Summary
Nós descrevemos a dissecação do sistema nervoso do mar marinho lebre
Abstract
O molusco gastrópode marinho Aplysia californica tem uma história venerável como um modelo de funcionamento do sistema nervoso, com particular importância em estudos de aprendizagem e memória. As preparações típicas para esses estudos são aquelas em que o sensorial e motoneurónios são deixadas intactas num animal minimamente dissecados, ou uma técnica elaborada neuronal co-cultura de motoneurónios e sensorial indivíduo. Menos comum é o isolado preparação neuronal em que pequenos grupos de neurônios nominalmente homogêneos são dissociados em células isoladas em cultura de curto prazo. Tais células isoladas são úteis para a caracterização biofísica das correntes de iões utilizando técnicas de patch clamp, e modulação específica destas condutâncias. Um protocolo para a preparação de tais culturas é descrito. O protocolo aproveita os facilmente identificáveis neurônios sensoriais glutamatérgicos do gânglio pleural e bucal, e descreve a sua dissociação e manutenção mínima in cultura durante vários dias, sem soro.
Introduction
O molusco opistobranch marinho Aplysia, tem sido um modelo neurobiológico útil para muitas décadas. Ele é mais conhecido como um modelo de habituação e condicionamento clássico 7, 8. Estudos sobre a aprendizagem e memória neste modelo ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2000 por Eric R. Kandel, em um prêmio que ele compartilhou com Arvid Carlsson e Paul Greengard 10. Estudos envolvendo gravações eléctricos de preparações reduzidas, em que os elementos do sistema nervoso deste invertebrado são dissecados do animal com nervos e músculos permanecer ligados, ajudaram a elucidar os papéis de neurónios individuais na Aplysia. A identificação dos mecanismos moleculares precisos que constituem a aprendizagem em Aplysia no entanto, muitas vezes empregue uma outra técnica, a longo prazo co-culturas de um neurónio sensorial e uma neurónios motores, um por um, obtido a partir de animais dadores individuais e deixou-se formar uma sinapse no prato de cultura 21 .
Nós e outros 1, 3, 6, 14, 15, 16 têm explorado a facilidade com a qual identificou neurônios pode ser alvo neste modelo, bem como a sua resistência em experimentos de longo prazo para fazer culturas de curto prazo dissociadas de aglomerados de neurônios nominalmente homogêneas em que estudamos correntes iônicas sob braçadeira de tensão na configuração de patch clamp. Muitos neurônios Aplysia enfrentar repetidas rodadas de remendo de fixação para dar tempo para manipulações experimentais de longa duração. A técnica é útil para os neurónios tais como as células do saco neurossecretoras do gânglio abdominal, e os neurónios sensoriais do gânglio da pleura e bucal cuja dissociação aqui descrita, mas não no caso de grandes neurónios> 60 um de diâmetro, tal como L7 ou R2 gânglio abdominal. Não empregamos soro Aplysia em nossas culturas, ao contrário dos co-culturas sensório-motoneurônio descritos em outro lugar. A maioria dos neurônios obtidos através deste procedimento será sem processos de tele primeiras 48 h em cultura, facilitando a gravação voltagem da célula inteira, mas, em seguida germinar e elaborar axónios e outros processos para cerca de 14 dias antes da morte da falta de nutrientes e / ou factores de crescimento.
Esta técnica produz culturas primárias de neurônios por 50-100 prato de regiões fisiologicamente documentados do gânglio vestibular e pleural. Este protocolo é útil para pesquisadores que estudam os aspectos da fisiologia da célula única em experimentos que requerem numerosos experimental repetições por animal. Ela produz um par correspondente de culturas devido à separação anatómica das células alvo em hemiganglia esquerda e direita, permitindo estudos que beneficiam com o tratamento combinado e as culturas de controlo.
O protocolo visa bucais S cluster (BSC) neurônios do gânglio vestibular, e ventrocaudais (PVC) neurônios do gânglio pleural pleural. Estas células são um tamanho apropriado para as gravações de tensão de células inteiras e de exibição Robust respostas glutamatérgicos. A metodologia discutido é apropriado para a maioria dos gânglios do sistema nervoso Aplysia.
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Protocol
1. Preparação celular
- No dia 1, pesar e anestesiar animal.
- Pesar a 30 g-1 kg de animal. Anestesiar em 5-10 volumes de animais de 01:01 de água do mar: MgCl isotónica. 6H 2 0 durante 1 hora, com arejamento, tal como uma bomba de ar eléctrica de aquário com uma pedra difusora em anexo.
