Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

كمي Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

الانضمام إلى العدلة البطانة تفعيلها في مواقع الإصابة هي جزء لا يتجزأ من استجابة المضيف للالتهابات. وصفها في هذا التقرير هو فحص ملزم العدلة التي تسمح لل

Abstract

البطانة الوعائية يلعب دورا أساسيا في استجابة التهابية. أثناء المرحلة الحادة من الالتهاب، ويتم تنشيط الخلايا البطانية (ECS) من خلال وسطاء المضيف أو مباشرة من قبل مكونات الميكروبية الحفظ أو جزيئات خطر المضيف المشتقة. المنشط ECS صريحة السيتوكينات، كيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تعمل على حشد وتفعيل والاحتفاظ الكريات البيض في موقع العدوى أو الإصابة. العدلات هي أول الكريات البيض للوصول، والتمسك البطانة من خلال مجموعة متنوعة من جزيئات الالتصاق موجودة على سطوح الخلايا على حد سواء. أهم وظائف العدلات هي للقضاء على تهديدات مباشرة الميكروبية، وتعزيز تجنيد الكريات البيض الأخرى من خلال الافراج عن عوامل إضافية، والشروع في إصلاح الجرح. ولذلك، تجنيدهم والتعلق البطانة هو خطوة حاسمة في الشروع في الاستجابة الالتهابية. في هذا التقرير، وصفنا في المختبر العدلة مقايسة التصاق باستخدامcalcein AM المسمى العدلات الإنسان الأساسية ل quantitate مدى الاوعية الدموية الدقيقة تنشيط الخلايا البطانية في ظل ظروف ثابتة. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن نفس العينات quantitated بواسطة القياس الطيفي مضان يمكن أيضا تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإجراء تقييم أكثر النوعي للملزمة العدلة.

Introduction

منذ بطانة الأوعية الدموية هي في اتصال مباشر مع الدورة الدموية، وهو يقع بشكل فريد لبدء الاستجابة الالتهابية السريع خلال العدوى أو الإصابة. الخلايا البطانية (ECS) مستقبلات التعرف على نمط صريحة تعترف مجموعة متنوعة من المكونات البكتيرية الحفظ والجزيئات خطر، ومستقبلات للوسطاء المضيف التهابات مثل TNFα. تفعيل هذه المستقبلات يؤدي إلى إفراز السيتوكينات ECS (مثل IL-6، IL-8، CXCL1 وCCL2)، وupregulate جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال E / ف selectin، VCAM-1 و ICAM-1) على سطح الخلية الخاصة بهم 1 ، 2. كل هذه الجزيئات تسهيل توطين الكريات البيض إلى مواقع الإصابة والإصابات من أجل مسح مجموعة من العوامل المعدية، والشروع في إصلاح الأنسجة 3،4. الاستجابة العدلة للإصابة ينطوي على تفاعل منسقة تنسيقا جيدا بين بطانة الأوعية الدموية والاستجابة العدلات. عند تفعيل EC، IL-8 ويفرز ويشكل التدرج داخل الأوعية الدموية على البطانة التي تسمح العدلات إلى الوطن الدخول إلى موقع العدوى أو الإصابة 5،6. E / P-selectins التوسط العدلة التقاط والمتداول من خلال الجمعيات ضعيفة نسبيا مع glycomolecules على سطح الخلية العدلة. هذه التفاعلات، جنبا إلى جنب مع IL-8 ملزم لمستقبلات لها وما شابه ذلك، وتيسير قوية، والتعلق إنتغرين بوساطة والاعتقال في نهاية المطاف من العدلات على سطح الخلية البطانية 7-10. بعد الاعتقال، يمكن العدلات تهاجر من الأوعية الدموية إلى مواقع محددة للعدوى للقضاء على مسببات الأمراض مباشرة، وتوليد الفخاخ خارج الخلية العدلات لمنع انتشار مسببات الأمراض، وتعزيز التئام الجروح والافراج عن العوامل الإضافية التي تجنيد الكريات البيض الأخرى مثل وحيدات، الضامة وشجيري الخلايا 11-17.

