Isolering af humane hepatocytter ved en to-trins collagenaseperfusion Procedure
Summary
En modificeret totrins collagenaseperfusion procedure til isolering af humane hepatocytter beskrevet. Denne metode kan også anvendes til andre pattedyr lever. De isolerede hepatocytter fås i højt udbytte og levedygtighed, hvilket gør dem en passende model for videnskabelig forskning på områder såsom lever regeneration, farmakokinetik og toksikologi.
Abstract
Leveren, et organ med en ekstraordinær regenereringsevne, udfører en række funktioner, såsom afgiftning, metabolisme og homeostase. Som sådan hepatocytter er en vigtig model for en lang række forsknings spørgsmål. I særdeleshed er især vigtigt inden for farmakokinetik, toksikologi, lever regenerering og translationel forskning anvendelse af humane hepatocytter. Således er denne metode viser en modificeret version af en to-trins collagenaseperfusion procedure til at isolere hepatocytter som beskrevet af Seglen 1.
Tidligere har hepatocytter blevet isoleret ved hjælp af mekaniske metoder. Har imidlertid vist enzymatiske metoder at være overlegen hepatocyter bevarer deres strukturelle integritet og funktion, efter isolering. Denne metode præsenteres her tilpasser metode designet til tidligere til rottelevere til humane lever stykker og resultater i et stort udbytte af hepatocytter med en levedygtighed på 77 ± 10%. De vigtigsteforskel i denne procedure er den proces cannulization af blodkarrene. Endvidere kan den her beskrevne fremgangsmåde også anvendes til lever fra andre arter med sammenlignelige lever eller blodkar størrelser.
Introduction
En lever cellesuspension kan fremstilles ud fra leveren ved mekaniske eller enzymatiske metoder. Mekaniske metoder anvendes til at fremstille hele leverceller omfatter tvinger leveren gennem ostelærred 2, ryster en lever stykke med glasperler i en Kahn shaker 3 under anvendelse af glas homogenisatorer med løse pestles 4,5 osv. Gennem årene har mekaniske metoder faldet ud af favorisere på grund af skader på cellemembraner og tab af funktion af de isolerede hepatocytter 6,7. Derfor er anvendelsen af en enzymatisk metode er i øjeblikket den vigtigste metode til isolering af hepatocytter.
Isolering af hepatocytter ved hjælp af en enzymatisk metode blev stærkt forbedret, når Berry og Friend 8 perfunderet collagenase og hyaluronidase gennem leveren via portalen vene i rotter. Denne perfusion proces udnyttes vaskulaturen at tillade enzymerne at komme i tæt kontakt med de fleste af cellerne, hvilket fører tilen 6-dobling i udbyttet af hepatocytter 8. Endvidere er denne metode viste celler, der bevaret deres strukturelle integritet, med næsten ingen transformation af endoplasmatiske reticulum til isolerede vesikler og ingen mitochondriebeskadigelse 8.
Denne metode blev ændret ved Seglen 1, som banebrydende for en to-trins perfusion procedure for levercelle isolation. I denne procedure, er rottelever perfunderet med en Ca2 +-fri buffer efterfulgt af perfusion med en collagenase puffer indeholdende Ca 2 + 1. Fjernelsen af Ca 2 + i det første trin hjælper med at forstyrre desmosomer, mens tilsætning af Ca 2 + i det andet trin er nødvendigt for optimal collagenaseaktivitet 1,9.
Da den offentliggjorte arbejde beskrevet ovenfor, er blevet udført på rotter, denne artikel har til formål at demonstrere en modificeret procedure, der kan bruges til isolering af hepatocytter med høj levedygtighed fra brummenen lever. Brugen af humane hepatocytter fortsat vigtigt for translationel forskning og for validering af forsøg med dyremodeller. De humane lever stykker anvendt i denne undersøgelse blev erhvervet med samtykke til regeringsførelse gennem den humane væv og celler Research Foundation, en statskontrolleret almennyttig fond 10. Efter en patolog fjernet hvad der var nødvendige til diagnosticering, blev leveren stykker indsamlet fra det resterende væv. Vævet tømre ved patologen var morfologisk raske væv opnået fra resektionsmarginer efter leverresektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol resulterer i isolering af humane hepatocytter med høj levedygtighed og renhed. For at opnå disse resultater er det vigtigt at starte med en passende stykke af leveren. Det stykke leveren skal have intakt Glisson kapsel på alle overflader undtagen for 1 snitfladen. En anden vigtig faktor er bestemt parti collagenase anvendes som forskellige batches kan resultere i markante forskelle i levedygtighed af hepatocytter efter fordøjelse 11. Derfor bør forskellige partier af collagenase skal teste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev muliggjort af humane væv og celler Research Foundation, hvilket gør humane væv til rådighed for forskningen. Økonomisk støtte til dette arbejde blev modtaget fra Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (tilskud navn: Virtual Lever Network, tilskud nummer: 0.315.759) og Hepacult GmbH. Vores tak går også til de tekniske assistenter fra Grosshadern Hospital vævsbank til indsamling af leveren prøver og de tekniske assistenter fra Cell Isolation Core Facility for at udføre leveren perfusion og hepatocyt isolation. I særdeleshed vil vi gerne takke Natalja Löwen for at demonstrere denne procedure i videoen. Endelig vil vi gerne takke Natalja Löwen og Edeltraud Hanesch for at skabe de illustrationer til figur 1, og tallene i den skematisk oversigt over videoen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology–head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