- Preparar material de dissecação.
- Montar bandeja de dissecação limpa com alfinetes de aço inoxidável, tais como pinos de tecido. Montar vários pratos de Petri contendo água do mar artificial (ASW, ver as Tabelas 1 e 3) + penicilina / estreptomicina (P / S).
- Tenha pronto um microscópio de baixa potência. Ter instrumentos de dissecção limpo pronto, como nariz com nervuras e finas pinça cirúrgica, e multa e grandes tesouras cirúrgicas. Pulverizar os instrumentos com 70% de álcool isopropol antes da utilização e deixar secar.
- Posição animal na bandeja de dissecação.
- Posição animais lado ventral para baixo na bandeja de dissecação. Pin animaisatravés bordas da parede do corpo e fronteiras parapodial, mas evitar a cauda ea cabeça, para expor a superfície dorsal eo sulco genital
- Enxaguar a superfície dorsal na água slow-running da torneira fria. Aplicar um fluxo de luz de 70% de álcool isopropol de um frasco de pressão ao longo do sulco genital e sobre a parte superior da cabeça.
- Fazer a incisão inicial.
- Usando um microscópio de baixa potência (veja a Tabela 2) e a luz reflectida para observar o ponto em que a ranhura genital origina a partir da margem anterior do invólucro, tautly segurar com nervuras-nose pinça uma dobra de tecido para o lado esquerdo desta origem, enquanto um recorte raso buraco todo o caminho através da, área lisa e plana de parede do corpo à direita do sulco genital com multa tesoura angulada.
- Hemolinfa deve ser observado para derramar do buraco, às vezes levando consigo o gânglio abdominal e do estômago.
- Expanda a incisão.
- Use tesoura grande para expandir the incisão anterior a um ponto entre as rhinophoros, enquanto puxa para cima com a lâmina inferior, para evitar o entalhamento intestino. Os órgãos internos serão observados para derramar da incisão.
- Remover os gânglios.
- Reposicionar a bandeja e reorientar o microscópio sobre a região da cabeça.
- Utilizando uma pinça limpa e tesouras finas, remove os gânglios cabeça, cortando em um ponto os nervos que formam gânglios cabeça em um anel ao redor do esôfago para remover pleural-pedal e cerebral gânglios como um grupo.
- Remover o gânglio vestibular que adere ao lado ventral do esófago.
- Retire o gânglio abdominal cortando os 4 grandes conectivos nervosas que emitem a partir deste gânglio.
- Isolar gânglios de interesse.
- Apare gânglios cabeça separados, deixando um comprimento de conectivos ligados uns aos gânglio de interesse, que é igual a, pelo menos, o diâmetro do gânglio, o que irá retardar a enzima sobre-digestãodas células de interesse no passo seguinte.
- Coloque cada gânglio alvo através de duas lavagens de ASW + P / S, movendo-se entre as lavagens com uma pinça limpa.
- Se alvo as células de PVC, deixe o hemiganglion pleural direito ligado à hemiganglion pedal direito, e da mesma forma deixar o hemiganglion pleural esquerdo ligado ao hemiganglion pedal esquerdo.
- Descartar gânglios indesejada e o resto do animal de acordo com a prática da pesquisa aceite.
- Enzimaticamente digerir os gânglios.
- Para cada gânglio, preparar 1 ml de solução de enzima consistindo de dispase 3,75 mg, 1 mg e 0,3 g hialuronidase colagenase tipo XI por ml de ASW + P / S num tubo cónico de 15 ml de polipropileno.
- Lugar lavado gânglios na solução enzimática e coloque a tampa firmemente. Colocar o tubo no seu lado num agitador rotativo (ver Tabela 2), a uma velocidade lenta para 13-5 hr durante a noite a cerca de 23 ° C (temperatura ambiente).
- Prepare oplacas de cultura.
- Antes de microdissecção (Dia 2), preparam poli-D-lisina (PDL) revestidos em placas de cultura de um capuz de cultura de tecidos. Adicionar 0,5 ml de PDL ~ (0,2 mg / ml de água esterilizada) ao centro de 35 mm de prato de ~ 25 min.
- Lavar PDL 3x com água estéril. Deixe secar. UV-esterilizar as placas.
- Dia 2 Isolar os neurônios.
