysia'nın belirli akımların varlığı, genellikle kabul edilen AMPA alıcısının blok (R) çıkarılmaktadır düşük sinir hazırlanmasında esas yerine, doğrudan kaydedilen Ampar antagonistleri ile ilgili davranışlar. Böylece bazı akımların varlığını doğrulama eksiktir. Kültürlü glutamaterjik nöronlar ve tek hücre gerilim kelepçe yöntemi izolasyonu varlığı için doğrudan bir testi sağlarBu model organizma L-GLUR değişik kanal türleri.
Tek bir hücre yama kelepçe deneylerde Aplysia'nın nöronların başka bir kullanımı, ikinci haberci kaskadlar kesme bulunmaktadır. Oda sıcaklığına 3, 12, 20, 21, kayıt için uzun süreler için kararlı olduğu için Aplysia'nın nöronlarının, özellikle de ikinci haberci indüklenen modülasyon çalışmaları için uygundur ve tek tek hücreler kayıt sonra kaydedilir ve 24 saat 5 sonra bir daha kaydedilebilir ki yeterince sağlamdır. Bunlar, bukkal ve plevral duyu nöron kümeleri uygun eşini bir tedavi alırken bir tabak, bir kontrol kültürü tayin edilebilir, böylece, her bir gangliyondan eşleşen kültürlerin bir çift verim.
Bu preparatın bir başka avantajı da, bireysel nöronların morfolojik durumunun çalışmalar bulunmaktadır. Örneğin, ihtiyarlık hayvanlardan Aplysia'nın nöronların hücre gövdeleri olduğunu keşfetti largenç hayvanlardan daha ger, ama kültür 6 birkaç gün sonra hücre süreçlerini ayrıntı vermedi. Bu izole edilmiş nöron preparasyonlar, aynı zamanda daha sonra tek tek hücrelerin nörofizyolojik özellikleri ile karşılaştırılabilir olduğu hücre içi Ca2 +, pH ve reaktif oksijen türleri, mitokondrial membran potansiyeli ve diğer fiziksel özellikler seviyelerini değerlendirmek için çok önemlidir boyalar kullanılarak çalışmalar kolaylaştırır. Bu yaklaşımların bazıları sağlam ya da ko-kültür hazırlıkları uygulanabilir olsa da, veri toplama çok daha basit bu kadar kolay kültür sistemi izole nöronların kullanıyor. Gelecekte biz tek bir hücre moleküler profil 13 için bu hücrelerin kullanmak istiyoruz.
Ayrışmış kısa vadeli kültürü temel nörofizyolojik süreçleri araştırmak için ideal bir malzeme sağlar ve çalışmalar azaltılmış içeren veya ko-kültür hazırlıkları ile birlikte kullanıldığında özellikle güçlü bir araç sağlayabilir. AyrışmışAplysia nöron kültürü nörobilim yeni ve ilginç alanlara bu saygıdeğer hayvan modelinin programı uzanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
NIH P40 OD010952, Korein Vakfı, SLC Miami Arkadaş Grubu bir üniversite ve ATK bir Maytag burs tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar minnetle Aplysia yanı sıra Lauren Simonitis ve bir rakam için mikroskop sağlanan Hannah Peck, için Ulusal Kaynak personeli kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