وصفها في هذا التقرير هو طريقة في المختبر ل quantitate التقيد العدلة لmicrovascular ECS بعد التنشيط من قبل المضيف الوسيط التهابات TNFα. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم تفعيل ECS، وليس العدلات. العدلات الإنسان الأساسية هي الأولى في عزل باستخدام الفصل المتدرج الكثافة، ومن ثم وصفت مع calcein acetoxymethyl (AM). الاسترات داخل الخلايا الحية يتحلل calcein صباحا إلى جزيء calcein نيون للغاية مع الإثارة من 492-495 نانومتر، والانبعاثات من 513-516 نانومتر 18. ثم يتم تحضين العدلات fluorescently المسمى مع الطبقات الوحيدة EC، وتتم إزالة العدلات غير ملتصقة في وقت لاحق. ثم يقاس مضان من تبقى من العدلات، متجهة باستخدام مقياس الطيف الضوئي مضان، وتحسب كنسبة مئوية من إجمالي المدخلات مضان العدلة لكل بئر. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن العدلات منضم calcein المسمى المستخدمة في القياس الطيفي يمكن تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإعطاء مزيد من نوعي تلا من EC ACtivation. منذ يتم تنفيذ هذا الاختبار في ظل ظروف ثابتة، وسوف يتم تقييم فقط الأحداث الأولي جدا التي تحدث في تتالي التصاق الخلايا المتعادلة. ويتأكد هذا في هذا التقرير باستخدام الأجسام المضادة حجب E-selectin لإظهار أن انضمام العدلة إلى المعالجة TNFα البشرية الرئة الاوعية الدموية الدقيقة EC (HMVEC والرئة) يتم تقليل الطبقات الوحيدة جذريا عندما تعطل التفاعل مع E-selectin.

بالإضافة إلى TNFα، وقد استخدمنا بنجاح هذا الاختبار لتحديد مدى الوريد EC تفعيل السري الإنسان (HUVEC) من قبل تول مثل مستقبلات 1/2 منبهات البروتين الدهني ببتيدوغليكان المصاحب (PAL)، murein البروتين الدهني (MLP) وPam3Cys و تفعيل HMVEC والرئة بواسطة Pam3Cys 19،20. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بنجاح هذا الاختبار مع مثبطات كيناز وبعد ضربة قاضية رني بوساطة من سطح البروتينات وحشوية في HMVEC والرئة، مما يوحي بأن هذه المنهجية هو متوافق مع مجموعة متنوعة من البيوكيميائية وscreeninز المقايسات 20. وباختصار، هذا الاختبار يوفر وسيلة سهلة الاستخدام، واستنساخه الطريقة، أكثر وظيفية للوصول إلى مدى تفعيل EC عن التهابات وسطاء في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الطلاء والصيانة من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

  1. ذوبان الجليد وتنمو الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الخاصة بك وفقا لتعليمات الشركات المصنعة الموردة. في هذا البروتوكول، ما نمت الخلايا في EGM-2 وسائل الإعلام MV (ونزا)، ويوصى بأن يتم تنفيذ جميع التجارب في غضون أسبوعين من ذوبان الجليد للحد من أي اختلاف بسبب عدد مرور. يتم تنفيذ تجاربنا مع HMVEC والرئة بين الممرات 4-9.
  2. يوم 1: عندما تصل خلايا 80-90٪ confluency، يعرض للتريبسين و resuspend في 120،000 الخلايا لكل مل. لوحة 36،000 الخلايا (0.3 مل) لكل بئر في 48 جيدا، البوليسترين نسيج لوحة الثقافة (ق). وتشمل الآبار من HMVEC أنه لن يتم تحضين مع العدلات من أجل الحصول على قراءة مضان الخلفية. إلا باستخدام لوحات 48 بئر صممت خصيصا لفحوصات مضان، الصفوف أو الأعمدة بالتناوب سوف لحد من أي تلوث ضوء من الآبار المجاورة. ملاحظة: يمكن أن يكون ويلز قبل المغلفة مع البولي lysiNE، أو الكولاجين فبرونيكتين.
  3. يوم 2: إضافة وسائل الإعلام الجديدة.
  4. يوم 3: بحلول مرحلة المجهر النقيض من ذلك، تأكيد الخلايا سليمة (أي "حصوه" مظهر والحطام الخلية قليلا)، وأنها هي متكدسة 100٪ (الشكل 1). إذا كانت الخلايا لم تكن 100٪ متموجة، تغيير وسائل الإعلام كل يوم حتى تصبح جاهزة.
  5. مرة واحدة في الطبقات الوحيدة HMVEC مستعدون لتلقي العلاج، وغسل خلايا مرة واحدة مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) وإضافة 0.3 مل من الطازجة وسائل الإعلام MV EGM-2 أو وسائل الإعلام التي تحتوي على ناهض التهابات إلى الآبار المناسب. في هذا البروتوكول تم علاج HMVEC والرئة مع TNFα [100 نانوغرام / مل] (PeproTech، نيو جيرسي) لمدة 3 ساعة منذ هذا هو المنشط وصفها جيدا من ECS 21. ملاحظة: من المستحسن أن لك الوقت تجربتك بحيث الخلايا HMVEC المنشط الخاص بك (الخطوة 4.1) وcalcein AM العدلات المسمى (الخطوة 3.5) جاهزة للاستخدام في نفس الوقت. كان يأخذنا ما يقرب من 2.5 ساعة إلى عزل وتسمية neutrophILS.