- Encher o centro de pratos de 35 mm que foram PDL revestido e UV esterilizadas com aproximadamente 0,5 ml de ASW + P / S para criar uma ilha de meios de comunicação dentro do prato de outro modo seca. Isto pode ser feito sobre a bancada, fora do capuz de cultura de tecidos. Um prato deve ser preparado para cada grupo de células provenientes de um hemiganglion.
- Já imediata de 100 mm de diâmetro dissecção prato feito por Sylgard-revestimento e cura de uma superfície de dissecção 5 mm de profundidade, equipado com pinos de dissecação fina de diversos tamanhos para serem utilizados como pinos e as sondas (ver Tabela 3). Enxaguar este prato com 70% de álcool isopropol, em seguida, com ASW + P / S, e, finalmente, fill com ASW + P / S.
- Prepare microdissection de gânglios digerida.
- Despeje a solução de enzima que contém a pleural-pedal e bucal gânglios digerido no prato dissecção.
- Colocar a cápsula na fase do microscópio sobre uma superfície preta sob luz reflectida.
- Usando o tecido conjuntivo em anexo, o pino de cada lado dorsal hemiganglion pleural pedal-up. Os tecidos vão ser suave e intolerante de alongamento.
- Microdissect neurônios PVC.
- Usando dois pares de fórceps finas e limpas, e segurando um pino de dissecação muito bem em um par de fórceps como uma sonda, isolar as células de PVC a partir de um hemiganglion pleural. Digestão enzimática irá ter removido ou partido para além da bainha do tecido conjuntivo que cobre o conjunto de PVC, no entanto, as células vão aderir um ao outro.
- Utilização da sonda de separar estas células a partir do conjuntivo pedal 18 pleural, em seguida, deixar cair o grupo de células para a parte inferior da dissecçãoprato.
- Transferir neurônios prato de cultura.
- Transfira o grupo de células a um preparado 35 milímetros prato de cultura sugando suavemente o cluster na ponta de um pouco de fogo polido descartável vidro Pasteur pipeta, em seguida, dispensando-o lentamente na ilha de mídia em uma placa de cultura, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar para a pipeta. Repita o isolamento do cluster PVC do outro hemiganglion e coloque em um prato de cultura distinta.
- Microdissect e transferir BSC neurônios.
- Pin o gânglio lado ventral bucal para cima, com cuidado para poupar as células de interesse. Repetir passo 1.12, com os dois conjuntos de células BSC do gânglio vestibular 10.
- Isolamento de PVC e BSC neurônios irá produzir quatro placas de cultura contendo aglomerados de neurônios: 2 pratos que contenham grupos BSC e 2 pratos contendo aglomerados de PVC. Descartar o resto dos gânglios e anular o prato de 100 mm de dissecação.
- DissocIATE os grupos de células.
- Coloque um prato de cultura contendo células no estágio do microscópio de baixa potência e retire a tampa.
- Dissociar o cluster PVC sacudindo suavemente a parte inferior da placa de cultura junto ao grupo de células com um pino de dissecação fina realizada em fórceps. Piparotear espetada a ponta do pino no plástico do fundo do prato, como se tentasse cavar uma mancha de plástico. Quando o atrito com o plástico libera o ponto de pino, uma onda de percussão é produzido através do meio que rompe a moita nas proximidades de células.
- 5-10 súbitos podem ser necessários para quase dissociar completamente as células, mas é preferível deixar pequenos aglomerados de células, em vez de passe rapidamente demais para que as células sejam destruídos por pura mecânica.
- Recoloque a tampa e repita com outros pratos da cultura.
- Armazenar culturas de células.
- Coloque as placas de cultura contendo ilhas de mídia em seus centros com células dissociadas emum grande recipiente, que permite a circulação de ar, tal como um x 25 mm de plástico redondos de Petri de 150, e em colocar este prato um conjunto incubadora a 17 ° C.
- Instalar na câmara num prato aberto de água como fonte de humidade. Deixar repousar durante a noite. As células aderem ao revestimento de poli-D-lisina no centro do prato.
- Placas de cultura de inundação.
- No Dia 3, os pratos inundar suavemente com 2,5 ml de ASW + P / S. Examinar e contar as células usando um microscópio de cultura de células invertido. Loja no 17 ° C incubadora.
