Summary

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

Published: September 04, 2013
doi:

Summary

Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen.

Abstract

Nach Schlaganfall Mikroglia / Makrophagen (M / M) zu unterziehen schnelle Aktivierung mit dramatischen morphologischen und phänotypischen Veränderungen, die die Expression von neuen Oberflächenantigene und Produktion von Mediatoren, die aufbauen und pflegen die entzündliche Reaktion umfassen. Anzeichen dafür zeigt, dass M / M sind hochKunstStoffZellen, die klassischen pro-inflammatorische (M1) oder alternative anti-inflammatorische (M2)-Aktivierung nach akuter Hirnverletzung annehmen kann. Jedoch eine vollständige Charakterisierung von M / M Phänotyp Markerexpression, ihre Co-Lokalisation und zeitlichen Entwicklung im verletzten Gehirn fehlt noch.

Immunfluoreszenz-Protokolle spezifische Färbung relevanten Marker der M / M-Aktivierung kann in der ischämischen Gehirn durchgeführt werden. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept, um das Muster der Lokalisierung und der Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker wie untersuchenCD11b, CD68, YM1, im Mausmodell der fokalen Ischämie durch permanente Okklusion der mittleren Hirnarterie (pMCAO) induziert. Zweidimensionalen Analyse des verschmutzten Bereich zeigt, dass jede Markierung zu einem definierten M / M Morphologie zugeordnet wird und eine bestimmte Lokalisierung in der ischämischen Läsion. Muster der M / M-Phänotyp-Marker co-Expression kann durch dreidimensionale konfokale Bildgebung in den ischämischen Bereich zu beurteilen. Bilder können über einen definierten Volumen erfasst werden (10 um z-Achse und einer Schrittweite von 0,23 &mgr; m, was einer 180 x 135 x 10 um das Volumen) mit einer sequentiellen Abtastmodus um Durchbluten Effekte zu minimieren und überlappenden Wellenlängen zu vermeiden. Bilder werden dann verarbeitet, um dreidimensionale Darstellungen mittels Imaris Software zu erhalten. Festansicht des dreidimensionalen Renderings erlaubt die Definition von Markerexpression in Zellhaufen. Wir zeigen, daß M / M haben die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Phänotypen differenzieren, abhängig von der Position in der Läsion und timich nach der Verletzung.

Introduction

Nach einer akuten Hirnverletzung, sind Mikrogliazellen aktiviert und schnell unterziehen dramatische morphologische und phänotypische Veränderungen 3.1. Diese Eigen Antwort wird an die Einstellung von Blut geboren Makrophagen, die in das verletzte Gehirnparenchym 4,5 migrieren verbunden. Die Rolle der Mikroglia und Makrophagen, die antigen unterscheidbar sind nicht in Hirn-Trauma wird noch diskutiert (im Folgenden als M / M bezeichnet). Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass, ähnlich wie bei peripheren Makrophagen beschrieben, Mikroglia und Gehirn rekrutiert Makrophagen können verschiedene Phänotypen, deren Extrema entsprechen klassischen proinflammatorischen toxisch (M1) oder entzündungshemmende Schutz (M2) Phänotyp annehmen. Die verschiedenen Aktivierungszustände, einschließlich Sekretion von pro-oder anti-entzündliche Faktoren werden Freisetzung von neurotrophen Moleküle und lysosomale Aktivität von einem bestimmten Muster der phänotypischen Marker, deren Expression ist abhängig von der zeitlichen gekennzeichnetEntwicklung der umliegenden Umgebung. Die Charakterisierung dieser M / M Phänotypen im verletzten Gehirn ist immer noch spärlich. Wir haben ein gut etabliertes Mausmodell der pMCAo bis M / M-Expression und Evolution nach Schlaganfall analysieren. Immunfluoreszenz-basierte Protokolle hier vorge zielen auf immer Einblick in den Auftritt von spezifischen M / M-Phänotyp-Marker, deren Lokalisierung und zellulären Co-Expression in den ischämischen Bereich. Wir untersuchten, ein paar Moleküle zu unterschiedlichen Aktivierungszustand oder Phänotyp assoziiert, nämlich CD11b, ein Oberflächenmarker von Leukozyten und einer weit verbreiteten Markierung von M / M Aktivierung / Recruitment 8.6 ausgedrückt, CD68 ein Marker für Lysosomen 6,7 und YM1 eine sekretorische Protein durch alternativ aktiviert (M2) Makrophagen exprimiert und zur Erholung und Wiederherstellung 9-10 Funktion verbunden.