2. عزل العدلة باستخدام Polymorphprep

  1. عزل العدلات كما هو موضح سابقا 22، أو مع كثافة حل التدرج الجاهزة لعزل المحببة النوى من الدم الكامل. توظيف Polymorphprep بعد بروتوكول من قبل Nuzzi، وآخرون 2007 النتائج في غلة حوالي 2-3 × 10 6 العدلات لكل مل من الدم الكامل 23. ملاحظة: لتجنب الإفراط في تحلل كرات الدم الحمراء، والترسيب ديكستران لإزالة خلايا الدم الحمراء يمكن أداؤها قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي 24.
  2. جلب كثافة حل التدرج Polymorphprep إلى RT.
  3. جمع 30 مل من الدم الكامل من متطوعين من البشر صحي في وجود مضاد للتخثر مثل هيبارين، سيترات أو EDTA. يجب أن يتم استخدام الدم في غضون 2 ساعة، وأبقى بين 18-22 درجة مئوية.
  4. طبقة 5 مل من الدم الكامل أكثر من 5 مل من محلول التدرج الكثافة في أنبوب 15 مل المخروطية (
  5. الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 30 دقيقة في 18-22 درجة مئوية. تأكد لتسريع ببطء صعودا وهبوطا في أجهزة الطرد المركزي (أي إيقاف الفرامل أجهزة الطرد المركزي)، وتحقيق التوازن بين أنابيب جيدا لمنع الاهتزازات للمساعدة في خفض تفعيل العدلات ومنع اختلاط طبقات. سوف مرات الطرد المركزي لفترة أطول أو قوة الطرد المركزي العالي يؤدي إلى طبقة الكريات البيض أقل من ذلك، والذي يحتوي على العدلات، إلى الهجرة إلى مزيد من الانخفاض نحو لخلايا الدم الحمراء مكعبات.
  6. نضح في البلازما والكريات البيض الفرقة العلوية التي تحتوي على PBMCs لمنع التلوث من الطبقة التي تحتوي العدلات (الشكل 2B).
  7. استخدام الماصة المصلية 1-2 مل لإزالة الطبقة السفلى تحتوي على الكريات البيض العدلات. الجمع بين طبقات العدلة في 30 مل من برنامج تلفزيوني (من دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) في 50 ملأنبوب مخروطي الشكل.
  8. تبرزي حجم ما يصل الى 50 مل مع برنامج تلفزيوني (بدون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 18-22 درجة مئوية.

ملاحظة: الخطوات 2.9 و 2.10 اختيارية ولكن يوصى بشدة.

  1. نضح طاف. Resuspend والعدلات في 8 مل من الماء المعقم لمدة 30 ثانية إلى ليز خلايا الدم الحمراء، إضافة تعليق الخلية على الفور إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني 5X (دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وتخلط بلطف باليد. لا احتضان الخلايا في المياه لمدة أطول من 30 ثانية منذ يمكن أن يحدث الموت كبيرة العدلة.
  2. الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية.
  3. غسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (بدون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية.
  4. Resuspend والعدلات في 10 مل من RPMI-1640 (بدون أحمر الفينول) وعدد الخلايا الحية باستخدام التريبان بلوه صبغ طريقة الاستبعاد. تجنب فترات طويلة من كثافة الخلية أكبر من 5 × 10 6 لكل مل لأن هذا قد يؤدي إلى تفعيل العدلات.