2. Eletrofisiologia
O método é o tampão padrão de aperto que tem sido descrito em numerosos documentos (por exemplo, Sakmann e Neher, 1995) 16. Este protocolo irá funcionar em células ≤ 100 pF de capacitância, ou células <60 um de diâmetro durante os dias 3 e 4 do protocolo. Células sem processos são ideais para a gravação. A seguir CONSIDERAÇ especialíons se aplicam:
- Células maiores podem ser acomodados com a configuração do amplificador Axopatch 200B configurada para β = 0,1. Activação de grandes correntes pode levar as células a escapar fixador de tensão. Soluções ASW substituído por o teor de sal (por exemplo, uma fracção do NaCl substituo com cloreto de N-metil-D-glucamina impermeável) pode ser usado para reduzir toda a amplitude da corrente de células.
- Fibra pipetas cheias de remendo borosilicato puxadas sobre um puxador de pipeta e reencheu meio com uma solução intracelular (ICS), constituído por 450 mM de KCl e outros sais (ver Tabela 1) são adequados, e deverá ter a resistência de cerca de 0,5-1 MOhms. Se o isolamento de correntes iónicas específicas é desejada, por exemplo, as correntes de Na +, na ausência de correntes de K, K + no presente solução pode ser substituído por outros iões tais como + Cs. Cl - substituição do ICS com um ânion impermeant também é justificada se a ICS mais natural é desejado9.
- As células são robustos com> 1 hr de duração gravações possíveis à temperatura ambiente. A gravação é ideal nos dias 3 e 4 do protocolo, correspondendo a 24-48 h em cultura. Após 48 horas, há dificuldade em formar vedações gigaohm, talvez devido à elaboração de um glicocálice na superfície da célula, e os problemas de fixação de espaço causados pelo processo de desdobramento. As células são úteis, no entanto, para estudos de fixação não-correção, tais como toxicologia, que podem ser concluídos em <14 d.
- ASW e outras soluções para ser distribuído a partir do dispositivo de solução alimentada por gravidade, bem como a solução intracelular, deve ser filtrada através de uma seringa montada 0,2 um filtro Acrodisk (Tabela 3) para eliminar as partículas finas que interferem com a formação de selo gigaohm.
- A dessensibilização ocorre quando se utiliza agonistas tais como D-aspartato (D-Asp), portanto, ~ 1-2 min entre as aplicações dos agonistas é recomendada. Inversamente, a potenciação é frequentemente observada com rápida aplicação repetidacatião de agonistas, tais como L-glutamato (L-Glu).
- Agonist correntes activadas, tais como L-Glu, pode ser estudado através da aplicação de agonistas com o Picospritzer pipeta. Esta pipeta é puxado para a mesma que a pipeta patch e contém agonista ASW. Quando a ponta da pipeta este está posicionado abaixo do tubo de saída do dispositivo de solução alimentada por gravidade, e a um ângulo de 45 ° a partir do tubo de saída (Figura 2F), agonista será rapidamente lavados a partir da célula, e dessensibilização será minimizado. A pipeta agonista deve criar um ângulo de 90 ° ou mais em relação à pipeta patch.
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Representative Results
As localizações dos neurónios sensoriais dos gânglios dentro que são orientados neste protocolo, os neurónios do BSC e PVC são mostrados na Figura 1. Os neurónios BSC estão localizados em dois conjuntos ovais simétricos no lado ventral do gânglio vestibular, a superfície que fica virado para fora a partir da massa no gânglio vestibular intacta (Figura 1A). Os neurónios do PVC formam aglomerados bilaterais, em forma de V que envolvem a superfície dorsal do gânglio pleural em direcção ao eixo central (Figura 1B). Estes neurónios sensoriais têm a vantagem de um local dentro de estereotipada dos gânglios, embora o aglomerado direita ou esquerda está ausente em animais individuais em aproximadamente 1% de ocorrências. O BSC PVC e conjuntos de neurónios são identificáveis pela cor laranja escuro da membrana celular e o tamanho relativamente pequeno em comparação com as células vizinhas, como mostrado no esquema grande círculo da Figura 1A.
Em cultura, estesneurónios são muitas vezes sem processos dia após o plaqueamento (Figura 2A) e são ideais para patch clamping nesse dia, e um dia mais tarde. Por vezes é possível conseguir braçadeira espaço adequado, mesmo quando as células parecem ter excrescência processo (Figura 2F), sugerindo que nem todas brotação que parece emanar do corpo da célula é parte da célula. Se manuseamento após a digestão enzimática foi suave, as células em cultura de chegar com alguns processos intactos, e estes processos de crescer com o tempo (Figuras 2B-2E). Tais células não são adequados para fixação adesivo mas a gravação intracelular é possível.