Wenn zwei Markierungen werden durch die gleiche Zelle, aber in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten exprimiert wird, kann Kolokalisation allein nicht viel informative. In diesem Fall kann die Analyse durch Coexpression mit einzelnen Draufsicht und von dreidimensionalen Renderings durchgeführt werden. Wir beschreiben ein Protokoll, um eine gründliche dreidimensionale Analyse von Marker-Co-Expression zu erhalten.

Protocol

1. Immunfluoreszenz Das folgende Protokoll wird koronalen Hirngefrierschnitten von Mäusen transkardial perfundiert (20 ml PBS, 0,1 mol / Liter, pH 7,4, gefolgt von 50 ml gekühltem Paraformaldehyd 4% in PBS) erhalten wurden. Nach Perfusion werden Gehirne vorsichtig abgenommen und in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C über Nacht zur Kryokonservierung übertragen. 45 ° C für 3 Minuten, bevor sie in Ampullen versiegelt und bei -70 ° C bis zur Verwendung gelagert – Die Gehirne werden dann schne…

Representative Results

Ein Beispiel der erhalten wird, wenn die Kennzeichnung Protokolle und konfokalen Nahmen sind in den ischämischen Bereich durch Ergebnisse ist in den 1A und 1B dargestellt. Eine zweidimensionale Ansicht der aufgenommenen Bilder zeigt, dass 24 Stunden nach der Ischämie (A), der lysosomalen Marker CD68 (grün) in hypertrophen amöboider CD11b-Zellen (rot) in der ischämischen Kern vorhanden ausgedrückt. In der Grenzzone (B) CD11b-positiven Zellen anzuze…

Discussion

Wir präsentieren hier Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept für Lokalisierung und Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker in den ischämischen Bereich (für eine detaillierte Analyse vgl. Rz 6) zu untersuchen. Dieses Verfahren vereint eine spezifische Färbung der entsprechenden Markierung der M / M-Aktivierung mit dreidimensionaler konfokaler Bildgebung. Die Feinabstimmung von Antikörpern, Serum und fluorconjugated Arbeits…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Stefano Fumagalli ist ein Fellow der Monzino Foundation.

Materials

Materials
Rat Anti-mouse CD11b Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68 AbD Serotec MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1 Stem Cell Technologies 1404
Hoechst 33342 Life technologies H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) CHEMICON MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody Jackson Immuno Research 112-065-143
TSA Cyanine 5 System Perkin Elmer NEL705A001KT
Prolong Gold Invitrogen P36930
Anti-rat alexa 546 Invitrogen A-11081
Anti mouse Alexa 488 Invitrogen A-21121
Anti-rabbit Alexa 594 Invitrogen A-11037
Normal Goat Serum Vectors Laboratories S-1000
Tritin X-100 Sigma T8787
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850 Leica
Olympus IX81 confocal microscope Olympus
AnalySIS software Olympus
Imaris software 5.0 Bitplane
Photoshop cs2 Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0 GraphPad Software Inc.

References

  1. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  2. Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
  3. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
  6. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
  7. Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
  8. Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
  9. Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
  10. Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
  11. Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
  12. Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).

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Cite This Article
Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury. J. Vis. Exp. (79), e50605, doi:10.3791/50605 (2013).

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