3. العدلة وصفها مع Calcein AM

  1. وتستخدم 6 × 10 5 العدلات لكل بئر من لوحة 48 أيضا.
  2. بعد العد، ونقل الخلايا معلق إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويخفف من العدلات إلى 2-4 × 10 6 خلية لكل مل مع الفينول الحمراء الخالية RPMI-1640.
  3. إضافة calcein AM محلول المخزون إلى 3 ميكرومتر (أي 2.98 ميكرولتر من calcein AM الأوراق المالية (1 ملغ / مل) لكل مل من وسائل الإعلام)، ومزيج جيد من قبل بلطف عبها الأنبوب. أكبر من 5 ميكرومتر AM calcein سوف يؤدي إلى التسرب من العدلات ملاحظة: هو المشقوق غير الفلورسنت calcein AM داخل الخلايا عن طريق الاسترات الذاتية لإنتاج جزيء calcein نيون للغاية (وأي خلايا ميتة لا يتألق).
  4. تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضان جمعةأو 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام ملاحظة: قد يؤدي مرات حضانة أطول في أكثر calcein كونها تحررت من العدلات على مدى مقايسة التصاق.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية، وغسل العدلات 2X مع 10 مل من RPMI-1640 (بدون الفينول الأحمر؛ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية). بعد إعادة التعليق على خلايا لغسل الثاني، يمر أولا العدلات على الرغم من تصفية العقيمة 40 ميكرومتر لإزالة كتل ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 450 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية.
  6. Resuspend والعدلات في المتوسط ​​1640 (بدون الفينول الأحمر؛ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) في 2 × 10 6 العدلات لكل مل.

4. مقايسة الربط العدلة

  1. غسل الطبقات الوحيدة HMVEC 3x مع 0.5 مل من فلتر تعقيم (0.22 ميكرون) المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) التي تحتوي على 3٪ BSA لكل بئر.
  2. نضح في وسائل الاعلام وإضافة 6 × 10 5 العدلات calcein المسمى (0.3 مل من خلية suspensioن)، أو 0.3 مل من المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) دون العدلات، إلى الآبار المناسب من 48 لوحة جيدا ملاحظة: هذا هو ما يعادل 8 × 10 5 العدلات لكل سم 2.
  3. احتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  4. مجموع العدلات الإسفار (PRE غسل): قياس كثافة مضان من كل بئر مع الطول الموجي من 485 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 520 نانومتر (فلوريسئين مجموعة فلتر) في FLUOstar، أو ما يعادلها، مقياس الطيف الضوئي. تنفيذ هذه الخطوة قبل فقط إلى نقطة نهاية الحضانة ملاحظة: في هذا البروتوكول، وأجريت calcein الإثارة والكشف عن الضوء المنبعث من الجزء العلوي من الآبار المكشوفة، ولكن على حد سواء ويمكن أيضا أن يؤديها من الجزء السفلي من الآبار.
  5. غسل الآبار التي تحتوي على الطبقات الوحيدة HMVEC والعدلات 5X مع 0.5 مل لكل بئر من برنامج تلفزيوني (ث / كا 2 + والمغنيسيوم 2 +). إزالة وسائل الإعلام ويغسلبواسطة قلب اللوحة، والربت برفق على مناشف ورقية لإزالة السائل المتبقي.
  6. أضف إلى الوراء 0.3 مل من المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) لكل بئر.
  7. تمسكا العدلات الإسفار (POST غسل): قياس كثافة مضان من كل بئر كما في الخطوة 4.4.
  8. تحديد الالتزام والتقيد في المئة النسبية لكل بئر:

ملاحظة: في هذه المرحلة، والصور من العدلات calcein المسمى يمكن الحصول عليها باستخدام المجهر مضان قادرة مزودة بمرشحات فلوريسئين القياسية. تم الحصول على الصور في الشكل 4 على أوليمبوس IX51 مجهر مقلوب مجهزة 2000R كاميرا Retiga (Q التصوير) باستخدام Q-التقاط Pro7 البرمجيات (Q التصوير).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل الحصول على موثوقة، والنتائج استنساخه باستخدام مقايسة ملزمة العدلة، فمن الضروري أن صحة وconfluency من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة هي الأمثل في يوم الفحص، كما هو موضح مع HMVEC والرئة في الشكل 1. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من أن انخفاض مرور عدد الاوعية الدموية الدقيقة ECS تستخدم (أي أقل من 9 مقاطع)، وتبعا لذلك، نوصي تنفيذ جميع التجارب في غضون أسبوعين من الذوبان. صحة العدلات هو أيضا في غاية الأهمية، خصوصا منذ لن يتم استقلابه calcein صباحا حتى جزيء calcein الفلورسنت إذا وتتألف الخلايا في بعض الطريقة. ونحن نستخدم طريقة الاستبعاد التريبان الأزرق، وليس المضي قدما في فحص ما إذا كان نسبة كبيرة من الخلايا الميتة (أي الملون).

