Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen
Summary
De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.
Abstract
Fenantreen derivaten die als krachtige PARP1 remmers voorkomen de bifocale clustering van boventallige centrosomes in multi-centrosomal menselijke kankercellen in de mitose. De phenanthridine PJ-34 was de meest potente molecule. Ontclustering van extra-centrosomes veroorzaakt mitotische falen en celdood in multi-centrosomal cellen. Meest solide menselijke kankers hebben hoge voorkomen van extra-centrosomes. De activiteit van PJ-34 werd in real-time gedocumenteerd door confocale beeldvorming van levende menselijke borstkanker MDA-MB-231-cellen getransfecteerd met vectoren die coderen voor fluorescente γ-tubuline, dat veel voorkomt in de centrosomes en fluorescerende histone H2b aanwezig de chromosomen. Afwijkende chromosomen regelingen en de-geclusterde γ-tubuline foci die declustered centrosomes werden gedetecteerd in de getransfecteerde MDA-MB-231-cellen na behandeling met PJ-34. Un-geclusterde extra-centrosomes in de twee polen spindel voorafgegaan hun celdood. Deze resultaten gekoppeld for het eerst onlangs ontdekt exclusieve cytotoxische activiteit van PJ-34 in humane kankercellen met extra centrosomes de-clustering in mitose en mitotische storing die tot celdood. Volgens eerdere bevindingen waargenomen door confocale beeldvorming van vaste cellen, PJ-34 uitsluitend uitgeroeid kankercellen met multi-centrosomes zonder afbreuk normale cellen ondergaan mitose met twee centrosomes en bi-focale spindels. Deze cytotoxische activiteit van PJ-34 werd niet gedeeld door andere krachtige PARP1 remmers, en werd waargenomen in PARP1 deficiënte MEF herbergen extracentrosomes, suggereert haar onafhankelijkheid van PARP1 remming. Wonen confocale beeldvorming bood een nuttig instrument voor het identificeren van nieuwe moleculen uitroeien van cellen tijdens mitose.
Introduction
Fenantreen afgeleid PARP1 remmers, waaronder PJ-34, werden ontworpen om latente cellen van apoptotische celdood geïnduceerd door de energieverbruikende PARP1 gemedieerde DNA-reparatie onder stress-omstandigheden (beroerte of myocardinfarct) te beschermen 1. Echter, recent ontdekten we dat PJ-34, twee keer hogere concentratie dan dat inducerende PARP1 remming, kan uitsluitend leiden tot celdood in menselijke kankercellen 2,3. De snellere van de proliferatie van de cel was, hoe efficiënter de uitroeiing van de cellen was. De cytotoxische activiteit van de PJ-34 werd toegeschreven aan extra-centrosomes de-clustering in mitose 2. Veel menselijke kankercellen haven multicentrosomes 4,5. Incubatie van menselijke borstkankercellen MDA-MB-231, die boventallige centrosomen haven, met 20 uM PJ-34 efficiënt uitgeroeid deze cellen binnen 72-96 uur zonder afbreuk rustende cellen of een goedaardige delende cellen die twee centrosomes in mitose <sup> 2,3. Goedaardige cellen opgenomen menselijke mammaire epitheelcellen MCF-10, menselijke endotheelcellen (HUVEC) en primaire mesenchymale cellen bereid uit humane thymus. Deze cellen waren resistent voor de cytotoxische activiteit van PJ-34. PJ-34 niet bemoeien met hun celcyclus gedurende 96 uur incubatie of invloed op hun centrosomes en bi-focale spindel vorming van 2,3.
Bipolaire centrosome montage is cruciaal voor bipolaire vorming spil in mitose 4,5. Daarom hebben cellen met meer dan twee centrosomes een nauwelijks begrepen moleculaire mechanisme ontwikkeld clustering hun extra centrosomes tweepolig 4-9. Falen van een bipolaire assemblage van hun centrosomes kan multipolaire vervormde spindels en afwijkende chromosomen segregatie dat de arrestaties de cel-cyclus in de G2 / M arrestatie, en leidt tot celdood toegeschreven aan mitotische mislukking 4,5 veroorzaken. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan extra-centrosomes de-clustering worden intensief onderzocht <sup> 10. Inzicht in dit mechanisme dood zal exclusieve uitroeiing van kankercellen in staat stellen terwijl sparen gezonde weefsels 5,10.
Aldus verbindingen die mitotische catastrofe celdood activeren bieden een nieuwe manier van een selectieve kankertherapie, die efficiënt kan in een breed spectrum van menselijke vaste cancers.Our resultaten suggereren dat confocale beeldvorming kan worden gebruikt om moleculen die extra-centrosomes clustering worden geïdentificeerd mitose 2,3, waardoor deze verbindingen kanker targeting kandidaat-geneesmiddelen.
We hebben de cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 gedocumenteerd door het scannen van vaste en levende menselijke kankercellen (met een hoog voorkomen van extra-centrosomes in mitose) versus normale cellen. Een stapsgewijze beschrijving van de beeldvormende procedures voor de cytotoxische activiteit van PJ-34 in menselijke kankercellen te identificeren is hieronder opgenomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wonen confocale beeldvorming voorzien van een real-time documentatie van het cytotoxische effect van PJ-34 in levende multi-centrosomal cellen tijdens mitose (Figuur 3 en aanvullende informatie). Dit was de eerste levende documentatie toeschrijven de cytotoxiciteit van PJ-34 in menselijke kankercellen extra centrosomes de-clustering en celdood, suggereert inductie van mitotische catastrofe celdood door PJ-34 5-9. Daarentegen werd bifocale clustering van super-numerary centrosomes waargenomen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financieringsbronnen van dit onderzoek: een gezamenlijk fonds van de Universiteit van Tel Aviv overdracht van technologie bedrijf, RAMOT en het Sheba Medical Center (M. CA en SI.), ICRF – Israëlische Cancer Research Foundation (M. CA.) En Israel Science Foundation ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5′-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let’s huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
