Kvantitativ<em> In vitro</em> Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden
Summary
Neutrofil anslutning till aktiverat endotel vid ställen för infektion är en integrerad del av värdens inflammatoriska svar. Beskrivs i denna rapport är en neutrofil bindningsanalys som möjliggör<em> In vitro</em> Kvantifiering av primär human neutrofil bindning till endotelceller aktiverade av inflammatoriska mediatorer under statiska förhållanden.
Abstract
Den vaskulära endotelet spelar en integrerad del i det inflammatoriska svaret. Under den akuta fasen av inflammation, är endotelceller (EC) aktiveras av värdens medlare eller direkt av konserverade mikrobiella komponenter eller värdhärledda molekyler fara. Aktiverat ECS uttryckliga cytokiner, kemokiner och adhesionsmolekyler som mobiliserar, aktivera och behålla leukocyter vid platsen för infektion eller skada. Neutrofiler är de första leukocyter att komma fram, och hålla sig till endotelet genom olika adhesionsmolekyler närvarande på ytorna av båda cellerna. De viktigaste funktionerna i neutrofiler är att direkt eliminera mikrobiella hot, främja rekrytering av andra leukocyter genom frisättning av ytterligare faktorer, och initiera sårläkning. Därför är deras rekrytering och fastsättning till endotelet ett kritiskt steg vid initieringen av det inflammatoriska svaret. I denna rapport beskriver vi en in vitro neutrofiladhesion analysen medkalcein AM-märkta primära humana neutrofiler för att kvantifiera omfattningen av mikrokärlendotelcell aktivering under statiska förhållanden. Denna metod har den ytterligare fördelen att samma prover kvantifierades genom fluorescens spektrofotometri också kan visualiseras direkt med användning av fluorescensmikroskopi för en mer kvalitativ bedömning av neutrofil bindning.
Introduction
Eftersom det vaskulära endotelet är i direkt kontakt med det cirkulerande blodet, är den unikt beläget för att initiera en snabb inflammatoriskt svar under infektion eller skada. Endotelceller (EC) uttryckliga mönster receptorer erkännande som känner igen en mängd bevarade bakteriella komponenter och molekyler fara, och receptorer för värdens inflammatoriska mediatorer, såsom TNF. Aktivering av dessa receptorer leder EC att utsöndra cytokiner (t.ex. IL-6, IL-8, CXCL1 och CCL2), och att uppreglera adhesionsmolekyler (t ex E / P-selektin, VCAM-1 och ICAM-1) vid sin cellyta en , 2. Dessa molekyler underlättar alla lokaliseringen av leukocyter till ställen för infektion och skada för att rensa värden av smittämnen och initiera vävnadsreparation 3,4. Neutrofilsvaret till infektion innebär en väl samordnad samspelet mellan det vaskulära endotelet och svara neutrofiler. Vid EG-aktivering, IL-8 utsöndras och bildar en intravaskulär gradient på endotel som tillåter neutrofiler till hem till platsen av infektion eller skada 5,6. E / P-selektiner medlar neutrofila fånga och rulla genom relativt svaga samband med glycomolecules på neutrofila cellytan. Dessa interaktioner, tillsammans med IL-8-bindning till dess besläktade receptorer, underlätta robusta, integrin-medierad fastsättning och eventuell häktning av neutrofiler på endotelceller ytan 7-10. Efter gripandet kan neutrofiler migrera ut ur kärlen till de specifika smitthärdarna att direkt eliminera patogener, generera neutrofila extracellulära fällor för att förhindra spridning av patogener, främja sårläkning och släpper ytterligare faktorer som rekryterar andra leukocyter såsom monocyter, makrofager och dendritiska celler 11-17.
Beskrivs i denna rapport är en in vitro-metod för att kvantifiera neutrofil vidhäftning till microvascular ECS efter aktivering av värdens inflammatoriska medlare TNFa. Denna analys är avsedd att bedöma aktivering av ECS och inte neutrofiler. Primära humana neutrofiler är först isoleras med separation densitetsgradient, och märks sedan med kalcein acetoximetyl (AM). Esteraser inom levande celler hydrolyserar calcein AM till den mycket fluorescerande kalcein molekyl med en excitation av 492 till 495 nm och emission av 513-516 nm 18. De fluorescensmärkta neutrofiler inkuberas sedan med EG monoskikt, och icke vidhäftande neutrofiler avlägsnas därefter. Fluorescensen hos de återstående, bundna neutrofiler mäts sedan med användning av en fluorescensspektrofotometer, och beräknas som en procent av den totala neutrofil fluorescens inmatning per brunn. Denna metod har den ytterligare fördelen att de bundna calcein-märkta neutrofiler används i spektrofotometri direkt kan visualiseras med fluorescens mikroskopi för att ge en mer kvalitativ utläses av EG acmotivation. Eftersom denna analys utförs under statiska förhållanden, kommer bara de allra första händelser som inträffar i neutrofiladhesion kaskad bedömas. Detta bekräftas i denna rapport med hjälp av E-selektin blockerande antikroppar för att visa att neutrofila vidhäftning till TNF-behandlad human lunga mikrovaskulära EC (HMVEC-Lung) monolager minskar drastiskt när interaktionen med E-selektin störs.
Förutom TNFa, har vi använt framgångsrikt denna analys för att fastställa omfattningen av mänsklig navelven EG (HUVEC) aktivering genom den Toll-like receptor halv agonister peptidoglykan-associerat lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) och Pam3Cys och HMVEC-Lung aktivering av Pam3Cys 19,20. Dessutom använde vi framgångsrikt denna analys med kinaseinhibitors och efter RNAi-medierad knockdown av ytan och cytoplasmaproteiner i HMVEC-Lung, vilket tyder på att denna metod är förenlig med en rad biokemiska och screening analyser 20. Sammanfattningsvis ger denna analys en lättanvänd, reproducerbar, mer funktionellt sätt att komma åt omfattningen av EG aktivering av inflammatoriska mediatorer in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska stegen för en lyckad neutrofiler / mikrokärlendotelcell adhesionsanalys är: 1) Användning av låg passage nummer (<9), friska endotelceller, 2) upprätthålla de isolerade neutrofiler vid en låg densitet (dvs. <5 x 10 6 celler / ml) och använder dem inom två timmar av isolering, och 3) Fastidious tvättning av Calcein AM-märkta neutrofiler och användning av Calcein AM-märkta neutrofiler i god tid för att minimera EG kontaminering och förlust av kalcein från neutrof…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av UCSF Institutionen för anestesi och perioperativ vård.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