هناك عدة طرق لعزل العدلات، بما في ذلك التدرج الكثافة وطرق فصل العمود القائم على مستضد، وأي منهذه ينبغي أن يكون كافيا لهذا الإجراء. لقد اخترنا لاستخدام Polymorphprep الجاهزة كثافة حل التدرج من محور درع. كما يمكن أن يرى في الشكل 2، وPBMCs موجودة في الطبقة العليا، في حين أن العدلات ضمن الطبقة السفلى بعد الطرد المركزي. ويستنشق طبقة PBMC من أجل تجنب تلوث المحببة عند إزالتها. ومن المهم أن نلاحظ أن الخطوة 2.9، والذي يضاف الماء إلى ليز أي خلايا الدم الحمراء المتبقية، هو اختياري. ومع ذلك، في حين أنها مثالية لإزالة جميع الكريات الحمراء تلويث، فمن الأهمية بمكان أن العدلات لا تجلس في المياه النقية لأكثر من 30 ثانية وبعد ذلك يمكن أن يحدث الموت كبير.

وأخيرا، يتم تحضين العدلات مع calcein AM لمدة 30 دقيقة، وغسلها ومعلق في مرحلة ما قبل حرارة (37 درجة مئوية) RPMI-1640 وسائل الاعلام (دون الحمراء الفينول). من المهم أن استخدام وسائل الإعلام دون أحمر الفينول، التي يمكن أن تتداخل مع القراءة مضان. عدد neutrophils تضاف إلى الآبار هو إجراء تعسفي إلى حد ما، شريطة أن القراءات مضان قبل وبعد غسل هي ضمن مجموعة خطية من الطيف الضوئي، ويمكن للاختلافات بين العلاجات التي إما تعزيز أو منع الانضمام العدلة التأكد بتكاثر (انظر أدناه). نجد أن مضان OD 520m الطوق هو ضمن مجموعة خطية عندما يتم تحليل 10،000 إلى 1،000،000 العدلات المسمى (الشكل 3A). ومن المثير للاهتمام، نجد أيضا أن انضمام في المئة يزيد كما يتم إضافة المزيد من العدلات إلى الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة تعامل مع TNFa [100 نانوغرام / مل] لمدة 3 ساعة (الشكل 3B). لقد اخترنا لاحتضان HMVEC والرئة والعدلات calcein المسمى معا لمدة 20 دقيقة، لأننا نجد أن النسبة المئوية للالتصاق لا يزيد بشكل ملحوظ بعد هذه النقطة الزمنية (لا تظهر البيانات). من المذكرة، في هذا الاختبار استخدمنا معيار، البوليسترين واضح لوحات 48 جيدا ووجدت أن مستوى مضان قراءات عبر أكثر من بين رانه الآبار لم تصل إلى أكثر من 0.5٪ من إجمالي المدخلات مضان (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، فإننا نوصي باستخدام لوحات 48 بشكل جيد بها عمدا لقراءات مقياس الطيف الضوئي مضان للتجارب أكثر حساسية، إذا كانت متوفرة، أو على أقل تقدير، تصميم تجربة لتقليل عبر أكثر من قراءات (انظر الخطوة 1.2).

لإثبات أن عدد العدلات تضاف إلى الآبار هو إجراء تعسفي بدلا طالما أن عدد المضافة هي ضمن مجموعة خطية من الطيف الضوئي، أجرينا مقايسة التصاق الخلايا المتعادلة مع المعالجة TNFα-HMVEC والرئة في غياب أو حضور P38 -MAPK المانع BIRB7906، وذلك باستخدام كميات مختلفة من المدخلات العدلات (أي 40،000 / جيد، 200،000 / جيد أو 1،000،000 / جيد) 25. وقد أظهرت سابقا P38-MAPK ضروريا للتعبير E-selectin في المعالجة TNFα البشرية ECS، وبالتالي ينبغي تثبيط يخفض ملزم العدلة لTNFα تنشيط HMVEC والرئة26. في الواقع، وهذا ما نلاحظه (الشكل 3C). على الرغم من أننا نجد أن الالتزام في المئة يزيد كما يتم إضافة المزيد من العدلات، وقد يختلف الالتزام في المئة بين التجارب، وذلك بسبب عوامل مختلفة مثل الاختلافات بين الجهات المانحة، ونوعية من العدلات وكثافة HMVEC في التقاء، والالتزام النسبي بين الظروف تبقى ثابتة نسبيا في كل تجربة مستقلة بغض النظر عن عدد العدلات المضافة (الشكل 3C والبيانات لا تظهر). هذه البيانات تجسد أيضا لماذا فمن الأفضل لعرض البيانات التصاق كما بالنسبة إلى مراقبة إيجابية للاتساق بين التجريبية.