Patches celulares correntes braçadeira inteiras transportadas por tensão fechado Na + e Ca 2 + são facilmente gravado a partir de PVC e BSC neurônios em cultura de curto prazo 6, e ambos os tipos de células exibir um misto K atual. BSC neurónios respondem também a acetilcolina, a serotonina e NMDA, 4 (Figura 3C) Com correntes excitatórios, enquanto que tanto o BSC e PVC neurónios respondem a L-Glu e D-Asp-3 (Figuras 3A e 3B), com as correntes de excitação. As características farmacológicas da L-Glu e D-Asp correntes induzidas nestes neurónios foram descritas 4.
Figura 1. Fotomicrografias mostrando a posição dos neurônios sensoriais glutamatérgicos do gânglio vestibular e pleural (círculos vermelhos) A. Os vestibulares S cluster (BSC) neurônios., Identificável pela sua cor laranja escuro (grande círculo em hemiganglion esquerda) ea posição correspondente no ventrocaudais conjunto hemiganglion direita (círculos menores). B. V-shaped, laranja escuro pleural (PVC) célula do hemiganglion pleural direita (hemiganglion esquerda não mostrados).
Figura 2. Fotomicrografias de neurônios sensoriais glutamatérgicos na cultura A. Células do cluster 24 hr PVC após o plaqueamento em placa de cultura mostrando dois neurônios sensoriais e outras células,. Outras células de PVC a partir de culturas separadas em 24 horas são mostradas como inserções B, C.. A BSC neurônio na cultura às 24 horas e no mesmo neurônio em 96 horas, respectivamente. D, E. Um neurônio PVC na cultura às 24 horas e no mesmo neurônio em 96 horas, respectivamente. F. Um neurônio PVC em 48 horas em um experiência patch clamp. A pipeta patch é o contacto da célula a partir da extremidade direita, enquanto que o Picospritzer pipeta fica na parte inferior. A grande sombra escura visível à esquerda da célula é a abertura da pipeta banho fluindo. Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 3. Correntes glutamatérgicas na correcção de células inteiras a partir de gravações braçadeira BSC e PVC neurónios. Inteiro A. corrente em um BSC neurónio células em resposta à aplicação de uma pressão de L-Glu (1 mM, 100 ms). Célula inteira B. actual em um neurónio PVC resposta à aplicação de uma pressão de D-Asp (1 mM, 100 ms). C. corrente de NMDA de células inteiras na mesma célula BSC como em A (1 mM, 100 ms).
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Discussion
As técnicas descritas aqui dissociação produzir culturas de neurônios sensoriais contendo 50-100 neurônios isolados intercaladas com um pequeno número de células gliais e outras células não identificados. Os passos mais críticos na protocolo são o momento em que o gânglio permanecem na solução enzimática, e sacudindo a dissociação dos grupos de células digeridos para quebrar o aglomerado em células individuais. Digestão enzimática (passo 1.8) tem de ser optimizada para a temperatura disponível. A 23 ° C com agitação lenta, 13 horas é suficiente para a digestão do BSC grupos while15 hr é ideal para grupos de PVC. Os baixos rendimentos de células no recipiente de cultura podem ser atribuídas ao tempo insuficiente em enzima, ou muito ruptura mecânica durante o passo ou a transferência de células (1,11 e 1,12) ou durante o passo de passar rapidamente (1,13). A falha das células se para baixo para o substrato de cultura, bem como breve sobrevivência em cultura é normalmente devido a demasiada perturbação mecânica. Contaminação da culturas também pode ocorrer e pode ser melhor dirigida ao assegurar que o animal anestesiado e é bem enxaguada, de que os instrumentos de dissecação são limpos, e que os gânglios de interesse são colocados através de várias lavagens em ASW + P / S. Pode ser necessário lavar e álcool instrumentos limpos entre as diferentes partes do processo de esvaziamento, ou tem instrumentos suficientes imediata de modo que as claras podem ser usadas para cada passo.
Aplysia estudos neurobiológicos são mais frequentemente realizado em preparações reduzidos que preservam as conexões nervosas entre os neurônios ou entre neurônios e músculos 2, 18. Estas preparações facilitar a atribuição de controle de processos musculares para neurônios específicos e circuitos neuronais e também permitir estudos da potenciação e facilitação de reflexos repetitivas. Preparações intactas não são adequados a determinados tipos de protocolos da braçadeira de tensão e o estudo dos efeitos dos agonistas que dessensibilizar rapidamente seus receptores.
A longo prazo co-cultura neuronal é uma ferramenta adicional para estudar potenciação e facilitação em condições altamente controladas. Longo prazo co-culturas também se prestam para estudos bioquímicos nos neurônios individuais. O sucesso da preparação de co-cultura é muitas vezes atribuída a adição de até 50% Aplysia hemolinfa de culturas 17. No entanto, o sucesso desta abordagem depende muitas vezes da hemolinfa variabilidade de lote para lote.
A preparação de cultura de células dissociadas descrito aqui amplia o uso repertório do modelo Aplysia. Culturas de células dissociadas, não são adequados para deduzir circuitos neurais ou estudar a sinapse intacto como os métodos mencionados acima fazer. A preparação de cultura de células dissociadas tem a sua maior utilidade na confirmação da existência de condutâncias iónicos específicos e as suas propriedades farmacológicas e cinéticas em experiências de fixação de tensão de célula única. Sevcorrentes únicas Eral foram descobertos usando preparações de células individuais, incluindo um cátion excitatório atual em células saco de 19 ea atual receptor D-Asp em BSC neurônios 4. Estudos sobre Aplysia raramente se concentrar nas correntes iônicas de células individuais, em parte por causa do tamanho, muitas vezes de difícil controle dessas células e da existência de inúmeros outros tipos de células-modelo adequados que se prestam bem para corrigir as técnicas de fixação. Como resultado, a existência de determinadas correntes em Aplysia, tais como aqueles activados pelo ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazole-propiónico (AMPA) são normalmente inferida a partir de blocos de receptor de AMPA putativo (R) comportamentos relacionados por antagonistas Ampar aplicadas na preparação nervo reduzida, ao invés de diretamente gravado. Assim, a verificação da existência de certas correntes de falta. O isolamento em cultura de neurónios glutamatérgicos e metodologia de fixação de tensão de uma única célula constitui um teste directo para a existência dediferentes tipos de canais L-GluR neste modelo de organismo.
Outra utilização de Aplysia neurónios em experiências de patch clamp de célula única é em cascatas de dissecação segundo mensageiro. Aplysia neurónios são particularmente bem adequados para estudos de segundo mensageiro modulação induzida por serem estáveis por longos períodos de gravação, à temperatura ambiente de 3, 12, 20, 21 , e que são suficientemente robustas que as células individuais podem ser guardadas após a gravação e gravado a partir de novo após 24 horas 5. Estes conjuntos de neurônios sensoriais vestibulares e pleural convenientemente produzir um par de culturas combinadas de cada gânglio, de forma que um prato pode ser designada uma cultura de controle, enquanto seu companheiro recebe um tratamento.
Uma vantagem adicional desta preparação é em estudos sobre o estado morfológica de neurónios individuais. Por exemplo, descobrimos que os corpos celulares dos neurônios Aplysia de animais senescentes foram larger do que os de animais mais jovens, mas não especificou processos celulares após vários dias em cultura 6. Estas preparações neuronais isoladas também facilitar estudos utilizando corantes vitais para avaliar os níveis de Ca +2 intracelular, o pH, as espécies reactivas de oxigénio, o potencial de membrana mitocondrial e outras variáveis fisiológicas que podem então ser comparadas com as características neurofisiológicos de células individuais. Embora algumas destas abordagens são aplicáveis em preparações intactas ou de co-cultura, a recolha de dados é muito mais simples utilizando neurónios isolados neste sistema de cultura fácil. No futuro, esperamos usar essas células para um único perfil molecular da célula 13.
A cultura dissociada de curto prazo fornece o material ideal para a investigação de processos neurofisiológicos fundamentais, e pode proporcionar uma ferramenta poderosa especialmente quando utilizados em conjunto com os estudos envolvendo reduzida ou preparações de co-cultura. O dissociadaAplysia neurônio cultura estende-se a utilidade deste modelo animal venerável para novas e interessantes áreas da neurociência.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Financiado pelo NIH P40 OD010952, a Fundação Korein, da Universidade de Miami Fellowship para SLC e uma bolsa Maytag a ATK. Os autores agradecem o pessoal da Resource Nacional de Aplysia, assim como Lauren Simonitis e Hannah Peck, que forneceu micrografias para a figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
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References
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