من أجل توضيح تماما كيف يعمل هذا الاختبار، أجرينا مقايسة التصاق الخلايا المتعادلة مع المعالجة TNFα-HMVEC والرئة قبل حضنت مع الأجسام المضادة إما السيطرة أو الأجسام المضادة عرقلة-E selectin. وأعرب E-selectin على سطح EC بعد العلاج مع TNFa ويلتقط neutrophils من الأوعية الدموية عن طريق التفاعلات الكهربائي مع glycomolecules موجودة على سطح الخلايا المتعادلة 1،27. كما هو مبين في الشكل 4A عدديا، بيانيا في الشكل 4B وبصريا في الشكل 4C، والمعالجة TNFα-HMVEC والرئة قبل حضنت مع الأجسام المضادة E-selectin ملزمة ~ 75٪ أقل العدلات من المعالجة TNFα-HMVEC والرئة قبل المحتضنة مع مراقبة مفتش الحكومة. وهذا يوحي E-selectin يلعب دورا هاما في الربط العدلات إلى HMVEC والرئة في لدينا فحص التصاق ثابت.

الشكل 1
الشكل 1. مثال صحي، متموجة الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة. لاحظ "حصوه" مظهر ومجموع confluency من الطبقات الوحيدة. وقد أخذت صور في التكبير 4X و 10x على فيشر العلمية Micromaster مجهر رقمي مقلوب. الشكل 2
الشكل 2. الدم الكامل وPolymorphprep الطبقات قبل الطرد المركزي (A) وانفصلا بعد الطرد المركزي (B). ملاحظة أنه بعد الطرد المركزي، وPBMCs تشكيل الشريط العلوي متميزة، في حين أن المحببة النوى (العدلات) تشكيل الفرقة أقل متميزة.

الشكل (3)
الشكل (3). العلاقة بين عدد العدلات ومضان OD 520m الطوق بشكل طولي؛ تضاف التصاق في المئة من العدلات إلى المعالجة TNFα-الزيادات HMVEC والرئة وأكثر العدلات؛ P38-MAPK يعزز الالتزام العدلة لTNFα تنشيط الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة (A) رسم بياني. تصور لينياالعلاقة بين R مضان OD 520m الطوق وأرقام العدلات أكثر من أوامر من حجمها. قيمة R2 من 0.996 يشير إلى وجود علاقة خطية بين عدد العدلات ومضان OD 520m الطوق عندما يتم تحليل 10،000 إلى 1،000،000 العدلات. (B) تمثيل رسومي للالتزام في المئة عندما تم إضافة أعداد متفاوتة من العدلات calcein المسمى إلى غير المعالجة أو المعالجة TNFα-( 100 نانوغرام / مل، 3 ساعة) الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة في لوحات 48 بئر (C) الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة تم مسبقا حضنت مع P38-MAPK المانع BIRB796 (10 ملي) (أكسون Medchem) أو DMSO (مراقبة) لل 1 ساعة قبل TNFa (100 نانوغرام / مل) علاج لمدة 3 ساعة أثناء وجودها المستمر من BIRB796 (10 ملم). تم احتساب الالتزام النسبي كما في الخطوة 4.8. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD. وقد استخدم GraphPad بريزم المفردة اختبار t للتحليل الإحصائي (ن = 3) (المعالجة TNFα مقابل TNFα المعالجة بالإضافة إلى BIRB796). ف قيمة ** <0.01؛ *** و# 60؛. 0.001 انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4. E-selectin يعزز التزام العدلات إلى TNFa المعاملة HMVEC والرئة، وعولجوا HMVEC والرئة مع TNFα [100 نانوغرام / مل] لمدة 3 ساعة. بعد غسل HMVEC والرئة مع المتوسط ​​1640 تحتوي على 3٪ BSA (الخطوة 4.1)، إما الأغنام مفتش [50 ميكروغرام / مل] (5-001-A؛ أنظمة R & D) أو الأجسام المضادة بولكلونل E-selectin (PAB) [50 ملغ / مل] (AF724؛ أنظمة R & D) تمت إضافتها إلى الآبار المناسب لمدة 20 دقيقة. ثم تم غسلها الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة مرة أخرى مع RPMI-1640 قبل تم إضافة 6 × 10 5 العدلات لكل بئر لمدة 20 دقيقة إضافية. (A) وتظهر حسابات لتحديد بالمئة والالتزام النسبي. Calceinيتم قياس انبعاث الضوء في OD 520 نانومتر. مشتق خلفية OD 520m الطوق متوسط ​​من HMVEC والرئة في غياب العلاج TNFα والعدلات. (B) التمثيل البياني للانضمام النسبي في المئة من العدلات calcein المسمى إلى غير المعالجة أو المعالجة TNFα-الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة بعد ما قبل الحضانة مع إما السيطرة مفتش أو E-selectin حجب PAB. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD. وقد استخدم GraphPad بريزم المفردة اختبار t للتحليل الإحصائي (ن = 3). كان ف قيمة محسوبة <0.001. (C) الصور من العدلات calcein المسمى بد أن الطبقات الوحيدة HMVEC والرئة غير المعالجة والمعالجة TNFα-مسبقا حضنت مع مفتش إما السيطرة أو PAB E-selectin. ويرد مثال جيد تحتوي على 6 × 10 5 العدلات قبل الغسيل مع برنامج تلفزيوني (غسل PRE). يتم عرض الصور الشفافة المجهر الضوئي في العمود الأيمن، بينما الصور مضان من نفس الحقل المرجعي، باستخدام فلتر فلوريسئينمجموعة، وتظهر في العمود الأيسر. وقد أخذت صور في التكبير 10X على أوليمبوس IX51 مجهر مقلوب مجهزة بكاميرا 2000R Retiga (Q التصوير). PRE غسل = مجموع العدلات مضان OD 520m الطوق (الخطوة 4.4)، ووظيفة وغسل = ملتصقة العدلة مضان OD 520m الطوق (الخطوة 4.7)؛ PMN - المحببة النوى؛ المتوسط ​​- المتوسط؛ مفتش - مفتش مراقبة الأغنام؛ E-sel/α-E-selectin - E-selectin حجب PAB. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أهم الخطوات الحاسمة لنجاح العدلة / الاوعية الدموية الدقيقة البطانية خلية مقايسة التصاق هي: 1) استخدام منخفض عدد مرور (<9)، والخلايا البطانية صحية؛ 2) الحفاظ على العدلات معزولة في مناطق ذات كثافة منخفضة (أي <5 × 10 6 خلايا / مل)، واستخدامها في غضون ساعتين من العزلة، و 3) غسل الحساسية من calcein العدلات AM-صفت واستخدام calcein العدلات AM المسمى في الوقت المناسب للحد من التلوث EC وفقدان calcein من العدلات، على التوالي .

نضيف 8 × 10 5 العدلات لكل سم 2 من زراعة الأنسجة بشكل جيد مساحة السطح (أي 600،000 العدلات لكل بئر من لوحة 48 أيضا). نجد أن مدخلا من 600،000 العدلات ضمن مجموعة خطية من مقياس الطيف الضوئي لدينا، ويستنسخ بشكل موثوق البيانات عندما يتم قياس الانضمام النسبية. ومع ذلك، لوحظ انخفاض مماثل جدا في العدلات ملزمة فيP38-MAPK مقايسة تثبيط (الشكل 3C) عندما تضاف 40،000، 200،000 1،000،000 أو العدلات لكل بئر، مما يشير إلى أن أقل من 600،000 العدلات يمكن استخدامها.

بروتوكول الموصوفة هنا فقط بتقييم مدى تفعيل البطانية منذ العدلات لا مسبقا تنشيط أنفسهم، أو تعامل بأي شكل من الأشكال، والذي هو بالطبع خيار إذا مقايسة معينة تتطلب ذلك. وتبين لنا أن التعبير عن E-selectin على المعاملة TNFa HMVEC والرئة المهم بالنسبة للمرفق من العدلات في هذا الاختبار، بما يتفق مع الملاحظات السابقة 27. الربط الكهربائي من E-selectin إلى glycomolecules موجودة على سطح الخلايا المتعادلة ضعيفة نسبيا، ولكن تحت ظروف التدفق، ويعتقد أن هذه التفاعلات للحث على ارتفاع تقارب مرفقات إنتغرين بوساطة بين العدلات وECS 1،7-10. لذلك، قد يكون هذا الفحص أكثر دلالة من الخطوات الأولي في الالتهاب الذي عه اللازمة للقبض على العدلات من الأوعية الدموية. ومع ذلك، فإننا التحقق من أن النتائج التي تم الحصول عليها لدينا مع TNFα في هذا التقرير كانت مشابهة للغاية، إن لم تكن متطابقة، لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام وحدة التدفق (لا تظهر البيانات)، مما يدل على نتائج هذا الاختبار ثابت هي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ويشير إلى أن هذا الاختبار هو مفيدة بشكل خاص للباحثين أن لم يكن لديك الوصول إلى نظام التدفق.

وقد وصفت أشكال مختلفة من الفحص وصفها، وذلك باستخدام calcein كما fluorophore كشف، أول في عام 1993 28،29. الأهم من ذلك، وجدت هذه التقارير الأولية أن calcein لم يؤثر بقاء الخلية، وكان أقل تأثير على وظيفة الخلية في المقايسات التصاق بالمقارنة مع غيرها من الأصباغ فلوريسئين المستمدة 29،30. وأفيد أيضا أن عدد الخلايا غير الخطية فيما يتعلق كثافة الفلورسنت، بما يتفق مع ما نلاحظه (الشكل 3A) 28. أبرزت التقارير الأولية أيضا أنالميزة الرئيسية لفحوصات فلوروميتريك هو أنها لا تتطلب radiolabeling (مثل 111 أو 51 ساعة معتمدة في) من الكريات البيض النقية 31-33. وقد مزايا والاتساق في استخدام الخلايا calcein AM-صفت على الخلايا رديولبلد مناقشة مستفيضة من قبل 28،29،34. على الرغم من أننا استخدام calcein صباحا إلى تسمية العدلات في المقايسات لدينا، العديد من الأصباغ نفيذ الخلية الأخرى التي هي ركائز استريز المتاحة. على سبيل المثال، تقنيات الحياة تبيع CellTrace calcein الأحمر والبرتقالي (C34852)، calcein البنفسجي (C34858) وcalcein الأزرق (C34853) التي تثير / تنبعث منها في مختلف الأطوال الموجية. الأصباغ المختلفة لكل منها مزاياها وعيوبها. على سبيل المثال، calcein الأحمر والبرتقالي AM صبغ لديه بعض مضان الجوهرية قبل التحلل 18.

نحن نستخدم هذا الأسلوب لدراسة تفعيل التهاب البطانة استجابة لعوامل البكتيرية والذاتية (مثل TNFa)، والرابعةلنا استخدام HMVECs تم جمعها من الجثث، والتي يمكن توسيعها بكميات كافية للقيام مقايسة مع الضوابط المناسبة ويعيد كافية لتنفيذ التحليلات الإحصائية. تصور، ويمكن أيضا أن هذا الاختبار يمكن استخدامها كأداة لدراسة عمليات المرض القائم على البطانية التي تنطوي ملزم الكريات البيض إلى بطانة الاوعية الدموية الدقيقة. أمثلة من الاضطرابات التي يمكن دراستها باستخدام HMVECs من المرضى تشمل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، تعفن الدم، ومرض التهاب الأمعاء، vasculitides، مثل الأجسام المضادة السيتوبلازمية المضادة للالعدلة (ANCA) المرتبطة vasculitides، والدماغ التشوهات الوعائية 35-40 . على سبيل المثال، يمكن جمع HMVECs من البشر مع vasculitides أو تعفن الدم بعد الوفاة، أو يحتمل أن تكون من المرضى الذين يعانون من مرض العمليات القائمة على البطانية التي خضعت لخزعة أو استئصال جراحي للجهاز، وتجليدها إلى العدلات المقررة في ظل ظروف مختلفة. ومع ذلك، هذا الاختبار يتطلب كافيةيتم توسيع كميات من HMVECs لتشكيل الطبقات الوحيدة متموجة، وبالتالي HMVECs وتستخدم بعد مقاطع متعددة. هذه عملية التوسع قد يؤدي إلى تغييرات المظهري في ECS، التي تحتاج إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار في تصميم الدراسات التي تستخدم ECS الأولية من المرضى الذين يعانون من أمراض المستندة إلى EC. ومع ذلك، فإن براعة هذا الاختبار يسمح لها أن تتكيف مع أنواع أخرى عديدة الخلايا الملتصقة والكريات البيض. في الواقع، هذا الاختبار، أو المتغيرات من ذلك، وقد استخدمت بنجاح مع غيرها من أنواع الخلايا البطانية، والخلايا الأساسية وخطوط الخلايا مثل وحيدات، THP-1، Jurkat، HL-60 و U937 28،31،41. وقد أثبت هذا الاختبار أن تكون سريعة وسهلة لأداء، واستنساخه وحساسة للغاية، وبالتالي فهي أداة مفيدة جدا للكشف عن تنشيط الخلايا البطانية وسطاء التهابات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل وزارة UCSF الرعاية تخدير والمحيطة بالجراحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Tags

علم المناعة، العدد 78، علم الأحياء الخلوي، والعدوى، علم الأحياء الجزيئية والطب والهندسة الطبية الحيوية، الفيزياء الحيوية، بطانة الاوعية، الأوعية الدموية، والعدلات، والالتهابات، وسطاء الالتهاب، والعدلات، التصاق الكريات البيض، والخلايا البطانية، مقايسة
كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, … More

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter